趙琳珊，李玉苗，李楠，賈友超,王曉芳，韓強(qiáng)，臧愛民

(1.河北大學(xué)附屬醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科,河北省腫瘤放化療機(jī)制與規(guī)程研究 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000；2.河北大學(xué) 臨床醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071000)

結(jié)腸癌是臨床常見的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，早期結(jié)腸癌患者采取手術(shù)為主的綜合治療，部分患者可以治愈[1]. 隨著靶向治療和免疫治療的進(jìn)展，晚期結(jié)腸癌患者生存期逐漸延長(zhǎng)，但治愈希望仍然渺茫，難以控制的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是目前臨床治療所面臨的難題，因此需要從不同角度進(jìn)一步探索結(jié)腸癌生物學(xué)治療的手段.表觀遺傳修飾的改變?cè)诙喾N惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展以及耐藥過(guò)程中發(fā)揮重要作用，其中組蛋白乙酰化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展緊密相關(guān).組蛋白乙?；揎椨山M蛋白乙酰轉(zhuǎn)移酶和組蛋白去乙?；?histone deacetylases，HDAC)協(xié)調(diào)進(jìn)行.在腫瘤細(xì)胞中，HDAC的過(guò)度表達(dá)增強(qiáng)了組蛋白去乙酰化作用，DNA與組蛋白結(jié)合緊密，不利于抑癌基因的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致基因“沉默”.由組蛋白乙?；揎椀母淖円鸬漠惓；虮磉_(dá)水平可以使用表觀遺傳藥物HDAC抑制劑調(diào)節(jié)或逆轉(zhuǎn)[2].

西達(dá)本胺(Chidamide)化學(xué)名是N-(2-氨基-4-氟苯基)-4-{N-[(E)-3-(3-吡啶)丙烯酰基]氨甲基}苯甲酰胺，是一種口服的組蛋白去乙?；敢种苿ㄟ^(guò)選擇性抑制HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC10[3]，調(diào)節(jié)染色體上的組蛋白和非組蛋白乙?；剑M(jìn)一步調(diào)控基因的表達(dá)，從而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期.西達(dá)本胺在外周T細(xì)胞淋巴瘤、多發(fā)性骨髓瘤臨床試驗(yàn)中顯示出較好的治療效果[4-7],但在實(shí)體瘤治療方面的價(jià)值仍不確定.本文旨在研究西達(dá)本胺對(duì)結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響，并初步探討其作用機(jī)制，為結(jié)腸癌治療提供新的思路.

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞株及培養(yǎng)條件

人結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-15細(xì)胞株由南方科技大學(xué)饋贈(zèng).將含有10%(體積分?jǐn)?shù))胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基置于溫度為37 ℃，在體積分?jǐn)?shù)5% CO2且相對(duì)濕度為90%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，傳2-3代后取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn).

1.2 藥物和主要試劑

西達(dá)本胺由深圳微芯科技公司饋贈(zèng)，使用二甲基亞砜(DMSO)進(jìn)行溶解，配制儲(chǔ)備液濃度為40 mmol/L，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?Histone H3、Histone H4、Acetyl-Histone H3、Acetyl-Histone H4、Bcl-2、Bax、Caspase 3、Cleaved Caspase 3、Caspase 9、Cleaved Caspase 9、PARP、Cleaved PARP、Cytc、γH2AX、p21、p27、CDK2、CyclinA2抗體均購(gòu)自cell signaling公司;CCK-8試劑盒購(gòu)自MedChemExpress公司;FITC Annexin V凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自BD生物公司;EdU細(xì)胞增殖檢測(cè)試劑盒購(gòu)自銳博生物公司.

1.3 CCK-8實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞活力

將對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-15細(xì)胞每孔100 μL(4×103/孔)接種于96孔板，24 h后按不同濃度梯度(64、32、16、8、4、2、1 μmol/L)加入西達(dá)本胺含藥培養(yǎng)基，每組均設(shè)置了RPMI-1640培養(yǎng)基空白對(duì)照組和DMSO陰性對(duì)照組,并同時(shí)設(shè)置6個(gè)復(fù)孔.待培養(yǎng)24、48、72、96、120 h后,避光加入CCK-8溶液10 μL，孵育4 h后,酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)450 nm光密度值(OD值)，進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).計(jì)算抑制率，抑制率=(OD加藥組-OD空白組)/(OD對(duì)照組-OD空白組).

1.4 細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察

消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-15細(xì)胞每孔2.5 mL(5×105/孔)接種于6孔板，24 h后分別加入終濃度1.272、2.815、10.943 μmol/L的西達(dá)本胺含藥培養(yǎng)基，并設(shè)置DMSO陰性對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48、72 h后于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化并拍照.

1.5 克隆形成實(shí)驗(yàn)

取經(jīng)不同濃度西達(dá)本胺處理48 h后的HCT-15細(xì)胞，消化后按500/孔接種于6孔板，十字形晃動(dòng)使細(xì)胞分散均勻，置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)，10 d后出現(xiàn)大于50個(gè)細(xì)胞肉眼可見的克隆集落且克隆之間不發(fā)生融合終止培養(yǎng).棄去培養(yǎng)基，PBS清洗2～3次，經(jīng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛固定20 min后，使用質(zhì)量分量1%的結(jié)晶紫染液染色15 min，洗去多余染色劑放置室溫干燥，待水漬消失后掃描拍照.

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-15細(xì)胞，5×105/孔，每孔2.5 mL接種于6孔板，24 h后分別加入終濃度2.815、10.943 μmol/L的含藥培養(yǎng)基，并設(shè)置DMSO陰性對(duì)照組.繼續(xù)培養(yǎng)48 h后使用Annexin V-FITC/PI雙染法對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理染色；避光、室溫(25 ℃)孵育15 min后，上機(jī)檢測(cè).

1.7 EdU細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)

消化對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HCT-15細(xì)胞，5×105/孔，每孔2.5 mL接種于6孔板，24 h后分別加入終濃度0.612、1.272、2.815、10.943 μmol/L的含藥培養(yǎng)基.每組均設(shè)置DMSO對(duì)照組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h后進(jìn)行EdU標(biāo)記.制備25 μmol/L的EdU工作液，加入6孔板孵育2 h，PBS清洗后加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%多聚甲醛使細(xì)胞固定，室溫孵育30 min，棄固定液后加入甘氨酸溶液，搖床孵育5 min以去除多余的固定液.清洗后加入滲透劑室溫孵育10 min.再次清洗后加入Apollo染色液，避光搖床孵育30 min.滲透劑清洗之后加入Hoechst染色液進(jìn)行細(xì)胞核染色，避光搖床孵育30 min.PBS清洗2次洗去多余染色液，使用熒光倒置顯微鏡在鏡下觀察并拍照.

1.8 蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞凋亡途徑

收集經(jīng)不同濃度(1.272、2.815、10.943 μmol/L)西達(dá)本胺處理48 h后的HCT-15細(xì)胞蛋白.每個(gè)樣品取30 μg蛋白進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，上層濃縮膠用60 V電壓，分離膠電壓調(diào)至100 V.將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，恒壓90 V轉(zhuǎn)膜1.5 h.質(zhì)量分量5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，洗膜3次，每次10 min.一抗采用1∶1 000體積比稀釋, 4 ℃孵育過(guò)夜，二抗采用1∶2 000體積比稀釋,室溫下孵育1 h.加入1∶1(體積比)配制的ECL化學(xué)發(fā)光A液、B液顯色3 min，使用化學(xué)發(fā)光儀顯影拍照.

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 23.0軟件、GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析及作圖，所有實(shí)驗(yàn)均進(jìn)行3次獨(dú)立重復(fù)實(shí)驗(yàn).(SPSS軟件計(jì)算72 h的 IC10、IC20、IC50值分別為1.272、2.815、10.943 μmol/L).采用單因素方差分析或獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)方法分析組間差異，P<0.05視為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.

2 結(jié)果

2.1 西達(dá)本胺抑制HCT-15細(xì)胞的增殖

CCK-8法檢測(cè)西達(dá)本胺對(duì)HCT-15細(xì)胞增殖的抑制作用，結(jié)果顯示，HCT-15細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理24、48、72、96、120 h后，能夠明顯抑制細(xì)胞增殖，相同濃度不同時(shí)段對(duì)比，隨著時(shí)間延長(zhǎng)抑制率明顯增高，有明顯的時(shí)間依賴性，P<0.000 1(圖1a)；相同時(shí)間不同濃度對(duì)比，隨著加藥濃度的增加抑制率明顯增高，當(dāng)藥物濃度為4 μmol/L時(shí)，抑制率出現(xiàn)明顯的濃度依賴性，P<0.000 1(圖1b).上述結(jié)果表明隨著藥物濃度的增加和時(shí)間的延長(zhǎng)，西達(dá)本胺抑制HCT-15細(xì)胞的增殖且呈一定的時(shí)間和濃度依賴性.

a.相同濃度不同時(shí)段的抑制率;b.同時(shí)段不同濃度的抑制率.(與對(duì)照組比較：*P<0.05,**P<0.01，***P<0.001，****P<0.000 1).圖1 西達(dá)本胺對(duì)HCT-15細(xì)胞的增殖抑制呈濃度-時(shí)間依賴性Fig.1 Concentration-dependent effect of Chidamide on HCT-15 cell proliferation

2.2 西達(dá)本胺影響HCT-15細(xì)胞形態(tài)及克隆形成能力

細(xì)胞經(jīng)不同濃度藥物處理后形態(tài)發(fā)生變化(圖2a)，隨著藥物濃度及作用時(shí)間的增加，細(xì)胞形態(tài)變?yōu)殚L(zhǎng)梭形，觸角增多，細(xì)胞內(nèi)顆粒物增多，并且可見空泡；同時(shí)相鄰細(xì)胞之間連接疏松，細(xì)胞膜折光度下降，細(xì)胞數(shù)量也隨之減少.平板克隆的結(jié)果顯示，隨著加藥濃度的增加克隆集落數(shù)減少，且單個(gè)集落體積逐漸減小(圖2b).平板克隆結(jié)晶紫染色結(jié)果同樣印證了上述結(jié)果，集落數(shù)明顯減少(圖2c).由此可見，西達(dá)本胺顯著影響了結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞的生物學(xué)形態(tài)和克隆形成能力.

a.不同濃度西達(dá)本胺作用于HCT-15細(xì)胞48 h和72 h后的細(xì)胞形態(tài)變化; b.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)第10的集落形成情況; c.平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)晶紫染色.圖2 西達(dá)本胺抑制細(xì)胞增殖的形態(tài)學(xué)變化Fig.2 Chidamide inhibits morphological changes of cell proliferation

2.3 西達(dá)本胺誘導(dǎo)HCT-15細(xì)胞凋亡并阻滯細(xì)胞周期

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)到明顯的細(xì)胞凋亡，隨著加藥濃度的升高，細(xì)胞凋亡數(shù)量增多，早期凋亡細(xì)胞、晚期凋亡細(xì)胞和壞死細(xì)胞的數(shù)量都隨之上升(圖3a).測(cè)得實(shí)驗(yàn)組凋亡率分別為12.32%±0.84%(P<0.05)、15.63%±0.91%(P<0.001)，與對(duì)照組相比，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3b).與此同時(shí)通過(guò)EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其細(xì)胞周期的變化(圖3c)，隨著加藥濃度的增高，Hoechst藍(lán)色熒光染色細(xì)胞數(shù)目減少，即活細(xì)胞數(shù)減少，藥物對(duì)細(xì)胞殺傷作用顯著；EdU綠色熒光染色細(xì)胞數(shù)減少，即進(jìn)入DNA復(fù)制期的細(xì)胞數(shù)量減少.表明西達(dá)本胺可以明顯促進(jìn)HCT-15細(xì)胞凋亡、抑制其增殖且阻滯細(xì)胞周期.

a.流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HCT-15細(xì)胞凋亡;b.凋亡率與對(duì)照組相比具有顯著性差異(*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001)；c.EdU檢測(cè)HCT-15細(xì)胞周期阻滯.圖3 西達(dá)本胺對(duì)細(xì)胞凋亡和周期的影響Fig.3 Effects of chidamide on apoptosis and cell cycle

2.4 西達(dá)本胺通過(guò)線粒體凋亡機(jī)制介導(dǎo)細(xì)胞凋亡

Western blot 結(jié)果顯示，隨著加藥濃度增大，乙酰化組蛋白Acetyl-Histone H3、Acetyl-Histone H4表達(dá)上調(diào)(圖4a).由線粒體介導(dǎo)的Caspase信號(hào)通路相關(guān)蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax、Cytc、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP表達(dá)上調(diào).DNA雙鏈斷裂標(biāo)志物γH2AX表達(dá)上調(diào)(圖4b).細(xì)胞周期相關(guān)蛋白p21、p27表達(dá)上調(diào)，CDK2、CyclinA2蛋白的表達(dá)水平下調(diào)(圖4c).

圖4 西達(dá)本胺對(duì)乙?；M蛋白、線粒體凋亡途徑相關(guān)蛋白、周期蛋白表達(dá)的影響Fig.4 Effects of Chidamide on expression of acetylated histones，mitochondrial apoptosis pathway related proteins and cyclins

3 討論

結(jié)腸癌的發(fā)生發(fā)展與原癌基因的活化和抑癌基因的失活緊密相關(guān).組蛋白的乙?；欣贒NA和組蛋白八聚體的解離，核小體結(jié)構(gòu)變得松弛，使得原本無(wú)法和啟動(dòng)子接觸的區(qū)域成為新的轉(zhuǎn)錄靶點(diǎn)，各種轉(zhuǎn)錄因子與DNA結(jié)合，激活轉(zhuǎn)錄過(guò)程[8].西達(dá)本胺是一種新型的組蛋白去乙?；敢种苿?，通過(guò)抑制組蛋白去乙?；傅幕钚?，提高組蛋白的乙?；?，促進(jìn)抑癌基因的表達(dá)，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡.本研究發(fā)現(xiàn)，隨著藥物濃度的升高，HCT-15結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡增多，細(xì)胞體外克隆形成能力減弱，初步證實(shí)了西達(dá)本胺對(duì)結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞系的抑制作用.而后筆者檢測(cè)了經(jīng)不同濃度西達(dá)本胺處理后的組蛋白的乙?；?，結(jié)果顯示隨著加藥濃度增加Acetyl Histone 3、Acetyl Histone 4表達(dá)水平逐漸增高，證實(shí)了西達(dá)本胺可以誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞系組蛋白乙?；皆龈?

進(jìn)一步探討了西達(dá)本胺處理后結(jié)腸癌HCT-15細(xì)胞系的具體凋亡途徑.細(xì)胞發(fā)生凋亡的主要途徑有兩種，即內(nèi)源性凋亡途徑和外源性凋亡途徑.內(nèi)源性凋亡途徑主要由線粒體介導(dǎo).以往研究表明，西達(dá)本胺可以通過(guò)激活線粒體凋亡途徑來(lái)誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡[9-10].西達(dá)本胺通過(guò)Caspase依賴的凋亡途徑抑制AML細(xì)胞增殖，阻斷G1/S期轉(zhuǎn)變，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[11].西達(dá)本胺下調(diào)抗凋亡蛋白Bcl-xL和Bcl-2，激活促凋亡蛋白Bax，在p53信號(hào)的調(diào)控下，Cytc從細(xì)胞質(zhì)轉(zhuǎn)移到線粒體，與線粒體膜結(jié)合釋放Cytc，在dATP的作用下，Cytc釋放到細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，與凋亡蛋白酶激活因子1(APAF-1)結(jié)合形成聚合物，與Caspase 9前體結(jié)合形成凋亡體，Caspase 9被激活.Caspase 9激活了該通路下游的一系列Caspase成員，包括Caspase 7和Caspase 3，進(jìn)一步誘導(dǎo)特定的凋亡底物和細(xì)胞凋亡[12-13].此外，西達(dá)本胺還具有誘導(dǎo)DNA損傷的作用[14].為了驗(yàn)證以上結(jié)論，本研究檢測(cè)了由線粒體介導(dǎo)的Caspase信號(hào)通路相關(guān)蛋白的表達(dá)量變化，結(jié)果顯示抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax、Cytc、Cleaved Caspase 9、Cleaved Caspase 3、Cleaved PARP表達(dá)上調(diào)，隨著藥物濃度的增加，γH2AX表達(dá)量上升.這說(shuō)明西達(dá)本胺可能通過(guò)上調(diào)組蛋白乙?；剑谷旧|(zhì)結(jié)構(gòu)變得疏松，從而引起細(xì)胞的DNA雙鏈損傷并激活內(nèi)源性凋亡途徑促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用.細(xì)胞周期的調(diào)控主要與Cyclin、CDK以及CDKI有關(guān).Cyclin與CDK形成復(fù)合物促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)展，而CDKI的作用則相反.p21是CDKI的成員，可抑制CDK活性，阻滯細(xì)胞周期.在結(jié)腸癌中，西達(dá)本胺調(diào)控p21、CDK4、p53表達(dá)水平，阻滯細(xì)胞于G0/G1期[15].在淋巴瘤中，西達(dá)本胺調(diào)控p21、CyclinE表達(dá)水平，阻滯細(xì)胞周期于G0/G1期[16].本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)西達(dá)本胺處理結(jié)腸癌細(xì)胞HCT-15后，p21表達(dá)上調(diào)，而CDK2、CyclinA2蛋白的表達(dá)下調(diào)，EdU實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞總周期變慢.結(jié)果提示西達(dá)本胺可能通過(guò)上調(diào)p21的表達(dá)并抑制周期蛋白依賴性激酶復(fù)合物Cyclin-CDK-CDKI的活性達(dá)到阻滯細(xì)胞周期的效果.

乙?；{(diào)控異常是多種腫瘤的共同生物學(xué)特征之一，西達(dá)本胺在淋巴瘤、乳腺癌均獲批適應(yīng)證，應(yīng)用前景廣闊，需要我們?cè)谄渌愋湍[瘤對(duì)其進(jìn)行更深入的探索.本研究驗(yàn)證了西達(dá)本胺在結(jié)腸癌細(xì)胞系HCT-15發(fā)揮作用的主要機(jī)制，探討了造成該細(xì)胞系凋亡的具體途徑，但是藥物造成DNA損傷的具體機(jī)制尚未明確，需要在后續(xù)的工作中繼續(xù)研究.