敖金成，周桂夙，李永梅

（1. 云南農業(yè)大學 植物保護學院，云南 昆明 650201；2. 云南農業(yè)大學 煙草學院，云南 昆明 650201）

煙草是我國重要的經濟作物之一，為茄科忌連作作物。隨著人口不斷增長和其他非煙經濟作物種植面積的進一步擠壓，優(yōu)質耕地資源的供需矛盾日益凸顯，致使云南烤煙連作現(xiàn)象日趨嚴重。連作引起土壤化感物質積累[1]、病原菌增加[2]、微生物結構多樣性[3]和功能多樣性[4]降低，造成作物土傳病害發(fā)生[5]。土傳病害因對煙草種植效益及煙葉品質構成嚴重威脅而受到廣泛關注。深入認識連作土壤微生物群落演化規(guī)律是探尋有效防控作物土傳病害途徑的關鍵。

在諸多的土傳病害中，煙草鐮刀菌根腐病是由半知菌亞門（Deuteromycotina）鐮刀菌屬（Fusarium）病原菌引起的一種典型土傳病害，該病危害面廣，防治難度大，近年來全國核心煙區(qū)發(fā)病率呈上升趨勢。有報道表明，引起煙草鐮刀菌根腐病的病原菌主要為茄腐鐮刀菌（F. solani）[6]和尖孢鐮刀菌（F.oxysporium）[7]，可單一發(fā)生危害，也可復合發(fā)生危害。隨著研究的深入，越來越多的煙草鐮刀菌根腐病病原菌被發(fā)現(xiàn)。2018年吳忠安等[8]首次報道了共享鐮刀菌（F. commune）引起煙草根腐??；2021 年QIU 等[9?10]首次報道了由Fusarium brachygibbosum和Fusarium sinensis引起的河南煙區(qū)根腐病。連作和煙株感病均會引起土壤微生物群落結構和多樣性的改變。許自成等[11]研究表明，長期連作導致土壤真菌群落結構發(fā)生變化和致病菌增多，但鐮刀菌屬真菌并未呈現(xiàn)遞增趨勢。在連作土壤中，鐮刀菌屬隨著連作年限的增加逐漸成為優(yōu)勢真菌生理群[12?13]。研究感染黑脛病煙株[14]和感染青枯病煙株[15]根際土壤微生物群落結構發(fā)現(xiàn)，感病煙株微生物群落結構發(fā)生改變，多樣性降低。而在連作條件下，根腐病感病煙株土壤微生物群落結構及多樣性，尤其是一些病原微生物群落豐度的變化鮮見報道。鑒于此，基于不同連作年限煙田，探討了健康和煙草根腐病感病煙株根際土壤細菌、真菌群落結構及多樣性特征，以期為連作土壤微生態(tài)環(huán)境的定向調控及土傳病害的生態(tài)防控提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 連作土壤采集區(qū)概況及取樣

1.1.1 區(qū)域概況 供試區(qū)域位于云南省曲靖市馬龍區(qū)舊縣鎮(zhèn)（103°23′10″E，25°20′20″N）核心煙區(qū)，烤煙連作現(xiàn)象較為普遍。該煙區(qū)地處云貴高原的滇東北丘陵區(qū)，氣候屬于低緯高原季風型氣候，年均溫13.3～15.1 ℃，烤煙大田生育期降水量740.0～810.0 mm，海拔1 957.1 m。土壤類型為黃壤，供試烤煙品種為云煙87。

1.1.2 試驗設計及樣品采集 于2020 年7 月烤煙成熟期，在云南省曲靖市核心煙區(qū)選擇不同連作年限煙田進行樣品采集。分別在連作2、4、8 a 的地塊隨機選取4 株健康煙株和4 株根腐病發(fā)病較重的煙株，連作年限編號分別為T2、T4、T8。取樣時去除地表雜物，然后將煙株整株挖起，去除主體根圍土，采用抖根法[16?17]收集須根2 mm 范圍內的土壤。3 種連作年限（2、4、8 a）煙田中，病株根際土壤組（S）樣本編號分別為ST2、ST4、ST8，健株根際土壤組（H）樣本編號分別為HT2、HT4、HT8。同時，在相同區(qū)域取撂荒2 a 以上地塊（未種植任何作物）0～20 cm 土層土壤，樣品編號為CK。用于化學性質檢測的土壤樣品用自封袋裝好，帶回實驗室，自然陰干，研磨過篩后備用；用于細菌、真菌高通量測序的土壤樣品用取樣管裝好置于低溫保藏箱，快速帶回實驗室于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 檢測項目及方法

1.2.1 土壤化學性質的測定 土壤樣本的有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀含量和pH 值測定參照文獻[18]的方法進行。

1.2.2 土壤細菌、真菌高通量測序

1.2.2.1 DNA 提取 采用HiPure Soil DNA Mini Kit試劑盒（Magen，廣州，中國，cat#3412）進行土壤微生物DNA 提取。首先在2 mL beads Tube 中加入0.25～0.50 g 土壤樣品和0.6 mL Buffer SOL，利用渦旋儀（米歐mix-28+，廣州圍谷潤儀器有限公司）充分勻漿裂解，然后70 ℃水浴10 min，并離心收集管壁上液 滴，加 入200 μL Buffer PS 和150 μL Absorber Solution，渦旋混勻20 s，靜置5 min 后離心5 min，取上清液至2 mL 離心管，加入等體積Buffer GDP，混勻，獲得DNA 后，用1%瓊脂糖（Biowest Agarose，西班牙）凝膠電泳（DYY-6C，北京六一儀器廠）檢測基因組DNA 的完整性和是否發(fā)生蛋白質等污染，DNA樣品于-80 ℃保存待用。

1.2.2.2 目的基因擴增及I llumina 測序 采用帶有Barcode 標 記 的 特 異 引 物 341F （5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′）、806R（5′-GGACTA?CHVGGGTATCAAT-3′）對細菌16S rDNA V3—V4區(qū)進行MiSeq 擴增子測序;采用帶有Barcode 標記的特異引物ITS3-F（5′-GATGAAGAACGYAGYRAA-3′）、ITS4-R（5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′）對真菌ITS 的ITS2 測序區(qū)域進行MiSeq 擴增子測序。PCR 采 用TransStart Fastpfu DNA Polymerase 聚 合酶，每個樣本3 次PCR 重復，擴增后將PCR 產物利用AMPure XP 磁珠進行純化，混合后用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測純化效果。第2 輪擴增后使用AMPure XP 磁珠對PCR 產物進行純化，之后用ABI StepOnePlus RealTime PCR System（Life technologies，美國）進行定量，最后根據(jù)Novaseq 6000的PE250模式Pooling上機測序。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2016 進行數(shù)據(jù)處理，用IBM Statistics SPSS 20.0 進行方差分析。利用軟件平臺Usearch（version 7.0）對相似度在97%條件下的操作分類單元（Operational taxonomic unit，OTU）進行質控拼接和Tag 聚類去嵌合體，獲得OTU 的豐度和OTU 代表序列。利用軟件Mothur（v.1.30.1）計算反映群落豐富度（Community richness）的Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)以及反映群落多樣性的Shannon-Wiener指數(shù)（香農-維納指數(shù)），分析其α 多樣性。利用主坐標分析（Principal co?ordinate analysis，PCoA）法進行β 多樣性分析，并結合Anosim 檢驗分析不同樣本細菌、真菌群落差異。采用冗余分析（Redundancy analysis，RDA）進行環(huán)境因子與微生物群落分布的關聯(lián)分析。

2 結果與分析

2.1 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細菌、真菌群落組成分析

細菌屬水平上，排前10位的優(yōu)勢細菌屬相對豐度累積總和達到19.9%～29.8%。相較于CK，HT2、HT4、HT8 樣本排前10 位的優(yōu)勢細菌屬相對豐度增幅分別為9.2%、29.5%、24.2%，ST2、ST4、ST8 樣本相對豐度增幅分別為26.4%、27.2%、29.8%（圖1a）。從圖1a 豐度熱圖可以看出，相較于CK，HT2、HT4、HT8 樣本優(yōu)勢細菌屬中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）相對豐度增幅分別為-19.6%、16.2%、47.6%，芽單胞菌屬（Gemmatimonas）相對豐度增幅分別為82.9%、188.1%、225.9%，弗拉托氏菌屬（Frateuria）相對豐度增幅分別為865.4%、934.6%、330.8%，出芽菌屬（Gemmata）相對豐度增幅分別為92.6%、113.0%、250.0%；ST2、ST4、ST8 樣本優(yōu)勢細菌屬中鞘氨醇單胞菌屬相對豐度增幅分別為-23.1%、50.3%、63.4%，芽單胞菌屬相對豐度增幅分別為52.8%、160.1%、200.0%，弗拉托氏菌屬相對豐度增幅分別為1 123.1%、350.0%、150.0%，出芽菌屬相對豐度增幅分別為7.4%、203.7%、418.5%。另外，ST4 和HT8 樣本的戴氏菌屬（Dyella），ST4、HT8、ST8 樣 本 的 小 梨 形 菌 屬（Pirellula）和Candidatus_Udaeobbacter菌屬相對豐度較高。

真菌屬水平上，排前17位的優(yōu)勢菌屬相對豐度累積總和達到19.0%～67.8%（圖1b）。相較于CK，HT2、HT4、HT8 樣本優(yōu)勢真菌屬相對豐度累積總和降幅分別為53.4%、53.7%、65.7%；ST2、ST4、ST8 樣本優(yōu)勢真菌屬相對豐度累積總和降幅分別為19.0%、51.9%、67.8%。相較于CK，HT2、HT4、HT8樣本的青霉菌屬（Penicillium）相對豐度降幅分別為72.2%、 86.0%、 95.0%， 淡 紫 紫 孢 菌 屬（Purpureocillium）相對豐度降幅分別為90.9%、83.9%、39.5%，毛殼菌屬（Chaetomium）相對豐度降幅分別為47.5%、26.1%、76.3%；HT4 和HT8 樣本鐮刀菌屬（Fusarium）相對豐度增幅分別為430.3%、576.8%，HT2 樣本降幅為59.5%。相較于CK，ST2、ST4、ST8 樣本的青霉菌屬相對豐度降幅分別為66.4%、92.8%、97.4%，而鐮刀菌屬相對豐度增幅分別為255.8%、123.4%、389.3%；ST2 樣本木霉菌屬相對豐度增幅為530.3%，而ST4、ST8 樣本木霉菌屬相對豐度降幅分別為30.3%、51.5%；ST2和ST8樣本淡紫紫孢菌屬降幅分別為96.5%和79.7%，ST4樣本增幅為23.1%；毛殼菌屬等其他幾種優(yōu)勢菌屬相對豐度變化規(guī)律不明顯。相較于其他處理，連作8 a 煙田健株和病株根際土壤以鏈格孢屬（Alternaria）、頭束霉屬（Cephalotrichum）相對豐度較高，且ST8 樣本尾柄孢殼屬（Cercophora，相對豐度2.77%）和Setophoma屬（2.30%）相對豐度也較高。

圖1 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細菌（a）、真菌（b）屬水平上物種豐度熱圖Fig.1 Heat map of bacterial（a）and fungal（b）relative abundance in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field at genus level

2.2 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細菌、真菌群落的α多樣性分析

Sobs 指數(shù)表示實際檢測到的OTU 個數(shù)，反映樣本物種豐富程度，Shannon-Wiener 指數(shù)綜合反映物種的多樣性和均勻度，Shannon-Wiener 指數(shù)越大，樣本物種分布越均勻，多樣性越高。從不同連作年限煙田健株和病株根際土壤細菌、真菌群落的α 多樣性（表1）可以看出，隨連作年限的延長，細菌群落Sobs 指數(shù)和Chao1 指數(shù)整體呈增大趨勢，除連作4 a煙田病株根際土壤細菌群落Sobs指數(shù)和Chao1指數(shù)大于健株外，連作2 a 和8 a 煙田均表現(xiàn)為病株根際土壤細菌群落Sobs 指數(shù)略低于健株，表明連作年限增加，土壤細菌群落豐富度增加，感病煙株根際土壤細菌群落豐富度在一定程度上降低。細菌Shannon-Wiener 指數(shù)隨連作年限的延長呈增大趨勢，以連作8 a 煙田的健株和病株樣本較高，其中連作4 a 和8 a 煙田均表現(xiàn)為病株樣本略高于健株樣本，連作2 a 煙田則表現(xiàn)為病株樣本小于健株樣本，表明長期連作（4～8 a）提高煙株根際土壤細菌群落多樣性，感病對煙株根際土壤細菌群落多樣性的增加有一定的促進作用。相較于CK，隨連作年限的延長，煙田健株和病株根際土壤真菌群落Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon-Wiener 指數(shù)整體呈先降后升的趨勢，除連作2 a 煙田外，連作4 a 和8 a 煙田病株樣本真菌群落Sobs 指數(shù)均大于健株；連作2 a 和4 a煙田健株樣本Shannon-Wiener 指數(shù)低于病株，連作8 a煙田病株樣本Shannon-Wiener指數(shù)略低于健株；Chao1指數(shù)均表現(xiàn)為病株樣本大于健株樣本。

表1 連作煙田健株與根腐病感病煙株根際土壤細菌和真菌群落α多樣性Tab.1 α-diversity of bacterial and fungal communities in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field

2.3 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細菌、真菌群落的β多樣性分析

PCoA 基于距離矩陣進行降維分析，以百分比評估各坐標軸對菌群結構總體差異的解釋度，一般PCoA1和PCoA2總和達到50%以上較好。從圖2可以看出，細菌的PCoA1 與PCoA2 總和為56.32%，真菌的PCoA1 與PCoA2 總和為50.31%，均大于50%，說明坐標軸對細菌、真菌群落結構總體差異解釋度較好。不同連作年限煙田的健株及病株根際土壤樣本生物細菌、真菌群落組成差異較大，相同連作年限煙田的健株和病株根際土壤樣本的細菌、真菌群落組成差異較小。連作年限越長，距離CK 土壤樣本越遠。Anosim檢驗結果表明，除HT2和ST2樣本的真菌群落組成有顯著差異（P<0.05）外，其余相同連作年限煙田的健株和病株根際土壤細菌、真菌群落組成無顯著差異（P>0.05），說明群落結構相似性較高，但與CK 樣本差異均達到顯著水平（P<0.05）。隨連作年限的延長，CK、HT2、HT4 及HT8樣本間，以及CK、ST2、ST4 及ST8 樣本間細菌、真菌群落組成差異均達到極顯著水平（P<0.01）。

圖2 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤細菌（a）、真菌（b）OTU的β多樣性Fig.2 β-diversity analysis of bacterial（a）and fungal（b）OTUs in rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in continuous cropping field

2.4 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤化學性質與微生物群落關聯(lián)分析

2.4.1 連作煙田健株和病株根際土壤的化學性質

從表2 可以看出，撂荒土壤（CK）養(yǎng)分含量均顯著（P<0.05）低于其他處理，尤其是速效磷、速效鉀和有機質含量較低，其中HT2、HT4、HT8 處理根際土壤有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別較CK增加102.8%～336.4%、71.0%～108.3%、96.8%～703.2%、124.5%～233.3%，ST2、ST4、ST8 處理根際土壤有機質、堿解氮、速效磷、速效鉀含量分別較CK 增加101.9%～233.6%、66.7%～158.3%、306.3%～793.7%、125.1%～234.4%，說明健株和病株根際土壤主要養(yǎng)分變化特征相似，但病株根際土壤養(yǎng)分水平整體優(yōu)于健株根際土壤，這可能與煙株感病后養(yǎng)分吸收水平降低有關。

表2 連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤的化學性質Tab.2 Chemical properties of rhizosphere soil of healthy and root rot-infected tobacco plants in different continuous cropping fields

2.4.2 土壤化學性質與細菌、真菌性狀關聯(lián)特征

RDA 主要通過降維思想，使用二維平面反映菌群、樣本、環(huán)境因子三者之間的關系。從圖3可以看出，屬水平上，不同連作年限煙田健株和病株根際土壤細菌（圖3a）、真菌（圖3b）RDA分析的第Ⅰ和第Ⅱ排序軸5 個環(huán)境因子累積解釋變異量分別達到82.01%、89.84%，說明前2 個排序軸能夠很好地反映土壤細菌、真菌群落結構與土壤化學性質之間的關系，且主要由第Ⅰ軸決定。

圖3 細菌（a）、真菌（b）群落與土壤化學性質的冗余分析Fig.3 Redundancy analysis between bacterial（a），fungal（b）communities and soil chemical properties

在細菌屬水平上（圖4a），皮爾森（Pearson）相關系數(shù)表明，土壤pH 值與鞘氨醇單胞菌屬、Candidatus_Udaeobacter、出芽菌屬相對豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）正相關，與鏈霉菌屬、Bryobacter、Granulicella、JG30a-KF-32、酸 桿 菌 屬（Acidibacter）和Singulisphaera相對豐度呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負相關；土壤有機質含量僅與Occallatibacter相對豐度呈顯著負相關（P<0.05）；土壤堿解氮含量與出芽菌屬、Candidatus_Udaeobacter和小梨形菌屬相對豐度呈極顯著（P<0.01）或 顯 著（P<0.05）正 相 關，與Granulicella、JG30a-KF-32、Occallatibacter、酸桿菌屬相對豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）負相關；土壤速效磷含量與小梨形菌屬、Singulisphaera、Candidatus_Udaeobacter和出芽菌屬相對豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）正相關；土壤速效鉀含量與芽單胞菌屬、出芽菌屬、Candidatus_Udaeobacter和小梨形菌屬相對豐度呈極顯著正相關（P<0.01），與Burkholderia-Caballeronia-Paraburkholderia、Granulicella、細 鏈 孢 菌 屬（Catenulispora）、JG30a-KF-32、Occallatibacter、酸桿菌屬相對豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）負相關。在真菌屬水平上（圖4b），皮爾森（Pearson）相關系數(shù)表明，土壤pH 值與青霉菌屬、Oidiodendron相對豐度呈顯著負相關（P<0.05）；土壤有機質含量與Setophoma相對豐度呈顯著負相關（P<0.05），與Oidiodendron呈顯著正相關（P<0.05）；土壤堿解氮含量與青霉菌屬相對豐度呈顯著負相關（P<0.05），與鏈格孢屬（Alternaria）呈顯著正相關（P<0.05）；土壤速效磷含量與青霉菌屬、毛殼菌屬相對豐度呈顯著負相關（P<0.05）；土壤速效鉀含量與青霉菌屬相對豐度呈極顯著負相關（P<0.01）。

圖4 土壤化學性質與細菌（a）、真菌（b）群落的皮爾森分析Fig.4 Pearson analysis between soil chemical properties and bacterial（a），fungal（b）communities

幾種主要化學指標中以土壤速效鉀含量和pH值對細菌群落分布影響較大，貢獻值分別為8.80%和8.62%（圖5a），以速效磷含量對真菌群落分布影響最大，貢獻值為11.64%（圖5b）。說明pH 值和速效鉀含量是影響細菌群落分布的核心化學因子，速效磷含量是影響真菌群落分布的核心化學因子。

圖5 土壤化學性質對細菌（a）、真菌（b）分布的貢獻度分析Fig.5 Contribution of soil chemical properties to the distribution of bacteria（a）and fungi（b）

3 結論與討論

3.1 連作與根腐病感染對煙株土壤微生物群落結構的影響

本研究發(fā)現(xiàn)，烤煙連作與感病條件下，煙田土壤微生物種群結構發(fā)生趨向性變化，優(yōu)勢種群累積特征明顯。細菌優(yōu)勢菌群相對豐度累積總和隨連作年限的延長總體呈增加趨勢，與CK 相比，健株、病株排前10 位的優(yōu)勢菌屬相對豐度累積總和增幅分別為9.2%～29.5%、26.4%～29.8%，其中以芽單胞菌屬、弗拉托氏菌屬、出芽菌屬相對豐度增幅較大，連作4 a 煙田病株和連作8 a 煙田健株及病株根際土壤樣本中常見致病病原菌小梨形菌屬和Candidatus_Udaeobbacter相對豐度也較高。

真菌優(yōu)勢菌屬相對豐度累積總和隨連作年限的增加呈降低趨勢，與CK 相比，健株、病株根際土壤優(yōu)勢菌屬相對豐度累積總和降幅分別為53.4%～65.7%、19.0%～67.8%，其中健株根際土壤樣本以青霉菌屬、淡紫紫孢菌屬和毛殼菌屬降幅較大，連作4 a和連作8 a樣本鐮刀菌屬相對豐度增幅較大。病株根際土壤以青霉菌屬相對豐度降幅較大，以鐮刀菌屬相對豐度增幅較大，說明青霉菌屬和鐮刀菌屬是造成連作煙田健株和根腐病感病煙株根際土壤群落差異的關鍵物種。與丁亞茹等[19]研究指出一些關鍵物種是造成健康和易感煙田根際土壤微生物群落差異的主要原因結論一致。DAGUENRE 等[20]研究也認為，幾乎每一種土傳病原微生物都有與之相克的拮抗微生物。已有研究報道顯示，青霉屬真菌中已報道了1 300 多種不同的代謝產物，它們普遍具有抗菌、抗蟲等活性[21]。前人已分離出大量對病原菌具有較好抑制效應的青霉屬真菌[22]。淡紫紫孢菌是一種重要的生防菌，在根結線蟲防治方面有廣泛應用[23?25]；毛殼菌對許多植物病原菌有潛在的生 防 作 用[26?27]，其 中 內 生 球 毛 殼 菌（Chaetomium globosum）對油菜菌核病病原菌和立枯絲核菌具有不同程度的抑制作用[28]。鐮刀菌屬為重要的土傳病原菌[29?30]，常引起作物根腐病[31?33]，本研究結果顯示，不同連作年限煙田健株和病株根際土壤鐮刀菌屬相對豐度整體增幅較大，推測其可能是引起試驗煙株發(fā)生根腐病的主要病原。綜上所述，連作提高土壤細菌優(yōu)勢菌種群豐富度，降低土壤真菌優(yōu)勢菌種群豐富度，表現(xiàn)為病原菌豐度增加，拮抗菌豐度降低，該試驗連作煙田烤煙受根結線蟲病和鐮刀菌根腐病等土傳病害侵染危害風險較高。

3.2 連作與根腐病感染對土壤細菌、真菌群落多樣性的影響

土壤微生物的數(shù)量、種類和多樣性是維持土壤健康和質量的重要因素[34]。土壤連作障礙的發(fā)生與土壤微生物的種類和數(shù)量變化有著密切關系[35]。本研究中，隨連作年限延長，健株和病株根際土壤真菌群落的Sobs 指數(shù)、Chao1 指數(shù)和Shannon-Wiener指數(shù)均呈先降后升的變化趨勢，但總體上均小于CK樣本。

健株根際土壤細菌群落豐富度隨連作年限增加呈增加趨勢，病株除ST4 樣本的細菌群落豐富度大于HT4 外，ST2 和ST8 樣本的細菌群落豐富度均小于相應連作年限的健株，其原因可能與連作4 a煙田病株的異質性有關；健株和病株樣本的細菌群落多樣性隨連作年限的延長而提高，其中連作4 a和8 a 煙田的病株樣本均大于健株；健株和病株根際土壤細菌群落Sobs、Chao1 和Shannon-Wiener 指數(shù)均大于CK，說明連作煙田土壤細菌群落豐富度和多樣性提高，但長期連作條件下煙株感染根腐病后細菌群落的豐富度降低但群落多樣性提高，與文獻[34?37]認為烤煙連作減少土壤細菌多樣性、增加真菌數(shù)量的結論不完全一致。這可能與連作地塊在肥料[38]、調理劑[39]施用等方面存在差異有關。本研究中，主坐標分析和Anosim 檢驗結果表明，不同連作年限煙田健株樣本間及病株樣本間根際土壤樣本細菌和真菌群落組成差異較大，且連作年限越長，與撂荒土壤細菌、真菌群落組成差異越大。

3.3 連作煙田理化性質對健康和感病煙株根際微生物分布的影響

連作條件下，健康和病株根際土壤細菌、真菌群落分布與土壤化學性質的關系存在差異，其中土壤pH 值和速效鉀含量對細菌群落的分布影響較大，這與文獻[3]的結論一致，土壤速效磷含量對真菌群落的分布影響較大。本研究中，土壤pH 值與鞘氨醇單胞菌屬、Candidatus_Udaeobacter、出芽菌屬相對豐度呈極顯著（P<0.01）或顯著（P<0.05）正相關，與鏈霉菌屬、Bryobacter、Granulicella、JG30a-KF-32、酸桿菌屬（Acidibacter）、Singulisphaera、青霉菌屬和Oidiodendron的相對豐度呈顯著（P<0.05）或極顯著（P<0.01）負相關，其中鏈霉菌、酸桿菌、青霉菌為常見的有益菌，說明調控pH 值對維持土壤有益菌和病原菌平衡至關重要。另外，土壤速效鉀含量與酸桿菌屬和青霉菌屬相對豐度呈顯著負相關，而與小梨形菌屬相對豐度呈正相關，說明增施鉀肥降低有益菌群豐度，增加特殊病原菌群豐度，這可能與近年來烤煙種植時大量施用鉀肥有關。礦質營養(yǎng)不僅對植物正常生長發(fā)育起重要作用，而且以多種方式直接或間接影響病原物的侵染、繁殖及植株的感病與抗病性[40]?？梢姡ㄟ^調控土壤理化性質尤其是pH 值，可以調控土壤微生物群落結構及分布，這與劉株秀等[41]的研究結果一致。