劉永剛 楊云帆 唐 妍 徐建潔 劉 冰

(1. 西南科技大學(xué)分析測(cè)試中心 四川綿陽(yáng) 621010； 2. 西南科技大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院 四川綿陽(yáng) 621010； 3. 國(guó)民核生化災(zāi)害防護(hù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 北京 102205)

隨著我國(guó)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，城市人口越來(lái)越密集，以投放生物化學(xué)毒劑為主的恐怖襲擊將成為社會(huì)穩(wěn)定和經(jīng)濟(jì)發(fā)展的巨大隱患[1]。因此，從理論上研究毒劑分子結(jié)構(gòu)和發(fā)展生化毒劑檢測(cè)技術(shù)成為重大事故后果分析的重要內(nèi)容。定性地描述一個(gè)可能發(fā)生或正在發(fā)生的重大化學(xué)事故對(duì)人員和環(huán)境造成危害的程度，預(yù)測(cè)和評(píng)估危害后果，對(duì)突發(fā)危害性公共衛(wèi)生事件的應(yīng)急處置具有重要意義。

由分子光譜特性可知，不同的物質(zhì)有不同的能級(jí)軌道，有其特定的精細(xì)結(jié)構(gòu)，其表現(xiàn)出來(lái)的光譜性質(zhì)是不同的，因此可利用分子光譜的特性來(lái)對(duì)物質(zhì)進(jìn)行甄別和鑒別，從而進(jìn)行定性定量分析，故分子光譜亦稱為“指紋性光譜”。采用光譜學(xué)檢測(cè)方法檢測(cè)危險(xiǎn)化學(xué)品具有采樣靈活、樣品無(wú)需前處理、分析速度快、甚至可以原位檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。這些特點(diǎn)使光譜法在檢測(cè)技術(shù)中占有重要地位，成為一種應(yīng)用最廣泛的方法[2]。紅外光譜具有“靈敏度高”“指紋性強(qiáng)”“原位測(cè)定”等優(yōu)點(diǎn)，在分析復(fù)雜化學(xué)物質(zhì)組成及結(jié)構(gòu)信息等方面有著廣泛的應(yīng)用，特別是利用“紅外遙感”來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)大氣環(huán)境污染、無(wú)人區(qū)油氣田泄露等方面表現(xiàn)出紅外光譜技術(shù)的優(yōu)越性，可對(duì)有毒有害物質(zhì)進(jìn)行“指認(rèn)”[3-5]。隨著紅外光譜技術(shù)的發(fā)展，該技術(shù)在光譜學(xué)界越來(lái)越受到重視。

生物體系的毒劑由于其龐大且復(fù)雜的結(jié)構(gòu)信息，僅通過(guò)實(shí)驗(yàn)測(cè)定其光譜容易忽略一些重要的結(jié)構(gòu)信息，計(jì)算模擬是對(duì)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)方法的一種補(bǔ)充，能夠了解一些通過(guò)傳統(tǒng)實(shí)驗(yàn)手段不能得到的信息[6-8]。量子化學(xué)計(jì)算方法是在量子力學(xué)基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的與量子化學(xué)相關(guān)的計(jì)算方法[9-11]。隨著計(jì)算理論和計(jì)算機(jī)技術(shù)的不斷發(fā)展，計(jì)算模擬在光譜模擬分析領(lǐng)域的精確度越來(lái)越高，應(yīng)用范圍也越來(lái)越廣，已經(jīng)成為一種非常重要的研究光譜產(chǎn)生機(jī)理的方法[12]。

本文以葡萄球菌腸毒素蛋白為研究對(duì)象，通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)計(jì)算方法模擬該蛋白在不同溫度條件下的動(dòng)態(tài)過(guò)程，并通過(guò)傅里葉變換方法建立大體系毒素分子的紅外光譜計(jì)算模型，模擬得到葡萄球菌腸毒素的紅外光譜，并分析其振動(dòng)光譜與溫度之間的關(guān)系。

1 模型構(gòu)建和模擬方法

分子動(dòng)力學(xué)模擬計(jì)算充當(dāng)了微觀長(zhǎng)度、時(shí)間尺度和宏觀世界之間的橋梁(見(jiàn)圖1)，根據(jù)分子間相互作用提出假設(shè)，預(yù)測(cè)分子的“真實(shí)”綜合特性。在分子動(dòng)力學(xué)模擬過(guò)程中可以根據(jù)“實(shí)際意想”的環(huán)境調(diào)整系統(tǒng)性質(zhì)的準(zhǔn)確性，此預(yù)測(cè)具有一定的“真實(shí)”性。模擬仿真方法也充當(dāng)理論與實(shí)驗(yàn)之間的橋梁。通過(guò)使用相同的模型進(jìn)行模擬，可以測(cè)試?yán)碚摰恼_性，還可以模擬在實(shí)驗(yàn)室中難以執(zhí)行或無(wú)法執(zhí)行的實(shí)驗(yàn)(例如，需要在極端溫度或壓力下完成的實(shí)驗(yàn))[13-15]。對(duì)于大體系物質(zhì)葡萄球菌毒素可采用分子動(dòng)力學(xué)方法計(jì)算能量與時(shí)間的關(guān)系，并利用傅里葉變換得到紅外光譜[16-17]。

葡萄球菌腸毒素 B 蛋白的初始構(gòu)象取自蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)(PDB號(hào)為3SEB)[18],該結(jié)構(gòu)共有 238 個(gè)氨基酸，使用 Discovery Studio 軟件補(bǔ)充氫原子后共有3 921個(gè)原子。通過(guò)添加合適的水分子和其他離子來(lái)保證整個(gè)系統(tǒng)穩(wěn)定且為電中性。在分子動(dòng)力學(xué)模擬的整個(gè)過(guò)程中，僅記錄目標(biāo)蛋白的運(yùn)動(dòng)和受力等信息，系統(tǒng)內(nèi)添加的水分子和其他離子用于維持系統(tǒng)的穩(wěn)定和目標(biāo)蛋白的穩(wěn)定構(gòu)型，不會(huì)對(duì)計(jì)算目標(biāo)蛋白的紅外光譜產(chǎn)生影響。對(duì)葡萄球菌腸毒素 B 蛋白系統(tǒng)采用Charmm 36 m力場(chǎng)的方法，共有66 080個(gè)原子，系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如圖 1 所示。

圖1 葡萄球菌腸毒素模型示意圖Fig.1 Schematic diagram of the staphylococcal enterotoxin model

對(duì)于分子動(dòng)力學(xué)運(yùn)動(dòng)的計(jì)算，在給出所有的原子坐標(biāo)ri和勢(shì)能函數(shù)U(rN)的情況下，接下來(lái)要做的是計(jì)算原子力fi，其定義式為：

(1)

首先通過(guò)能量最小化進(jìn)行結(jié)構(gòu)弛豫以保證葡萄球菌腸毒素B系統(tǒng)里面沒(méi)有立體幾何沖突或不當(dāng)，在能量最小化的過(guò)程中采用最陡下降法(steep)進(jìn)行5 000步能量?jī)?yōu)化，對(duì)于氫鍵位置使用 Lincs 方法進(jìn)行約束。通過(guò)Nosw-Hoover的熱浴方法進(jìn)行NVT(NVT為正則系綜簡(jiǎn)寫，表示具有確定的粒子數(shù)(N)、體積(V)、溫度(T))系綜 125 ps 模擬，將體系溫度分別設(shè)定在254，264，274，299和314 K，模擬穩(wěn)定系統(tǒng)的溫度，在每個(gè)穩(wěn)定的溫度下均進(jìn)行 125 ps 的分子動(dòng)力學(xué)模擬。此時(shí)通過(guò)Parrinello-Rahman耦合的方法將系統(tǒng)的壓強(qiáng)穩(wěn)定在1.05×105Pa，還需要在NPT(NPT為等溫等壓系綜簡(jiǎn)寫，表示具有確定的粒子數(shù)(N)、壓強(qiáng)(P)、溫度(T))條件下進(jìn)行模擬穩(wěn)定系統(tǒng)的壓強(qiáng)，模擬時(shí)長(zhǎng)為125 ps， 將系統(tǒng)的壓強(qiáng)穩(wěn)定在1.05×105Pa。隨著兩個(gè)平衡階段的完成，系統(tǒng)現(xiàn)在已經(jīng)處于目標(biāo)溫度和壓強(qiáng)下，再進(jìn)行時(shí)長(zhǎng)為 1 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬(MD)，模擬步長(zhǎng)為 2 fs，每隔 0.2 ps 記錄一次數(shù)據(jù)(坐標(biāo)、能量、力和速度)。

記錄根據(jù)時(shí)間變化的總偶極矩信號(hào)，做自相關(guān)函數(shù)，然后做傅里葉變換，得到紅外光譜。公式為：

I(ω)n(ω)=量子校正系數(shù)×

(8)

式中：I(ω)為吸收強(qiáng)度；ω為頻率；M為體系的總偶極矩；〈M(t)·M(0)〉是體系總偶極矩的自相關(guān)函數(shù)；n(ω)是折射率。

2 結(jié)果與討論

對(duì)目標(biāo)蛋白能量最小化后，將系統(tǒng)的溫度設(shè)定到各目標(biāo)溫度并維持穩(wěn)定。在最終 1 ns 的分子動(dòng)力學(xué)模擬中，監(jiān)測(cè)各溫度下系統(tǒng)的多種參數(shù)，結(jié)果如圖 2、圖 3 所示。

圖2 葡萄球菌腸毒素B系統(tǒng)溫度隨時(shí)間的變化Fig.2 Temperature changes of staphylococcal enterotoxin B system over time

圖3 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B系統(tǒng)能量隨時(shí)間的變化Fig.3 Energy changes of staphylococcal enterotoxin B system over time at different temperatures

從圖 2 可知，葡萄球菌腸毒素 B 系統(tǒng)處于比較完美的目標(biāo)溫度，其平均值和波動(dòng)均在合理范圍內(nèi)。圖 3 是不同溫度下葡萄球菌腸毒素 B 系統(tǒng)能量隨時(shí)間的變化曲線圖，系統(tǒng)在各溫度條件下能量都較為穩(wěn)定，波動(dòng)處于合理范圍內(nèi)，并且從圖 3 可知平均能量與溫度成正比，即溫度越高，系統(tǒng)的能量越高。為研究葡萄球菌腸毒素 B 蛋白在不同溫度下的穩(wěn)定性，分析了在模擬計(jì)算過(guò)程中蛋白質(zhì)骨架相對(duì)于平衡結(jié)構(gòu)的均方根偏差( Root Mean Square Deviation，RMSD)以及蛋白質(zhì)回旋半徑(Rg)，結(jié)果如圖 4 和圖 5 所示[19]。

圖4 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B系統(tǒng)RMSD隨時(shí)間的變化Fig.4 Changes of RMSD of staphylococcal enterotoxin B system over time at different temperatures

圖5 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B蛋白質(zhì)Rg隨時(shí)間的變化Fig.5 Changes of Rg of staphylococcal enterotoxin B protein over time at different temperatures

RMSD 反映了兩個(gè)結(jié)構(gòu)間的偏離程度，該值越大，表明結(jié)構(gòu)間差異越大；Rg表征了蛋白質(zhì)的致密程度，在一定程度上體現(xiàn)了蛋白質(zhì)在空間分布的延展性。圖4顯示，在不同溫度下，蛋白質(zhì)骨架的 RMSD 在模擬初始階段(0～0.5 ns)均顯著增加，表明結(jié)構(gòu)發(fā)生較大變化。隨著模擬時(shí)間進(jìn)行，在 254，264，274，314 K溫度下，系統(tǒng)的 RMSD 均保持在較小恒定值(0.15 nm)附近。但是在 299 K 時(shí)，RMSD 最終保持在 0.275 nm 附近，說(shuō)明溫度對(duì)葡萄球菌腸毒素B 蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性有很大影響。這也與圖 3 中溫度為 299 K 時(shí)系統(tǒng)的能量較高相呼應(yīng)。在圖 5 中，溫度較低時(shí)(254 ，264 ，274 K)，Rg保持在一個(gè)恒定值，說(shuō)明此時(shí)的蛋白質(zhì)折疊穩(wěn)定。在 314 K 時(shí)，其Rg也保持在一個(gè)相對(duì)恒定值，但是其波動(dòng)漲落比低溫下更大。在 299 K 時(shí)，其Rg發(fā)生明顯變化，說(shuō)明此時(shí)蛋白質(zhì)處于一個(gè)展開(kāi)不穩(wěn)定狀態(tài)，這與前面分析一致。綜上所述，溫度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有明顯影響，尤其是溫度為 299 K 時(shí)變化最明顯。

對(duì)上述系統(tǒng)再次進(jìn)行不采用任何約束力的模擬，時(shí)長(zhǎng) 200 ps，步長(zhǎng)為 2 fs，每隔1步記錄數(shù)據(jù)(位置、力、能量和速度)，結(jié)果共有 200 000 個(gè)構(gòu)象。然后使用 Gromacs 程序和傅里葉變換，記錄系統(tǒng)內(nèi)目標(biāo)蛋白的運(yùn)動(dòng)信息和偶極矩隨時(shí)間變化的曲線，然后做自相關(guān)函數(shù)的傅里葉變換，即將時(shí)間-偶極信號(hào)轉(zhuǎn)變?yōu)轭l率-吸收強(qiáng)度信號(hào)，計(jì)算不同溫度下的紅外光譜，結(jié)果如圖 6 和表 1 所示。

對(duì)葡萄球菌腸毒素蛋白進(jìn)行紅外光譜測(cè)定，對(duì)比實(shí)驗(yàn)和理論結(jié)果。在干燥條件下稱取葡萄球菌腸毒素蛋白樣品 2 mg，按照質(zhì)量比 1∶100 加入烘干的 KBr，用瑪瑙研缽研磨至細(xì)粉狀，壓片(將混合研磨后的樣品置于壓片夾內(nèi),壓力約為 10 MPa,壓片時(shí)間約為 60 s)后, 用 Frontier(美國(guó)PE公司)紅外光譜儀分析,分辨率 4 cm-1,以 KBr 為空白,并去除背景值,收集 4 000 ～ 500 cm-1范圍內(nèi)光譜。

圖6 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B蛋白質(zhì)的紅外光譜與實(shí)驗(yàn)紅外光譜Fig.6 Computational and experimental infrared spectroscopy of staphylococcal enterotoxin B protein at different temperatures

表1 不同溫度下葡萄球菌腸毒素B蛋白質(zhì)的紅外光譜的峰值Table 1 Infrared spectrum peaks of staphylococcal enterotoxin B protein at different temperatures

表2 實(shí)驗(yàn)與計(jì)算得到的葡萄球菌腸毒素紅外特征峰及其振動(dòng)模式Table 2 Experimental and calculated infrared characteristic peaks and vibration modes of staphylococcal enterotoxin

3 結(jié)論

采用分子動(dòng)力學(xué)方法對(duì)葡萄球菌腸毒素蛋白進(jìn)行非簡(jiǎn)諧振動(dòng)分析計(jì)算，建立了生物大分子紅外光譜的理論計(jì)算模型，計(jì)算其特征峰位并研究了溫度對(duì)其穩(wěn)定性及振動(dòng)情況的影響，與實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)對(duì)比得到如下結(jié)論：通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬了葡萄球菌腸毒素蛋白的動(dòng)態(tài)過(guò)程，得到了不同溫度條件下系統(tǒng)的能量、均方根偏差(RMSD)和蛋白質(zhì)回旋半徑(Rg)隨時(shí)間變化圖。分析得知葡萄球菌毒素平均能量與溫度成正比，即溫度越高，系統(tǒng)的能量越高，溫度對(duì)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性有明顯影響。計(jì)算表明溫度對(duì)其高頻振動(dòng)光譜影響更大。

利用此數(shù)據(jù)和理論實(shí)踐方法,后續(xù)擬將該模型應(yīng)用于其他化學(xué)戰(zhàn)劑和危化品的近紅外光譜計(jì)算中，將大量的毒素低頻振動(dòng)光譜收集成庫(kù)，即可以實(shí)現(xiàn)利用其光譜特征信號(hào)來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)該類物質(zhì)的分子識(shí)別和精確預(yù)警。