李 瑩，錢美齊，邱 雪，2*

（1.中國海洋大學 海洋藥物教育部重點實驗室，醫(yī)藥學院，山東 青島 266003；2.青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室，山東 青島 266237）

阿爾茲海默癥（Alzheimer's disease，AD）是一種漸進性癡呆癥，目前影響全球超過5 000萬人，預計到2050年將影響1.5億人［1］。由于AD的致病機理尚未被完全闡明，針對AD的上市藥物主要為癥狀緩解類，疾病修正類藥物極少，因此目前人類尚無治愈AD的方法，其中一個很重要的原因在于我們尚未檢測到疾病時，它已發(fā)生不可逆進展，并產(chǎn)生明顯的記憶喪失和神經(jīng)功能下降。疾病早期診斷的生物標志物對通過早期干預策略延緩疾病或改變疾病進程甚至預防疾病都至關重要［2－5］。本文將總結經(jīng)典的和近年來新發(fā)現(xiàn)的AD生物標志物，并調研針對這些生物標志物發(fā)展的新的檢測技術。

1 AD核心標志物

1.1 β-淀粉樣蛋白

β-淀粉樣蛋白（Amyloidβ-protein，Aβ）是由淀粉樣前體蛋白（Amyloid precursor protein，APP）經(jīng)β-分泌酶和γ-分泌酶介導裂解產(chǎn)生的肽，有37～43個氨基酸殘基，是一個非常古老的、保守的分子序列［6－8］。Aβ是一種無序的蛋白，缺乏穩(wěn)定的三維結構，其分子的生命周期為從單體到低聚形式到原纖維［9］。

Aβ的生理效應表現(xiàn)為濃度依賴性，即生理濃度下有助于記憶鞏固；但病理濃度時會抑制記憶功能［9］。Aβ單體通過激活煙堿乙酰膽堿受體來調節(jié)突觸功能，因此Aβ單體穩(wěn)態(tài)對正常的突觸功能至關重要。超過一個臨界濃度（納摩爾范圍）時，單體開始聚集成不同的Aβ聚集體［10］。普遍認為Aβ的合成與清除之間的不平衡導致Aβ的積累，引發(fā)了AD。從AD患者的腦脊液中共鑒定出26種Aβ蛋白形態(tài)，其中分別含有40和42個氨基酸殘基的Aβ1－40和Aβ1－42是累積的Aβ的主要成分。Aβ1－42具有更大的疏水性從而更易聚集［11］，被認為是腦內老年斑起始的罪魁禍首。Aβ1－42水平或比例的增加會誘導Aβ淀粉樣纖維形成，積累的Aβ淀粉樣纖維發(fā)展為腦內老年斑，并導致神經(jīng)毒性［12］。Aβ聚集物能夠激活半胱氨酸蛋白酶，該酶能夠切割tau蛋白，使正常的tau蛋白構象發(fā)生變化，導致tau蛋白不能與微管結合而聚集，誘導tau蛋白病理的產(chǎn)生而引發(fā)AD［13］。

目前測定大腦中Aβ的常用方法是腦脊液分析和正電子發(fā)射斷層掃描技術（Positron emission computed tomography，PET），但這兩種技術的侵入性和昂貴的費用限制了其應用。因此，通過外周體液研究Aβ受到廣泛關注［14］。Aβ單體可以通過多種方式從大腦清除到血液，例如血腦屏障清除系統(tǒng)和腦脊液吸收清除循環(huán)系統(tǒng)等［14－15］。但是由于血漿中Aβ1－42的濃度較低，不同的檢測技術之間的靈敏度不同導致結果之間存在較大的差異［16］。

1.2 tau蛋白

tau蛋白是大腦中最常見的微管蛋白，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達，在遠端軸突中以六種亞型存在于人類腦中，是軸突細胞骨架的重要結構元件［17－18］。tau蛋白的翻譯后修飾包括磷酸化、硝化、乙?；⒎核鼗?、甲基化等，這些翻譯后修飾與AD的發(fā)病機制相關［19］。tau蛋白包含多個磷酸化位點，目前已通過質譜鑒定出超過47個磷酸化位點，主要位于其C端和脯氨酸結構域［19－20］。細胞內磷酸化tau蛋白（Phosphorylated tau，p-tau）形成的聚集體將導致微管功能、軸突運輸功能損傷和神經(jīng)細胞骨架破壞以及神經(jīng)元病變［21］。激酶和磷酸化酶可分別誘導tau蛋白磷酸化和去磷酸化，tau蛋白磷酸化受多種蛋白激酶和磷酸化酶的調控［20］。磷酸化和蛋白質去磷酸化之間的失衡將導致該蛋白與微管的結合受損，以及神經(jīng)原纖維纏結的形成。p-tau蛋白的結構還可能受到Aβ、氧化應激、神經(jīng)炎癥等的影響［22］。

腦脊液（Cerebrospinal fluid，CSF）中總tau蛋白（Total-tau，t-tau）和p-tau蛋白升高是AD的明確標志［23］?？扇苄詐-tau181和t-tau的濃度在顯性遺傳性AD和散發(fā)性AD的癥狀出現(xiàn)前就開始增加［24］。腦脊液中的t-tau蛋白、p-tau蛋白和Aβ1－42可以預測輕度認知障礙（Mild cognitive impairment，MCI）和早期AD，具有較高的敏感性和特異性［25］。與腦源性血清外泌體相關的t-tau蛋白和p-tau蛋白可以更準確地區(qū)分輕度AD和MCI［26］。此外還發(fā)現(xiàn)，這些血清外泌體相關蛋白的水平升高可以預測長期的認知能力下降［21］。

2 AD新型生物標志物

2.1 載脂蛋白E基因

載脂蛋白（Apolipoprotein，Apo）是血漿脂蛋白中的蛋白質成分，主要有A、B、C、D、E五大類，能夠結合和運輸脂質到機體各組織進行代謝及利用，在神經(jīng)元的生長、修復、重組和保護中也具有重要作用。研究表明，與AD關系最為緊密的是載脂蛋白E（ApoE），ApoE 112位和158位兩個氨基酸的不同使之可形成3種ApoE亞型：ApoEε2、ApoEε3、ApoEε4，分別由3個常見的等位基因（ε2、ε3、ε4）編碼。其中，ApoEε4可顯著增加患AD的風險，這使得攜帶ApoEε4等位基因的AD患者發(fā)病年齡更早，并且傾向于有更明顯的神經(jīng)纖維纏結和淀粉樣斑塊聚集［27］，然而ApoEε4對AD風險的潛在機制尚不明確；ApoEε3等位基因是最常見的基因變體，可能會導致長期炎癥反應；ApoEε2等位基因與降低AD的發(fā)病風險相關，可以減少神經(jīng)纖維纏結和淀粉樣斑塊的積累?？偟膩碚f，ApoE對AD患者大腦有調節(jié)作用［28］。進一步的研究結果表明，大腦中的TOMM40－APOE基因座在調控ApoE水平和AD神經(jīng)病理學方面具有復雜的作用［29］。研究者通過分析腦脊液的ApoE水平與ApoE的基因變異和臨床特征，發(fā)現(xiàn)腦脊液ApoE水平具有性別特異性，表明腦脊液ApoE可能以性別特異性的方式參與AD病理的發(fā)病機制［30－31］。在ApoEε2對AD的預防作用方面，有研究表明ApoEε2已被確定為長壽基因，其對衰老過程具有系統(tǒng)性影響，然而ApoEε2并非完全有益，其攜帶者患某些腦血管疾病的風險顯著增加［32］。

2.2 β-分泌酶1

β-分泌酶1（Beta-site app cleaving enzyme 1，BACE1），即β-淀粉樣前體蛋白裂解酶1，是在外周神經(jīng)細胞中形成髓鞘的一種重要的天冬氨酸蛋白酶，亦是促進Aβ形成的關鍵酶，是一個包含兩個活性位點的跨膜蛋白，可在細胞外形成二聚體。在AD患者腦脊液中，BACE1蛋白濃度和活性均升高，并且其升高程度與海馬體體積縮小相關。此外，在MCI向AD轉化的患者腦脊液中也發(fā)現(xiàn)BACE1的活性升高，已經(jīng)達到AD患者中BACE1活性的同等水平。研究人員發(fā)現(xiàn)，MCI時期患者的組織中BACE1的活性與對照組相比顯著增加27%，但優(yōu)于AD現(xiàn)有的臨床診斷指標，可能是AD神經(jīng)功能障礙或病變的早期指標，也可能作為治療AD的靶標［33］。此外，有研究發(fā)現(xiàn)在最終轉化為AD的MCI患者血液中BACE1酶的活性更高，而未轉化為AD的MCI患者血液中的BACE1活性相對較低，表明檢測血液中BACE1的活性可在MCI階段預測AD的發(fā)生及發(fā)展［34］。

2.3 早老素

早老素（Presenilin，PSEN）有兩個亞型，即PSEN1和PSEN2，是兩個同源的多跨膜蛋白，有約67%的同源序列，其同源序列為γ-分泌酶的催化核心。Braggin等［35］報告了早發(fā)性AD病例中一種罕見的PSEN2移碼變體（PSEN2 p.K115Efs*11），其γ分泌酶活性異常，表明PSEN2 K115Efs*11可能是與AD相關的致病性變體，提示了PSEN變異可能是AD發(fā)病的潛在機制。PSEN1和PSEN2基因突變是家族性早發(fā)型AD最常見的原因，特別是PSEN1基因。這兩個基因的突變通常會引起γ-分泌酶活性的破壞，可促使APP形成有致病性的Aβ，進而導致Aβ1－42過度產(chǎn)生或Aβ1－40產(chǎn)生不足，或者兩種情況同時存在，最終導致Aβ1－42和Aβ1－40之間的比值增加［36］。研究發(fā)現(xiàn)，大腦中的神經(jīng)元信號，特別是鈣離子（Ca2+）信號受PSEN調節(jié)，并受其基因突變的影響，而細胞內的Ca2+信號不僅控制神經(jīng)元的活動，還影響基因的表達模式、細胞骨架的結構功能、突觸的信號傳導；此外PSEN對AD的細胞氧化應激和細胞活力也有一定的調節(jié)作用［37－38］。

2.4 小膠質細胞受體（CD33）

CD33是一種介導細胞－細胞相互作用的細胞表面受體，為唾液酸結合受體跨膜蛋白家族中的一種，是細胞生長和存活的重要受體，也是網(wǎng)格蛋白非依賴性內吞途徑以及先天性和適應性免疫系統(tǒng)功能的關鍵受體［39］，其基因多態(tài)性與晚發(fā)型AD有關［40］，有證據(jù)表明小膠質細胞中CD33的表達情況和淀粉樣斑塊負荷與認知功能相關［41］。另有研究顯示，CD33的多態(tài)性可通過使腦組織中海馬回和海馬旁回的神經(jīng)元變性而增加AD發(fā)病的風險［42］。然而CD33唾液酸結合域的表達下調可降低AD發(fā)生的風險，因此抑制CD33是一種有效的抑制AD病情發(fā)展的途徑，CD33上的唾液酸結合位點是一個有前景的藥效團［40］。

2.5 神經(jīng)絲輕鏈蛋白

神經(jīng)絲輕鏈蛋白（Neurofilament light chain，NfL）是細胞骨架蛋白的一種，其主要功能是維持軸突功能和穩(wěn)定的神經(jīng)傳導，是軸突損傷的非特異性標志物。正常生理條件下軸突釋放少量的Nf L，但在病理條件下NfL的釋放量顯著增加，腦脊液和血液中的NfL濃度與神經(jīng)病變程度密切相關。臨床研究表明具有患AD風險的人群在發(fā)病之前有比正常情況下更高的NfL水平，而且血液和腦脊液中的NfL水平早在這些患者開始出現(xiàn)神經(jīng)病變癥狀之前（疾病發(fā)作前16年）就開始上升［43］。研究結果顯示在有遺傳風險的非癡呆個體中，血漿NfL水平、認知能力和tau病理學三者之間存在關聯(lián)，這些個體可能會發(fā)展為AD［44］。然而NfL水平在許多神經(jīng)退行性疾病中均會升高，并不具有疾病特異性，因此是否可將其作為AD診斷的標志物尚待考究，但其在判斷疾病分期、預測疾病進展和疾病預后中仍有一定的價值［44］。

2.6 補體系統(tǒng)與激肽系統(tǒng)

AD與突觸缺失密切相關，而補體系統(tǒng)已被證明參與突觸的清除。一些研究指出AD與補體系統(tǒng)之間存在關聯(lián)。與未發(fā)展為AD的MCI相比，AD患者腦脊液中補體C3和補體C4的水平升高，這些結果表明異常的補體水平可影響AD的發(fā)展過程，故可將其作為AD診斷的生物標志物［45］。此外Aβ蛋白可激活血漿的激肽系統(tǒng)，導致激肽釋放酶介導的完整的高分子量激肽原（HKi）被切割成裂解的高分子量激肽原（HKc），可通過Western blot觀察到AD患者血漿的HKi分裂增加，HKc濃度升高［46］。

2.7 microRNA

microRNA（miRNA）是一類內源基因編碼的長度約為22個核苷酸的非編碼單鏈RNA，參與轉錄后基因表達調控。異常的miRNA水平通過調控AD相關病理蛋白影響AD的疾病發(fā)展過程，不同類別的miRNA水平上調或下調均會影響AD的發(fā)展過程，進而可影響AD患者體內Aβ或tau蛋白的水平。miRNA主要通過調控APP的表達、剪切以及相應酶的活性改變Aβ水平。相關研究顯示，與對照組相比，MCI和AD組的miR－193b、miR－101、miR－124的水平降低，與Aβ水平呈負相關，這些miRNA的表達水平降低可使APP表達增加或者促進APP外顯子剪切，進而影響患者體內Aβ的水平［47－49］；此外，影響B(tài)ACE1活性和表達量的miRNA表達水平改變也會影響Aβ的合成，miR－29c、mi R－195、miR－124基因表達的下調可通過調節(jié)BACE1蛋白水平、促進Aβ合成及細胞損傷等途徑促進Aβ斑塊的形成［50－52］。已有研究表明miRNA也會通過影響tau蛋白的合成進而影響AD的發(fā)生、發(fā)展，其中，miR－219表達水平下調可抑制tau的合成，miR－132/212水平下調將增加tau的表達和磷酸化，miR－34a水平上調會促進內源性tau表達，miR－128水平上調則促進tau的降解和聚集，miR－125b表達水平上調可促進tau的磷酸化［53－56］。除此之外，外周血中多種miRNAs水平顯著變化也可作為AD的診斷指標，但其診斷價值未被大規(guī)模臨床研究證實。

2.8 金屬離子

2.8.1 鐵離子鐵是大腦中含量最豐富的過渡金屬，參與神經(jīng)遞質合成（如血清素、去甲腎上腺素和多巴胺）、髓鞘生成、神經(jīng)元發(fā)育等生理過程。然而，鐵在AD患者大腦中的積累和在皮質中的異常分布被認為是AD的致病因素，研究者已經(jīng)確認鐵蓄積的程度與腦組織中Aβ斑塊的數(shù)量、tau病理學以及AD疾病分期相關［57－58］。鐵的異常分布導致的鐵穩(wěn)態(tài)失調是AD的一個特征，鐵可以通過促氧化劑分子（例如羥基自由基等）與AD病理學蛋白（淀粉樣前體蛋白和tau蛋白）相互作用，進一步促進蛋白聚集；鐵還可以與AD中的tau蛋白結合，通過與神經(jīng)原纖維纏結的相互作用增強tau蛋白的毒性，并誘導這些纏結的積累，這些病理變化與AD的發(fā)展和認知能力下降有關［59－60］。

2.8.2 銅離子銅既是氧化劑又是抗氧化劑，在機體內主要起催化作用。許多含銅金屬酶作為氧化酶，參與體內氧化還原過程，已被證實在人體中有重要的生理功能。銅離子對AD的發(fā)生發(fā)展具有一定的作用，在AD患者腦組織中，銅離子的穩(wěn)態(tài)失調對Aβ和tau蛋白的生理活性有一定的影響；此外，AD患者腦內銅離子水平和定位會發(fā)生較大變化，淀粉樣沉積物中有銅離子的積累，而一些腦組織區(qū)域的銅離子水平則不足。APP和Aβ均具有銅離子結合位點，可通過與銅離子發(fā)生相互作用產(chǎn)生活性氧導致神經(jīng)毒性；此外，AD患者的銅代謝會發(fā)生系統(tǒng)性變化，腦內銅離子水平的改變也可能影響AD的神經(jīng)炎癥過程［61］。

2.8.3 鋅離子鋅是人體中樞神經(jīng)系統(tǒng)（Central nervous system，CNS）中第二豐富的微量元素，老年人和AD患者存在鋅穩(wěn)態(tài)受損的情況［62］。越來越多的證據(jù)表明，鋅離子可以導致大腦中的Aβ沉積和老年斑形成，因此大腦中的鋅離子水平亦可作為AD的病理特征指標［63］。

3 檢測方法

3.1 臨床診斷方法

現(xiàn)階段對于AD的臨床診斷大多基于四個方面，分別為基于量表的認知功能評估、PET、腦脊液診斷以及危險基因ApoE檢測。老年癡呆診斷測試量表常用Mini－Mental State Examination，即MMSE，可評估記憶和其他認知功能，是目前最具影響的認知缺損篩選工具之一。MMSE置信度良好，總分與患者CT的腦萎縮呈正相關；PET顯像屬于分子顯像和功能顯像范疇，可通過向病人體內注射成像劑（如18F－FDG、18F－FDDNP、11C－PBBB3、11C－PIB3等），直觀地顯示患者的神經(jīng)元突觸功能、Aβ沉積、tau蛋白磷酸化程度、多種神經(jīng)遞質和受體變化情況等；腦脊液診斷是一種有創(chuàng)性檢查，通過腰椎穿刺，從脊椎骨間隙抽取一定量的腦脊液進行檢測，AD患者腦脊液中的Aβ42水平明顯低于正常人，小于550 pg/mL，而tau蛋白水平明顯高于正常人，一般大于375 pg/mL，結合檢測腦脊液的Aβ42和tau水平可診斷無癥狀AD，準確率可達90%左右［64］；ApoE危險基因檢測是通過檢測患者體內ApoE基因的表達情況預測和推斷病人患AD的風險，ApoE基因檢測結果分為一般風險型、較低風險型和較高風險型3類，可反映受試者患AD的風險情況。

3.2 臨床診斷試劑盒

現(xiàn)有的臨床診斷試劑盒大多以Aβ42和tau蛋白作為診斷標志物，少有基于其他新型生物標志物開發(fā)的診斷試劑盒，國內外臨床診斷公司均有生產(chǎn)和開發(fā)AD檢測試劑盒。

國內的診斷公司主要包括先聲診斷、豪思生物、貝格爾生物等多家生物公司。先聲診斷提供兩款AD診斷試劑盒，其一為運用ELISA方法進行腦脊液中4種生物標志物（Aβ1－42、Aβ42/Aβ40、t－tau、p－tau181）的檢測，其二為利用基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜，通過受試者外周血基因型分析進行ApoE基因高風險人群鑒別。而豪思生物正在研發(fā)的AD診斷試劑盒是采用液相色譜串聯(lián)質譜（LC－MS/MS）技術檢測受試者血漿中的8種AD相關生物標志物，該試劑盒希望通過外周血測試幫助臨床醫(yī)生進行AD的早期診斷、疾病分期，監(jiān)測癡呆疾病進程和評價治療效果。貝格爾生物公司正在與海外科研團隊合作研究基于血清外泌體的AD診斷技術，與PET－Aβ等臨床診斷“金標準”結果相比，AD相關血清外泌體生物標志物顯示出較好的靈敏度與特異性［65］。該公司正在進行大規(guī)模臨床樣品測試?？梢钥闯觯瑖鴥鹊纳锕緦τ贏D檢測試劑盒的研發(fā)尚處于起步階段，簡便、高效、準確的檢測試劑盒有待開發(fā)。

海外生物公司生產(chǎn)的AD診斷試劑盒也主要基于傳統(tǒng)的生物標志物，其中拜爾公司開發(fā)的試劑盒通過檢測腦脊液中的Aβ1－42、t－tau和p－tau水平進行AD診斷；德國歐蒙公司以及Fujirebio公司的檢測項目為腦脊液中的Aβ1－40/Aβ1－42、p－tau181、t－tau等；Quanterix公司的試劑盒可通過患者腦脊液或血液樣本測定AβAβ1－40/Aβ1－42、p－tau181、t－tau的含量，進而進行AD的臨床診斷；而Seebio公司可檢測組織上清液、組織勻漿、腦脊液、血漿等樣品，但其測量只限于科研用途，不用做臨床診斷，其檢測的生物標志物主要為Aβ1－42。

3.3 新型檢測技術研究進展

3.3.1 基于免疫反應的AD早期診斷Chen等［66］通過單分子陣列（Single-molecule array，Simoa）免疫法檢測血清、血漿和CSF中的p－tau181，其靈敏度比ELISA高出1 000倍以上。該技術直接將蛋白質檢測技術帶入到單分子、數(shù)字化檢測時代，能夠進行超低豐度蛋白質的檢測［43］。通過單克隆抗體捕獲p－tau181，再加入生物素標記的tau蛋白抗體進行檢測，發(fā)現(xiàn)AD患者血漿中的p－tau181水平是對照組的2倍，腦脊液中的p－tau181水平是對照組的10倍。

Budde等［67］開發(fā)了一種可重復使用的表面免疫紅外傳感器，用于檢測人腦脊液中的Aβ和tau蛋白。該傳感器的關鍵元件是表面具有化學修飾的衰減全反射（Attenuated total reflectance，ATR）晶體，可將生物標志物從體液中捕獲出來。傳感器表面用免疫球蛋白結合蛋白A或蛋白G共價包被，蛋白A和蛋白G能夠與IgG抗體Fc恒定區(qū)發(fā)生高親和力相互作用，該相互作用與常規(guī)N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）偶聯(lián)相比具有更強的特異性，并且可通過化學處理（例如pH值變化）逆轉。蛋白A和蛋白G可用于抗體的非共價結合和抗原的分析，因此這種免疫平臺可以與蛋白A和G的所有抗體聯(lián)合使用。這種檢測方法為快速分析AD患者血液和CFS樣本提供了一個可逆平臺。

Kim等［68］將一種具有Tau－381亞型特異性的DNA適配體和抗體應用于表面等離子體共振平臺上（Surface plasmon resonance platform，SPR）進行人血漿中Tau－381亞型的濃度分析，檢測限為10 fmol/L。通過與商品化的ELISA試劑盒進行比較發(fā)現(xiàn)，該檢測方法的性能增強了1 000倍，同時還能夠測量ELISA無法測量到的2 pmol/L的濃度。

3.3.2 基于熒光的AD早期診斷Zhang等［69］首次以丁酰膽堿酯酶（Butyrylcholinesterase，BChE）和活性氧（Reactive oxygen species，ROSs）為雙靶點，亞甲藍作為熒光指示劑進行AD的早期診斷。環(huán)丙基甲酸酯是BChE的特異性反應位點，而水解之后暴露的羥苯基碳酰胺則作為ROS氧化還原的基團。此探針使BChE催化的酶水解反應與ROS誘導的氧化還原反應發(fā)生偶聯(lián)，在酶水解和氧化還原兩個因素的共同作用下，亞甲藍產(chǎn)生熒光。該雙靶點探針還可避免假陽性反應。

Zhang等［70］開發(fā)了一種四價十字形DNA納米結構介導的級聯(lián)催化發(fā)夾結構擴增反應，用于Aβ低聚物的檢測。兩個DNA納米結構的末端分別被修飾上帶有熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，F(xiàn)RET）供受體探針的DNA發(fā)夾結構，作為整個檢測的信號放大部分。他們還設計了一個能夠識別Aβ低聚物的DNA識別發(fā)卡和一個在打開后能夠釋放與DNA納米結構結合的DNA單鏈的激活發(fā)夾。當Aβ低聚物存在時，識別發(fā)夾與激活發(fā)卡結合釋放出激活發(fā)卡的DNA鏈，該鏈能夠觸發(fā)DNA納米結構中的發(fā)夾打開，產(chǎn)生FRET信號，對Aβ低聚物的檢測限為0.69 pmol/L。

3.3.3 基于探針成像的AD早期診斷發(fā)射波長在近紅外范圍內的熒光探針允許光穿透組織，同時可以避免生物自發(fā)熒光。近紅外熒光（Near-infrared fluorescence，NIRF）已經(jīng)成為光學成像的首選工具。Seo等［71］設計了一種近紅外熒光探針，該探針以不同的構象與tau聚集物、Aβ聚集物結合，且只有與tau聚集物識別時的構象可以產(chǎn)生熒光。同時該探針表現(xiàn)出分子轉子特性，隨著溶液黏度的增加，探針的熒光強度增加。

Ge等［72］設計了一種熒光壽命探針，該探針以兩個鋅吡啶胺作為識別單元，可以與p－tau的磷酸化位點特異性結合，通過光致電子轉移機制（Photoinduced electron transfer mechanism，PET）實現(xiàn)神經(jīng)元細胞內p－tau蛋白的熒光壽命成像。

3.3.4 基于電化學的AD早期診斷Duan等［73］通過在多孔11-巰基十一碳酸（Mercapto undecanoic acid，MUA）修飾的Au電極上覆蓋平面雙層脂質膜（Bilayer lipid membrane，BLM）構建了電化學生物傳感器，根據(jù)可溶性低聚Aβ1－42（Low－mass，soluble oligomers，L－Aβ42O）和可溶性低聚Aβ40（L－Aβ40O）誘導BLM損傷的動態(tài)差異，基于電化學阻抗譜（Electrochemical impedance spectroscopy，EIS）實現(xiàn)了兩者的選擇性測定。Au電極上的MUA層放大了與膜損傷相對應的抗阻信號，提高了檢測靈敏度。BLM的弱電荷表面可以降低CFS中其他蛋白的非特異性吸附。該傳感器可在20 min內實現(xiàn)L－Aβ42O的測定，線性范圍為5～500 pmol/L，檢測限為3 pmol/L；可在60 min內測定L－Aβ40O，線性范圍為60 pmol/L～6.0 nmol/L，檢測限為26 pmol/L。

3.3.5 基于納米材料的AD早期診斷Hadjidemetriou等［74］使用納米粒獲得血漿中的蛋白冠，監(jiān)測了血漿蛋白質組隨AD進展的變化。由于納米粒與體液孵育時，可以自發(fā)在表面捕獲數(shù)百種蛋白質形成蛋白冠，因此可通過蛋白冠深入分析血漿蛋白質組。通過LC－MS對所得的蛋白冠進行分析，發(fā)現(xiàn)在Aβ斑塊形成前，AD患者血漿蛋白質組的豐度開始出現(xiàn)波動，并可以根據(jù)豐度變化確定疾病分期。

Iglesias－Mayor等［75］將雙功能Au@Pt/Au核@殼納米粒作為電化學免疫傳感的新型標簽，基于水氧化反應過程產(chǎn)生的催化電流的變化檢測p53的構象變化，方法在血漿中的檢測限為66 nmol/L。構象改變的p53在輕度認知障礙患者中表達，并與認知障礙的進展呈正相關［76］。在Au@Pt納米粒表面的Au突起使納米粒更易與抗體進行生物偶聯(lián)，且Au與Pt在納米粒表面的協(xié)同作用可提高催化活性，進而提高檢測的靈敏度。

Vilela等［77］開發(fā)了一種基于上轉換納米顆粒－石墨烯氧化物的光學傳感器，可特異性檢測與AD相關的mi RNA。該傳感器將近紅外光上轉換與低背景光子計數(shù)相結合，能夠可靠地檢測fmol/L范圍內的少量小寡核苷酸序列。即使在血漿和細胞裂解液等復雜介質中，該傳感器對特定靶標同樣具有高度的選擇性。

Zhang等［78］構建了一個多路復用的表面增強拉曼散射（Surface-enhanced Raman scattering，SERS）生物傳感器，用于檢測Aβ1－42低聚物和tau蛋白。他們將一段用于靶標識別的適配體和一段用于修飾在金納米粒子（AuNPs）表面的polyA偶聯(lián)，當靶蛋白與適配體特異性結合后，polyA寡核苷酸會偏離AuNPs，破壞溶液中納米偶聯(lián)物的穩(wěn)定性，引發(fā)相鄰AuNPs之間的等離子體共振耦合效應，進而實現(xiàn)蛋白質生物標志物的SERS檢測。該生物傳感器能夠在15 min內完成檢測，并可以同時檢測tau蛋白和Aβ1－42低聚物。

3.3.6 基于miRNA檢測的AD早期診斷Dong等［79］首先采用高通量Solexa測序篩選AD血清miRNA的全基因組表達譜，然后采用個體水平的多重RT－qPCR檢測確定AD的特異性miRNA譜。與對照組相比，AD患者血清中有4種miRNA（miR－31、mi R－93、mi R－143和miR－146a）顯著減少，MCI中的miR－93和miR－146a顯著升高，可作為通過外周血進行AD診斷的依據(jù)。

Chandrasekaran等［80］使用一種名為miRacles的技術進行AD相關RNA的檢測。當識別目標miRNA后，DNA納米結構由線型變成環(huán)狀結構，由于線型結構和環(huán)狀結構的電泳速率存在差異，因此能夠通過電泳讀數(shù)報告其開/關狀態(tài)，實現(xiàn)miRNA的檢測。該方法能夠直接檢測天然miRNA，不需要擴增、標記以及酶的催化。該研究篩選了56種與AD相關的miRNA，發(fā)現(xiàn)其中4種在AD患者腦中表達存在異常。該納米開關對與AD相關的mi R－107具有fmol/L級的靈敏度。

4 結 論

綜上所述，現(xiàn)階段被用于AD診斷的生物標志物，包括腦脊液tau蛋白和β淀粉樣蛋白水平，以及能反映結構和功能的PET成像等。但在通過早期診斷來干預AD的發(fā)展中作用有限，因為這些方法侵入性高，費用昂貴，受眾群體較小?；谕庵苎纳飿酥疚锸歉玫倪x擇，但由于血腦屏障的存在，腦脊液中各種疾病相關蛋白的表達量與外周血中相關蛋白的表達量可能相差甚遠，現(xiàn)階段尚無滿足AD的血清學早期診斷靈敏度和特異性需求的生物標志物供臨床應用。但越來越多的生物標志物可用于AD的診斷，相關研究也日益深入，日后有望開發(fā)出新的便捷、靈敏、高效、準確的基于外周體液的AD分子診斷方法，以實現(xiàn)無創(chuàng)、傷害性小的輔助診斷。發(fā)掘疾病相關性高的外周體液生物標志物并開發(fā)相應的高效靈敏檢測方法是未來重要的研究方向，通過對AD的疾病篩查和早期診斷以及后續(xù)及時的預防和干預手段，將大大降低阿爾茲海默癥的疾病發(fā)病率，具有極為重要的臨床價值和社會意義。