顧寅偉，李 艷，凌晶晶，顧 寧

（東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院，生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇省生物材料與器件重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210096）

細(xì)胞與材料間的相互作用研究，尤其是材料對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控，對(duì)于基礎(chǔ)生物學(xué)、組織工程和再生醫(yī)學(xué)等相關(guān)領(lǐng)域至關(guān)重要。1911年，Harrison發(fā)現(xiàn)蜘蛛網(wǎng)上生長的細(xì)胞會(huì)沿著網(wǎng)中的纖維方向生長，并將這種現(xiàn)象稱為物理導(dǎo)向［1］。1945年，Weiss證實(shí)了該現(xiàn)象，將其命名為“接觸引導(dǎo)”［2］。隨著微納米加工技術(shù)的迅速發(fā)展，研究者在不同基材上制備出了形貌、尺寸各異的圖案，并研究了這些圖案對(duì)成纖維細(xì)胞、成骨細(xì)胞、上皮細(xì)胞、干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種細(xì)胞行為的影響。在過去的幾十年內(nèi)，材料調(diào)節(jié)細(xì)胞行為的研究層出不窮，但如何創(chuàng)造一個(gè)最佳的細(xì)胞外環(huán)境，始終是一項(xiàng)極具挑戰(zhàn)性的工作?？刂莆⒓{米尺度上材料表面與細(xì)胞的相互作用，在實(shí)現(xiàn)細(xì)胞調(diào)控這一研究方向上有著巨大的發(fā)展前景。

1 細(xì)胞形態(tài)變化原理

細(xì)胞的機(jī)械特性主要由細(xì)胞骨架決定。細(xì)胞骨架是真核細(xì)胞中由微管、微絲以及中間纖維構(gòu)成的蛋白纖維網(wǎng)架體系，在細(xì)胞形態(tài)、粘附、分裂、運(yùn)動(dòng)以及信號(hào)傳導(dǎo)中都起著重要作用。

細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）是由蛋白質(zhì)和多聚糖組成的復(fù)雜網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，為細(xì)胞及組織提供結(jié)構(gòu)支撐。在人體內(nèi)，細(xì)胞活動(dòng)與細(xì)胞外基質(zhì)密切相關(guān)，沒有細(xì)胞外基質(zhì)，細(xì)胞無法正常完成包括分裂在內(nèi)的多種行為［3］。細(xì)胞受細(xì)胞外基質(zhì)影響的機(jī)制有以下3種：整合素與配體間的相互作用、表面化學(xué)信號(hào)、基底的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)效應(yīng)［4］。

整合素是ECM蛋白的粘附性受體，在非活性狀態(tài)下，它們?cè)诩?xì)胞膜內(nèi)自由擴(kuò)散。當(dāng)細(xì)胞在ECM中遇到一個(gè)可作用的結(jié)合位點(diǎn)時(shí)，多種整合素發(fā)生構(gòu)象變化，通過物理聚集將大量細(xì)胞質(zhì)蛋白吸引到粘附部位，以增大粘附點(diǎn)、提高粘附強(qiáng)度、加強(qiáng)生化信號(hào)活性。這些較大的整合素、細(xì)胞質(zhì)蛋白聚集通常稱為焦點(diǎn)粘連。整合素介導(dǎo)的細(xì)胞粘連將細(xì)胞骨架與ECM連接起來，并在兩者之間提供動(dòng)態(tài)的雙向聯(lián)系［5］。如此一來，力誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)構(gòu)象變化將會(huì)被轉(zhuǎn)化為生物化學(xué)信號(hào)，從而激活細(xì)胞內(nèi)多種信號(hào)通路，最終調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)。

2 表面圖案化方法及其意義

至今為止，表面圖案化技術(shù)已較為成熟，根據(jù)制備原理，主要分為以下兩種類型：（1）自上而下的制備途徑。該類方法從材料本體著手，通過外部調(diào)控使圖案的尺寸由宏觀進(jìn)入微觀，形成具有特定性能或形狀的微納米結(jié)構(gòu)，主要包括光刻技術(shù)［6］、軟刻蝕技術(shù)［7］、納米壓印（NIL）［8］等；（2）自下而上的制備途徑。通過原子、分子或分子聚合物間的非共價(jià)鍵力，得到尺寸逐漸增大的微納米結(jié)構(gòu)材料，該類方法包括自組裝［9］、共價(jià)鍵固定［10］、靜電逐層沉積［11］等技術(shù)。本課題組研究了一種利用交流磁場(chǎng)誘導(dǎo)磁性納米顆粒的準(zhǔn)一維組裝技術(shù)，該方法將直徑約10～11 nm的超順磁性四氧化三鐵納米顆粒暴露于垂直的交變磁場(chǎng)下，利用磁偶極相互作用，使納米粒子在磁場(chǎng)作用下形成纖維結(jié)構(gòu)，隨著磁場(chǎng)強(qiáng)度的增加，其構(gòu)象發(fā)生從非晶形聚合物到纖維狀結(jié)構(gòu)的顯著轉(zhuǎn)變［12］。相似地，運(yùn)用交變磁場(chǎng)還可以完成辣根過氧化物酶（HRP）的準(zhǔn)一維自組裝，同時(shí)可以幾乎完全保留其催化活性［13］。另外，本課題組還開發(fā)了一種旋轉(zhuǎn)磁場(chǎng)組裝盤狀磁性水凝膠復(fù)合材料的制備方法，三維有序排列的磁性納米鐵顆?？梢栽鰪?qiáng)材料的磁熱性能以及機(jī)械強(qiáng)度［14］。與化學(xué)修飾或物理蝕刻方法相比，該組裝方法具有操作簡單、成本低廉的優(yōu)點(diǎn)。

人體內(nèi)的ECM是一種復(fù)雜的三維網(wǎng)格架構(gòu)，為細(xì)胞提供復(fù)雜的化學(xué)、物理微環(huán)境，錨固提供底物，并作為組織支撐，指導(dǎo)細(xì)胞的生長遷移。缺損組織的修復(fù)需要ECM替代支架的參與。細(xì)胞與材料表面的結(jié)合包括細(xì)胞附著、細(xì)胞鋪展、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架的變化以及局部粘連的形成。當(dāng)由體外被接種到人造材料表面時(shí)，細(xì)胞會(huì)從圓形轉(zhuǎn)變?yōu)楸P狀形態(tài)，細(xì)胞鋪展的初始階段類似于液滴在可濕性表面上的扁平化過程［15］。隨后，細(xì)胞內(nèi)的肌動(dòng)蛋白微絲發(fā)生重組，細(xì)胞和底物之間形成局部黏連，細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的內(nèi)部收縮控制進(jìn)一步的細(xì)胞鋪展行為，如層狀延伸和細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

圖案化技術(shù)可以在細(xì)胞培養(yǎng)基底上產(chǎn)生各種形狀、大小的表面形貌，全面了解細(xì)胞粘附、鋪展在不同圖案表面上的具體過程及后續(xù)功能，對(duì)于生物材料的設(shè)計(jì)極其重要。

3 表面圖案化對(duì)細(xì)胞行為的影響

在化學(xué)圖案化中，特異性細(xì)胞感應(yīng)機(jī)制起主要作用，而形貌表面圖案化對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)節(jié)，依賴于材料表面的結(jié)構(gòu)與尺寸。一般而言，微納米圖案可分為各向異性和各向同性兩種。各向異性圖案指脊和槽形圖案，溝槽、條紋圖案可以使細(xì)胞在微納米尺度上與形貌方向?qū)R，形成接觸引導(dǎo)反應(yīng)，對(duì)細(xì)胞的影響以細(xì)胞導(dǎo)向、形貌、骨架改變?yōu)橹鳌６飨蛲詧D案指隨機(jī)或均勻分布的圖案，如島、坑、樁等，一般不會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞定向，但能夠在微納米尺度上影響細(xì)胞群體化行為，諸如細(xì)胞粘附程度、細(xì)胞鋪展面積、增殖率、分化程度、上調(diào)或下調(diào)細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)等。

3.1 各向異性微納米圖案

各種尺寸的凹槽形貌構(gòu)成了各向異性圖案最經(jīng)典的例子，用于研究體外“接觸引導(dǎo)”現(xiàn)象。所謂“接觸引導(dǎo)”是指細(xì)胞在微納米級(jí)各向異性圖案表面生長時(shí)，會(huì)出現(xiàn)的調(diào)節(jié)自身取向并沿著圖案方向生長的現(xiàn)象。該現(xiàn)象除了可以用于高度材料引導(dǎo)取向的細(xì)胞組織的再生，例如肌腱、神經(jīng)、骨的修復(fù)，還能夠引起許多其他細(xì)胞生物學(xué)效應(yīng)。Gerecht等［16］發(fā)現(xiàn)使用松胞素D破壞細(xì)胞骨架的細(xì)胞在圖案化表面上表現(xiàn)出較差的取向性，表明細(xì)胞骨架在接觸引導(dǎo)現(xiàn)象中起著不可或缺的作用。

接觸引導(dǎo)發(fā)生程度的影響因素包括溝槽圖案的脊寬、深度，所選細(xì)胞的種類，材料的類別以及實(shí)驗(yàn)條件等。大多數(shù)細(xì)胞通過沿著圖案主軸的對(duì)齊和伸長來響應(yīng)平行排列的凹槽和脊，而平坦表面的細(xì)胞通常表現(xiàn)出隨機(jī)取向和更圓潤的形態(tài)。Charest等［17］使用深度相同、脊寬不同的納米溝槽圖案對(duì)成肌細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，結(jié)果表明細(xì)胞發(fā)生接觸引導(dǎo)的程度在一定范圍內(nèi)與脊寬成反比，同時(shí)，脊寬還存在一個(gè)最適尺寸，可以使接觸引導(dǎo)的發(fā)生程度最大化。超過臨界尺寸時(shí)，細(xì)胞對(duì)凹槽圖案的響應(yīng)將逐漸消失，細(xì)胞行為趨于在平坦表面上觀察到的行為。相對(duì)地，也有相關(guān)研究［18］報(bào)道了溝槽的最小尺寸閾值，在該閾值下同樣不再觀察到細(xì)胞排列變化。對(duì)于不同細(xì)胞類型，存在不同的最佳形貌尺寸范圍。除了溝槽的寬度和深度之外，還有研究表明凹槽的縱橫比也會(huì)對(duì)細(xì)胞行為產(chǎn)生影響。Crouch［19］、Wong［20］等的研究分別發(fā)現(xiàn)人類間充質(zhì)干細(xì)胞和人類真皮成纖維細(xì)胞的細(xì)胞對(duì)齊、伸長程度，在一定范圍內(nèi)會(huì)隨溝槽縱橫比單調(diào)增加。另外，Holle等［21］還發(fā)現(xiàn)胰腺癌細(xì)胞中的角蛋白細(xì)胞骨架能夠增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)溝槽深度的形態(tài)響應(yīng)，但沒有影響對(duì)寬度的響應(yīng)。綜上所述，與接觸引導(dǎo)相關(guān)的細(xì)胞形態(tài)變化與溝槽的脊寬、深度關(guān)系最為密切，但并不僅僅受上述兩種因素的影響，其最終效果取決于多種條件的協(xié)同作用。

除細(xì)胞形態(tài)變化外，細(xì)胞在溝槽圖案上的遷移運(yùn)動(dòng)也是研究的重點(diǎn)之一。在溝槽圖案化表面上培養(yǎng)時(shí)，許多細(xì)胞類型（如成纖維細(xì)胞、上皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成骨細(xì)胞、免疫細(xì)胞或神經(jīng)元）顯示出平行于溝槽的定向遷移，這與在光滑平面上觀察到的細(xì)胞隨機(jī)運(yùn)動(dòng)截然不同，并且細(xì)胞運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度取決于溝槽尺寸。表1歸納整理了部分研究中溝槽圖案的尺寸因素對(duì)細(xì)胞形態(tài)、運(yùn)動(dòng)的影響。

表1 微納米溝槽對(duì)細(xì)胞行為的影響Table 1 The effect of micro/nano grooves on cell behavior

另外，由于近年來制備技術(shù)的發(fā)展以及研究者們對(duì)多數(shù)溝槽圖案存在鋒利邊緣的不合理性產(chǎn)生爭議，越來越多的學(xué)者開始轉(zhuǎn)向研究彎曲/波浪形表面的微納米溝槽圖案。Linke等［31］在波長（峰間距離）為1.7～6.3μm的波浪形表面上培養(yǎng)成肌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞向圖案方向生長，并隨著波長的增加顯示出更明顯的取向。Song等［32］研究發(fā)現(xiàn)T細(xì)胞會(huì)優(yōu)先定位于波浪形溝槽圖案的凹面區(qū)域，并沿著溝槽方向遷移，當(dāng)溝槽波長從20μm增加到160μm時(shí)，T細(xì)胞的方向性和遷移速度均趨于消失；Cheng等［33］在血管內(nèi)皮細(xì)胞的培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象，并觀察到細(xì)胞在波長150μm的溝槽上仍能表現(xiàn)出一定的接觸引導(dǎo)現(xiàn)象。

各向異性的微納米圖案對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)影響的研究相對(duì)比較少見。Gwon等［34］使用聚己內(nèi)酯（PCL）材料設(shè)計(jì)的一種間距、高度均為5μm的放射狀溝槽圖案表面的骨修復(fù)移植支架，可以顯著促進(jìn)其上培養(yǎng)細(xì)胞的取向延伸、增殖和成骨分化（圖1）。本課題組將靜磁場(chǎng)組裝和凝膠化相結(jié)合制備了一種各向異性磁性水凝膠材料，可以提升所培養(yǎng)細(xì)胞的活力和多能性［35］。

圖1 放射狀溝槽圖案支架用于修復(fù)骨缺損［34］Fig.1 The radial groove pattern scaffold is used to repair bone defects［34］

3.2 各向同性微納米圖案

在再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中，多數(shù)支架都會(huì)采用各向同性孔洞結(jié)構(gòu)，以增強(qiáng)細(xì)胞浸潤，促進(jìn)新組織生長。在隨機(jī)圖案化基底上培養(yǎng)時(shí)，理論上細(xì)胞將不會(huì)出現(xiàn)接觸引導(dǎo)等有取向性的現(xiàn)象。與在凹槽上觀察到的細(xì)長形態(tài)相反，當(dāng)各向同性圖案表面的特征尺寸在微米范圍內(nèi)時(shí)，細(xì)胞會(huì)表現(xiàn)出分支形態(tài)。細(xì)胞的形變、粘附程度與圖案類型及尺寸有著直接關(guān)聯(lián)。Zhou［36］在聚二甲基硅氧烷（PDMS）微納米孔圖案上培養(yǎng)Hela細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)微納米孔直徑在1～12μm之間時(shí)，細(xì)胞膜較容易發(fā)生變形，變形程度與孔深度成正比，并且細(xì)胞粘附性顯著上升。Lim等［37］的研究發(fā)現(xiàn)，與85 nm的島狀結(jié)構(gòu)及平面聚苯乙烯（PS）基底相比，在高度為11 nm的島狀結(jié)構(gòu)上培養(yǎng)成骨細(xì)胞時(shí)，細(xì)胞的粘附性以及堿性磷酸酶（ALP）活性都有一定提升。

各向同性圖案表面也會(huì)對(duì)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)產(chǎn)生影響。Nasrollahi等［38］通過在氧化鋁膜內(nèi)部制備相同間距直徑分別為40、80 nm的孔狀圖案，觀察到成纖維細(xì)胞在較大孔上的遷移速度更快。Jeon等［39］使用具有不同密度納米孔圖案的材料培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，觀察到細(xì)胞向高密度區(qū)域遷移，表明高納米孔密度可增強(qiáng)細(xì)胞運(yùn)動(dòng)。

細(xì)胞粘附配位體的尺度及空間分布能夠影響細(xì)胞功能的實(shí)現(xiàn)。Arnold等［40］利用不同間距的環(huán)狀RGD（由精氨酸、甘氨酸和天冬氨酸組成）多肽包覆金納米圓點(diǎn)圖案進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)配位體間距超過73 nm時(shí)會(huì)顯著降低成骨細(xì)胞粘附、延展和焦點(diǎn)粘連的形成，而較小的空間間距則有助于整聯(lián)蛋白的聚集和活化。Huang等［41］在有序/無序RGD環(huán)肽納米圖案上培養(yǎng)成骨細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)當(dāng)配體間距大于70 nm時(shí)，細(xì)胞在有序RGD納米圖案上不會(huì)發(fā)生粘附，而在無序圖案上仍會(huì)出現(xiàn)。Oh等［42］研究發(fā)現(xiàn)直徑約30 nm的TiO2納米管能夠提升表面培養(yǎng)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的粘附性，但對(duì)分化無明顯影響，而直徑約70～100 nm的納米管會(huì)促進(jìn)細(xì)胞向成骨方向分化。Chen等［43］在PDMS基底上制備了直徑1.83μm、間距4μm的均勻微米柱圖案，結(jié)果表明間充質(zhì)干細(xì)胞在較硬的基底上傾向于向成骨方向分化，而在較軟的基底傾向于向成脂肪方向分化。

表2展示了幾種各向同性圖案對(duì)細(xì)胞行為的調(diào)控作用。由于各向同性圖案存在形狀、尺寸、分布等多種可調(diào)節(jié)因素，故難以橫向比較。從目前研究可以得出的結(jié)論是，較小的納米形貌尺度（約10 nm高或深）對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)功能的影響更顯著，當(dāng)尺度增大至約100 nm時(shí)，這種影響將變?nèi)跎踔料А?/p>

表2 各向同性的圖案化表面對(duì)細(xì)胞行為的影響Table 2 The effect of isotropic patterned surface on cell behavior

3.3 復(fù)雜微納米圖案

至今為止，材料表面圖案對(duì)細(xì)胞行為影響的研究已經(jīng)取得了不少成果，然而大部分實(shí)驗(yàn)仍基于簡單表面圖案進(jìn)行。但單一尺度的結(jié)構(gòu)并不符合自然界中多數(shù)細(xì)胞的生長環(huán)境，細(xì)胞依附的表面通常為不同尺度、多級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)合狀態(tài)。隨著材料表面修飾技術(shù)的快速發(fā)展，研究者們開始將目光轉(zhuǎn)向混合、復(fù)雜圖案對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生的多重影響。與單一結(jié)構(gòu)相比，微納多級(jí)結(jié)構(gòu)可以發(fā)揮協(xié)同生物效應(yīng)，多尺度精確調(diào)控細(xì)胞的生物學(xué)行為。

混合、復(fù)雜圖案結(jié)構(gòu)能在一定程度上更好地模仿細(xì)胞外基質(zhì)中的復(fù)雜形貌結(jié)構(gòu)，有利于仿生生物材料的設(shè)計(jì)和應(yīng)用。Guo等［48］通過水肽噴墨打印和位點(diǎn)特異性生物礦化相結(jié)合的方法，制備了一種具有微米溝槽和納米二氧化硅復(fù)合多級(jí)結(jié)構(gòu)表面的水凝膠材料，該微納復(fù)合結(jié)構(gòu)系統(tǒng)能夠在誘導(dǎo)人間充質(zhì)干細(xì)胞沿溝槽方向生長、排列的同時(shí)，促進(jìn)細(xì)胞的成骨分化。Oyunbaatar等［49］發(fā)現(xiàn)與常規(guī)光滑的微柱陣列相比，在多級(jí)蘑菇型PDMS微柱陣列上培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肌動(dòng)蛋白聚合更為顯著，收縮力增強(qiáng)約20%。

細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)相互作用的一項(xiàng)重要機(jī)制是整合素與細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)的相互作用。因而，可以通過表面化學(xué)修飾的方法控制細(xì)胞與材料的結(jié)合位點(diǎn)。目前常用的自組裝方法是在無機(jī)材料表面形成一層有序的有機(jī)分子膜，再根據(jù)需要在有機(jī)分子層上修飾相應(yīng)的化學(xué)官能團(tuán)，從而實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能的調(diào)控。使用較多的有機(jī)分子有疏水烴基硫醇、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白、RGD［50］等。本課題組采用層層自組裝方法（LBL）制備的γ-Fe2O3/PLA復(fù)合多層結(jié)構(gòu)材料，可以通過磁效應(yīng)促進(jìn)小鼠骨髓細(xì)胞的生長以及成骨分化（圖2）［51］。另外還制備出一種磁性水凝膠，可以有效模仿ECM，用作新型多細(xì)胞球體培養(yǎng)平臺(tái)，且在一定范圍內(nèi)調(diào)節(jié)凝膠內(nèi)磁性納米顆粒濃度可控制細(xì)胞粘附程度及細(xì)胞間的相互作用［52］。

圖2 磁性納米顆粒組裝薄膜對(duì)細(xì)胞作用機(jī)制的示意圖［51］Fig.2 Schematic showing of the mechanism for effect of the assembled film of magnetic nanoparticles on the cells［51］

4 總結(jié)與展望

微納米表面圖案化技術(shù)一直是研究材料與細(xì)胞相互作用的重要方法之一，通過使用不同幾何拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的圖案，調(diào)節(jié)并研究不同細(xì)胞的行為和功能，可以探知具體作用原理。隨著微納米圖案化技術(shù)的發(fā)展，后續(xù)的研究重心主要有以下幾個(gè)方面：（1）圖案化與外部作用力相結(jié)合，如電場(chǎng)、磁場(chǎng)，以通過這些復(fù)合作用更有效地控制細(xì)胞生理行為；（2）智能材料的運(yùn)用，如利用溫敏材料形成微納米表面圖案，使材料能夠?qū)ν饨缱兓龀鲰憫?yīng)，更精確地調(diào)控細(xì)胞；（3）體內(nèi)環(huán)境下表面圖案化對(duì)細(xì)胞調(diào)控的可行性。近年來越來越多的研究關(guān)注于三維結(jié)構(gòu)對(duì)細(xì)胞的影響，這些研究對(duì)組織工程與再生醫(yī)學(xué)領(lǐng)域所使用材料的設(shè)計(jì)及應(yīng)用都將具有重大指導(dǎo)意義。