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        GH46家族殼聚糖酶酸堿耐受性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn)的鑒定

        2022-04-22 02:10:30程伊夢孫慧慧
        南方水產(chǎn)科學(xué) 2022年2期
        關(guān)鍵詞:殼聚糖

        程伊夢 ,孫慧慧,劉 淇,趙 玲,曹 榮

        1. 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院黃海水產(chǎn)研究所,山東 青島 266071

        2. 中國海洋大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院,山東 青島 266003

        殼聚糖是由甲殼素經(jīng)過部分脫乙酰作用得到的具有獨(dú)特功能特性的天然陽離子聚合物,由D-氨基葡萄糖通過β-1,4糖苷鍵連接而成[1]。作為自然界中唯一的堿性陽離子多糖,殼聚糖具有很好的吸附性和黏性,可以應(yīng)用于食品、材料等領(lǐng)域,但由于其相對分子量較大,不易溶于水,只能溶于某些酸性溶液中,限制了殼聚糖的有效利用[2]。殼寡糖是殼聚糖進(jìn)一步水解產(chǎn)生的聚合度介于2~20的低分子氨基寡糖[3],由于其鏈長較短和游離的氨基而易溶于水。殼寡糖具有多種生物活性,如抗氧化[4-5]、抗腫瘤[6-7]和抗菌[8-9]等,廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)和生物醫(yī)藥等領(lǐng)域[4,10-12]。殼寡糖可通過化學(xué)法、物理法和酶法制備獲得[13]。與高污染的化學(xué)法和高成本的物理法相比,通過酶法制備殼寡糖對環(huán)境友好、產(chǎn)率高且產(chǎn)物聚合度可控,已被廣泛應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)[14]。

        殼聚糖酶 (EC 3.2.1.132) 是一類特異性水解殼聚糖中的β-1,4糖苷鍵,形成不同聚合度殼寡糖的水解酶,廣泛分布于細(xì)菌、真菌、病毒以及植物等生物群中,在降解殼聚糖、制備殼寡糖中發(fā)揮著重要作用[15-20]。酶制劑是工業(yè)生物技術(shù)快速發(fā)展的基石,設(shè)計高效穩(wěn)定的酶制劑是工業(yè)生物技術(shù)時代需要攻克的關(guān)鍵科學(xué)問題[21]。但目前開發(fā)的殼聚糖酶常常具有穩(wěn)定性差、效率低、成本高等缺陷,僅依靠天然酶分子勢必?zé)o法滿足工業(yè)發(fā)展的迫切需求;此外工業(yè)生產(chǎn)中的高溫、偏酸等環(huán)境對殼聚糖酶的穩(wěn)定性提出了更加嚴(yán)格的要求。因此通過鑒定并改造影響殼聚糖酶穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸位點(diǎn),獲得高效穩(wěn)定的新型殼聚糖酶對我國殼寡糖工業(yè)生產(chǎn)技術(shù)的升級具有重要意義。

        根據(jù)蛋白質(zhì)中氨基酸序列的相似性,將不同物種來源的殼聚糖酶分成不同的蛋白質(zhì)家族。目前發(fā)現(xiàn)的殼聚糖酶歸屬于6個糖苷水解酶 (Glycoside hydrolase, GH) 家族,包括 GH5、GH7、GH8、GH46、GH75和GH80[16]。其中GH46家族的殼聚糖酶受到的關(guān)注最多,已有大量殼聚糖酶在真核或原核系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)重組表達(dá),對該家族中殼聚糖酶的基本性質(zhì)、催化特點(diǎn)及酶解產(chǎn)物分析的研究均有所涉及[2,17-20,22-24]。目前已報道的大多數(shù)GH46家族的殼聚糖酶,其最適溫度為30~50 ℃,最適pH為5~7[16]。也有少數(shù)具有良好的熱穩(wěn)定性或酸堿耐受性等特殊性質(zhì),如來自芽孢桿菌 (Bacillus sp.)CK4的殼聚糖酶在80 ℃的半衰期為90 min[25];來自芽孢桿菌DAU101的殼聚糖酶其最適pH為7.5[26],說明這些酶中可能存在某些特殊的氨基酸位點(diǎn)使其與大多數(shù)已報道的殼聚糖酶不同。本研究選取了來自芽孢桿菌DAU101的殼聚糖酶為模板,以實(shí)驗(yàn)室已報道的來源于芽孢桿菌MD-5的殼聚糖酶Csn-BAC[2]為研究對象,綜合同源建模和序列比對的方法,選取了可能影響該家族殼聚糖酶酸堿耐受性的氨基酸位點(diǎn)進(jìn)行鑒定,以期為該家族殼聚糖酶穩(wěn)定性的改造提供依據(jù)。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1 菌株和質(zhì)粒

        感受態(tài)細(xì)胞大腸桿菌Escherichia coli BL21 (DE3)[天根生化科技 (北京) 有限 公司];質(zhì)粒pET-28a(+) 由本實(shí)驗(yàn)室保藏。

        1.1.2 主要試劑

        引物合成 (青島派森諾基因生物技術(shù)有限公司);PCR產(chǎn)物純化及質(zhì)粒提取試劑盒 [天根生化科技 (北京) 有限公司];卡那霉素 (Kanamycin,Kan)、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷 (Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside, IPTG) (Solarbio公司);標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白Marker、DNA聚合酶KOD-Plus-Neo [東洋紡 (上海) 生物科技有限公司];T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamH?、HindIII、DpnI(ThermoFisher Scientific公司);殼聚糖 [脫乙酰度(Degree of deacetylation, DDA), 95%, Macklin公司];殼寡糖標(biāo)準(zhǔn)品 (聚合度1~6,青島博智匯力生物科技有限公司)。

        1.1.3 培養(yǎng)基

        Luria-Bertani (LB) 培養(yǎng)基:蛋白胨 10 g·L-1、酵母提取物 5 g·L-1、氯化鈉 (NaCl) 10 g·L-1、瓊脂粉 15 g·L-1(固體培養(yǎng)基時加入),121 ℃ 滅菌 20 min。

        1.1.4 儀器與設(shè)備

        低溫高速離心機(jī)、PCR儀 (Eppendorf公司);DYY-6C型電泳儀 (北京市六一儀器廠);JY92-IIN超聲波細(xì)胞破碎儀 (寧波新芝生物科技公司);恒溫培養(yǎng)箱 (上海喆圖科學(xué)儀器公司);Haier生物冰箱 (青島海爾);DW-86L386立式超低溫保存箱(青島海爾特種電器)。

        1.2 序列分析

        從美國國家生物技術(shù)信息中心 (National Center for Biotechnology Information,NCBI,https://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 下載殼聚糖酶Csn-BAC (Gen-Bank: CP021911.1) 的序列,同時下載GH46家族中已詳細(xì)報道酶學(xué)性質(zhì)的殼聚糖酶序列,其中包括來源于芽孢桿菌DAU101的殼聚糖酶 (GenBank:ABC66094) 序列,然后使用Clustal X算法對Csn-BAC及所選序列進(jìn)行多序列比對[27]。并選擇蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫 (Protein Data Bank, PDB) 中同源性較高的殼聚糖酶為模板,在SWISS-MODEL (https://www.swissmodel.expasy.org/) 在線網(wǎng)址上進(jìn)行同源建模,并將輸出的模型在PyMOL軟件上進(jìn)行分析。

        1.3 定點(diǎn)突變

        Csn-BAC作為野生型酶[2],使用基于聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase Chain Reaction, PCR)的方法進(jìn)行定點(diǎn)突變。用于突變的引物序列見表1。經(jīng)限制性內(nèi)切酶DpnI酶切后,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3) 感受態(tài)細(xì)胞中,利用LB-Kan平板進(jìn)行篩選,挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行測序以驗(yàn)證突變情況。

        表1 定點(diǎn)突變引物Table 1 Primers for directed evolution

        1.4 蛋白表達(dá)及純化

        將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21 (DE3) 感受態(tài)細(xì)胞后,接種至添加了 Kan (50 μg·mL-1) 的LB培養(yǎng)基中,于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至光密度 (OD600) 為0.6~0.8,用 IPTG (0.1 mmol·L-1) 進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),并于30 ℃繼續(xù)培養(yǎng)15 h。將所得菌液超聲破碎后,使用ProteinIso?Ni-NTA Resin色譜柱 (北京全式金生物技術(shù)有限公司) 純化His標(biāo)簽標(biāo)記的蛋白,并以 NPI-200緩沖液 [200 mmol·L-1咪唑、50 mmol·L-1磷酸二氫鈉 (NaH2PO4)、300 mmol·L-1NaCl,pH 8] 洗脫目標(biāo)蛋白,然后在4 ℃下用10 kD截止膜超濾除鹽,得到的蛋白質(zhì)用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳 (SDS-PAGE) 進(jìn)行分析。蛋白質(zhì)濃度用Bradford法測定[28]。

        1.5 活性測定

        以膠體殼聚糖 (10 g·L-1, 95% DDA) 為底物,加適量的酶液和磷酸鹽緩沖液 (pH 7),在37 ℃下反應(yīng)10 min,于100 ℃水浴10 min終止反應(yīng)后,用改良的3,5-二硝基水楊酸試劑法 (DNS)[17]測定還原糖的量,并于520 nm處測定吸光值。1個單位的酶活 (U) 定義為每分鐘每生成1 μmol的還原糖所需要的酶量。

        1.6 酶學(xué)性質(zhì)分析

        1.6.1 最適溫度和 pH

        利用pH 7的磷酸鹽緩沖溶液,將所得突變體分別在30~70 ℃進(jìn)行酶促反應(yīng),確定酶的最適反應(yīng)溫度。將膠體殼聚糖置于不同pH (3~10) 的緩沖液中,所用緩沖體系分別為:檸檬酸鹽緩沖溶液 (pH 3~6)、磷酸鹽緩沖溶液 (pH 6~8)、Tri-HCl緩沖溶液 (pH 8~9) 和甘氨酸緩沖溶液 (pH 9~10),在最適溫度下測定突變體酶活,確定pH對其酶活的影響。

        1.6.2 溫度和 pH 穩(wěn)定性

        利用pH 7的磷酸鹽緩沖溶液,分別在30~70 ℃孵育1 h后,在最適反應(yīng)溫度下測定突變體酶活,確定溫度對其穩(wěn)定性的影響。將膠體殼聚糖置于不同pH (3~10) 的緩沖液中,所用緩沖體系同1.6.1,于室溫孵育1 h后,在最適溫度下測定突變體酶活,確定pH對其穩(wěn)定性的影響。

        1.7 動力學(xué)分析

        在標(biāo)準(zhǔn)條件下,用純化的酶 (100 μL) 和不同濃度的殼聚糖 (500 μL) 在37 ℃下反應(yīng)5 min,然后加入375 μL DNS溶液終止反應(yīng),進(jìn)行動力學(xué)分析。使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法在底物質(zhì)量濃度介于1~10 mg·mL-1內(nèi)測定了包括米氏常數(shù)(Km)、催化常數(shù) (Kcat) 和催化效率(Kcat/Km) 在內(nèi)的動力學(xué)參數(shù)。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 Csn-BAC突變位點(diǎn)的選擇

        由于殼聚糖酶Csn-BAC的蛋白結(jié)構(gòu)尚未解析,因此采用同源建模的方法預(yù)測其蛋白結(jié)構(gòu)?;谛蛄斜葘Φ慕Y(jié)果,選取了來源于枯草芽孢桿菌(B. subtilis) MY002的殼聚糖酶CsnMY002 ( PDB ID:7C6C)[29]為模板 (與Csn-BAC的序列相似性為96.28%),利用SWISS-MODEL在線網(wǎng)址 (https://swissmodel.expasy.org/) 對Csn-BAC進(jìn)行同源建模,并在PyMOL軟件上進(jìn)行可視化分析,結(jié)果見圖1。將從NCBI下載的殼聚糖酶序列與Csn-BAC的序列進(jìn)行比對,結(jié)果見圖1-c。結(jié)合模擬的結(jié)構(gòu)與序列比對,最終選取了4個點(diǎn) (其中P68和H234靠近底物結(jié)合口袋,A137和A203則遠(yuǎn)離結(jié)合口袋,位于表面),并按照來自芽孢桿菌DAU101殼聚糖酶的序列進(jìn)行了定點(diǎn)突變 [V1 (P68A)、V2 (A137G)、V3(A203M)和 V4 (H234E)]。

        圖1 Csn-BAC生物信息學(xué)分析Fig. 1 Bioinformatics analysis of Csn-BAC

        2.2 突變體表達(dá)及純化

        對突變體進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),菌液離心后取上清液為粗酶液。將粗酶液利用鎳離子親和層析進(jìn)行純化,在NPI-200溶液中將目標(biāo)產(chǎn)物洗脫下來,并進(jìn)行SDS-PAGE分析,結(jié)果見圖2。在35 kD附近有與野生型Csn-BAC大小相符的單一蛋白條帶,證明突變體成功表達(dá),經(jīng)超濾濃縮后,可進(jìn)行后續(xù)分析和研究。

        圖2 Csn-BAC突變體的SDS-PAGE分析Fig. 2 SDS-PAGE analysis of Csn-BAC variants

        2.3 突變體酶活測定

        突變體比酶活測定結(jié)果見圖3。在37 ℃、pH 7條件下,Csn-BAC及其突變體V1、V2、V3和V4的比酶活分別為258.32、241.08、270.44、291.22和291.65 U·mg-1。各突變體的水解活性與野生型Csn-BAC相比無較大差異。其中突變體V3、V4的活性為Csn-BAC的113%左右。突變體的比酶活高于來自曲霉 (Aspergillus sp.) W-2菌株的殼聚糖酶CsnW2 (34 U·mg-1)[30]、樹狀擬芽孢桿菌(Paenibacillus dendritiformis) 的殼聚糖酶Csn-PD(76.4 U·mg-1)[16]和丁核弧菌 (Butyribrio sp.) MC2013的殼聚糖酶BUT (146 U·mg-1)[31],與根際細(xì)菌(Gynuella sunshinyii) 中的殼聚糖酶GsCsn46A相似 (260.39 U·mg-1)[32],低于枯草芽孢桿菌 (B. subtilis) CH2菌株在畢赤酵母系統(tǒng)中表達(dá)的殼聚糖酶(338.08 U·mg-1)[33]、腎桿菌屬 (Renibacterium sp.)QD1殼聚糖酶Csn-A (1 575 U·mg-1)[34]和解淀粉芽孢桿菌 (B. amyloliquefaciens) ECU08的殼聚糖酶BaCsn46A (1 031.2 U·mg-1)[35]。

        圖3 Csn-BAC突變體酶活分析Fig. 3 Enzyme specific activity analysis of Csn-BAC variants

        2.4 突變體酶學(xué)性質(zhì)

        2.4.1 最適溫度

        突變體的最適溫度見圖4-a。突變體V1和V2的最適溫度與Csn-BAC相同,均在40 ℃時表現(xiàn)出最大活性,而V3、V4則升高至50 ℃。此外,Csn-BAC在70 ℃時已失活,而突變體在70 ℃時相對酶活仍有初始酶活的20%左右。與微生物的生長相適應(yīng),大多數(shù)殼聚糖酶都是嗜溫酶,其最適溫度通常介于30~60 ℃。但仍有部分殼聚糖酶是冷適應(yīng)性酶,如來自魚腥藻 (Anabaena fertilissima)RPAN1菌株的殼聚糖酶最適反應(yīng)溫度為27 ℃[36]。

        圖4 Csn-BAC突變體酶學(xué)性質(zhì)分析Fig. 4 Enzymatic property of Csn-BAC variants

        2.4.2 溫度穩(wěn)定性

        突變體的溫度穩(wěn)定性見圖4-b。Csn-BAC在50 ℃孵育1 h后,其相對酶活保持在87.53%,突變體V1—V4則分別為58.74%、60.73%、58.16%和52.08%。相較于Csn-BAC,突變體整體而言對熱更為敏感。但在較高溫度下,如70 ℃時,V3和V4的熱穩(wěn)定性稍有提升。本結(jié)果表明,203和234兩個位點(diǎn)突變后可能對其在較高溫度下保持穩(wěn)定性有益。耐高溫的酶在工業(yè)生產(chǎn)中具有獨(dú)特優(yōu)勢,但除極端環(huán)境微生物和部分真菌來源的殼聚糖酶較為耐熱外[29,37],多數(shù)野生型GH46家族是熱敏性的殼聚糖酶。Zhou等[38]研究發(fā)現(xiàn)來源于海洋細(xì)菌假交替單胞菌屬 (Pseudoalteromonas sp.) 的殼聚糖酶CsnM在30 ℃孵育1 h后,殘余酶活僅為25.4%;Ma等[39]發(fā)現(xiàn)源自海洋芽孢桿菌屬的殼聚糖酶CsnQ同樣在30 ℃之后穩(wěn)定性急劇下降。

        2.4.3 最適 pH

        突變體的最適pH見圖4-c—圖4-f。突變體V1和V2的最適pH與Csn-BAC相同,均在pH 7的磷酸鹽緩沖溶液中表現(xiàn)出最大活性,而V3、V4則更適應(yīng)pH 9的甘氨酸緩沖溶液。與許多殼聚糖酶相同,弱酸性溶液對Csn-BAC及其突變體活力均有抑制作用[17,20,40]。目前已報道的所有家族的殼聚糖酶其最適pH介于4~8[41],且多數(shù)殼聚糖酶在偏酸性條件下表現(xiàn)出最優(yōu)的水解活性,最適pH為9的酶很少見。Gupta等[36]報道了來自魚腥藻RPAN1菌株的殼聚糖酶在pH 7.5時顯示出最大活性;Guo等[20]研究了來自白色鏈霉菌 (Streptomyces albolongus) ATCC27414的殼聚糖酶Csn21c,其最適反應(yīng)pH為8;Liang等[42]則報道過殼聚糖酶CS038分別在pH 6和10時顯示出最大活性。此外,突變體V1在pH 5的相對活性由Csn-BAC的約20%提至約50%,結(jié)合殼聚糖溶液的弱酸性特質(zhì),這可能有助于該酶在工業(yè)生產(chǎn)上的應(yīng)用。

        2.4.4 pH 穩(wěn)定性

        突變體的pH穩(wěn)定性見圖4-g—圖4-j。突變體V1、V2對pH的變化較為敏感,在Tris-HCl緩沖液中,突變體V1、V2在pH 8孵育1 h后仍可保持83%以上的活性,在pH 9時卻僅剩余5%~10%,這些突變體對不同pH的同一緩沖液的活性差異與Csn-BAC類似[2]。而V3和V4在pH 6~10孵育1 h后仍能保持60%以上的相對酶活,其pH穩(wěn)定性優(yōu)于野生型Csn-BAC (Csn-BAC在pH 9~10時失活)。與之相似的是殼聚糖酶Csn21c[20],其同樣在pH 6~10較為穩(wěn)定 (殘余酶活>60%);馬帥等[43]報道的殼聚糖酶BsCsn46在pH 4.5~10的緩沖液中孵育30 min后仍能保持90%以上殘余酶活;此外,另外一個來自曲霉TCCC45017的殼聚糖酶在pH 8孵育1 h后,殘余酶活仍能保持70%[44]。

        2.5 反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)

        突變體的動力學(xué)參數(shù)見表2。Csn-BAC和突變體V3的Km分別為7.25和7.27 mg·mL-1,與殼聚糖酶Csn21c (7.43 mg·mL-1)[20]相似。而突變體V1、V2、V4的Km分別為 3.68、3.13和 3.16 mg·mL-1,與殼聚糖酶 CvCsn46 (3.06 mg·mL-1) 較為接近[45],與Csn-BAC相比下降明顯,表明酶與底物的親和力增強(qiáng),其中突變體V2和V4的Kcat/Km約為Csn-BAC的1.7倍左右,催化效率有所增加。

        表2 Csn-BAC及其突變體反應(yīng)動力學(xué)參數(shù)Table 2 Reaction kinetic parameters of chitosanase Csn-BAC and its mutants

        3 結(jié)論

        本研究選取了GH46家族中來源于芽孢桿菌的殼聚糖酶Csn-BAC為研究對象,以來自芽孢桿菌DAU101的殼聚糖酶為模板,根據(jù)同源建模和序列比對的結(jié)果,篩選了4個可能影響其酸堿耐受性的位點(diǎn)進(jìn)行鑒定,其中P68和H234兩個位點(diǎn)靠近底物結(jié)合口袋,而另外兩個位點(diǎn)則位于蛋白表面。結(jié)果顯示,所得的突變體中其熱穩(wěn)定性均出現(xiàn)了不同程度的降低,但203和234兩個位點(diǎn)突變后對其在較高溫度下保持穩(wěn)定性有益;而突變體的酸堿耐受性有了明顯提升,突變體V3和V4的最適pH由最初的7升至9,且在pH 6~10時表現(xiàn)出更好的穩(wěn)定性。因此,本研究鑒定了4個影響GH46家族殼聚糖酶酸堿耐受性的關(guān)鍵氨基酸,其可能分布在蛋白空間結(jié)構(gòu)的結(jié)合口袋附近或表面,同時獲得了2個酸堿耐受性明顯提高的突變體,且本研究驗(yàn)證了該策略在鑒定并改造影響殼聚糖酶穩(wěn)定性的關(guān)鍵氨基酸方面是一種有效的方法。

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