馬麗蘭，徐娜，吳桐，李海鷹，楊文智

(1.河北省第六人民醫(yī)院 河北大學(xué)精神衛(wèi)生研究院，藥劑科，河北 保定 071000;2. 河北大學(xué) 藥學(xué)院，河北 保定 071002)

瑞格列奈(repaglinide)是一種通過刺激胰腺釋放胰島素，專門控制Ⅱ型糖尿病患者的葡萄糖波動的口服降糖藥物．相比其他磺酰脲類降糖藥物，具有起效快、副作用少、用藥劑量少等優(yōu)點(diǎn)，市售多以片劑為主[1-2]．>但瑞格列奈屬于BCS Ⅱ分類系統(tǒng)，口服生物利用度有限.其水溶性差(34 μg/mL)極大限制了藥物的吸收，也限制了藥物新劑型的開發(fā)[3-4].透皮給藥可避免肝首過效應(yīng)，減少藥物對胃腸道的副作用，能長時間維持恒定的血藥濃度，減少給藥次數(shù).但皮膚是化學(xué)物質(zhì)進(jìn)入機(jī)體的天然屏障，其阻礙了藥物的經(jīng)皮滲透，使藥物的治療效果下降[5-7].因此設(shè)計有效的透皮制劑需克服皮膚阻礙．電致孔技術(shù)可增加藥物的透皮速率和累積滲透量，其原理是利用瞬間脈沖電場的作用力改變皮膚中脂質(zhì)雙分子層的排列順序，從而形成新的通道，促使藥物分子順利透過[8-9]．近幾年來，電致孔技術(shù)在透皮給藥實驗中應(yīng)用廣泛，也取得了良好的透皮效果[10-12].本文基于課題組采用助溶劑精氨酸極大改善瑞格列奈溶解度的基礎(chǔ)上[13]，制備了瑞格列奈水凝膠，考察電致孔條件下藥物凝膠的兔體內(nèi)釋放情況，建立體內(nèi)外藥物釋放相關(guān)性模型，綜合判斷制備瑞格列奈降糖水凝膠劑的可行性．

1 實驗方法

1.1 儀器與試劑

Franz立式雙室擴(kuò)散儀(中科院上海有機(jī)所)；LC3000型高效液相色譜儀(北京創(chuàng)新通恒科技有限公司)；AN2651型分析天平(上海民橋精密科學(xué)儀器有限公司)；DLZ-G電腦中頻治療儀(廊坊市豪邁醫(yī)療器械有限公司)．

瑞格列奈(湖北康寶泰精細(xì)化工有限公司)；卡波姆、精氨酸、尼泊金乙酯、EDTA-2Na、三乙醇胺、月桂氮酮、油酸等(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，其余試劑均為分析純．

新西蘭兔雌雄各半，合格證號：1805011，(2.5 ± 0.1)kg，購自河北省實驗動物中心．

1.2 制備瑞格列奈水凝膠劑

稱取瑞格列奈-精氨酸復(fù)合物適量，溶于100 mL的蒸餾水中，得5 mg/mL的藥物溶液，并對瑞格列奈-精氨酸復(fù)合物進(jìn)行XRD表征．按順序依次加入氮酮(體積分?jǐn)?shù)1%)、油酸(體積分?jǐn)?shù)1%)、尼泊金乙酯(3 g/L)、EDTA-2Na(0.1 g/L)、甘油(體積分?jǐn)?shù)10%)和卡波姆(10 g/L)，磁力攪拌，使各組分充分混均、溶脹后，用三乙醇胺(13.5 g/L)調(diào)pH值至中性，繼續(xù)攪拌過夜，即得．

1.3 體外滲透實驗

采用紫外分光光度法考察瑞格列奈水凝膠的體外滲透性能.將瑞格列奈干燥至恒重，精密稱定，加入甲醇配成100 μg/mL的儲備液．分別精密量取一定量的儲備液，稀釋成不同質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，并采用紫外-可見分光光度計進(jìn)行測定．以吸光度A對藥物質(zhì)量濃度ρ(μg/mL)作圖，得到瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)曲線.取一定質(zhì)量濃度的瑞格列奈對照品溶液，同日內(nèi)測定5次，連續(xù)測定5 d，考察日內(nèi)、日間精密度．在制備的凝膠劑中分別添加高(10 μg/mL)、中(5 μg/mL)、低(1 μg/mL)3種質(zhì)量濃度的瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)液各5份，處理后分析測定，計算回收率．

采用Franz立式擴(kuò)散池進(jìn)行體外釋放實驗，將小鼠的離體皮膚置于擴(kuò)散池和接收池之間，用夾子固定好，角質(zhì)層一側(cè)皮膚面向上，真皮層與接收液接觸，有效接觸面積為2.69 cm2，接收池的容積為13 mL，保證裝置的密閉性良好，避免產(chǎn)生氣泡.選擇的接收液為pH=7.4的磷酸鹽緩沖液，攪拌條件為300 r/min、水浴溫度為(32±0.5)℃.將制備好的瑞格列奈水凝膠涂敷于皮膚的角質(zhì)層一側(cè)，取樣時間點(diǎn)(0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36、48 h)取出全部的接收液，并及時補(bǔ)充同溫同體積的接收液.將取得的接收液樣品3 000 r/min離心10 min后，用紫外分光光度計測定樣品吸收度，計算含量．按下式計算藥物的單位面積累積釋放量(Q)和經(jīng)皮吸收百分率(W).

式中ρn是第n次取樣時樣品中藥物質(zhì)量濃度，V是接收池的總體積，A是有效透過面積，M是凝膠中藥物總量．

以單位面積藥物的累積滲透量(Q)對時間(t)進(jìn)行線性回歸分析，分別用零級、一級和Higuchi方程擬合，探究最佳釋放模型．

1.4 兔體內(nèi)藥物動力學(xué)實驗

采用HPLC法考察瑞格列奈的動物體內(nèi)藥代動力學(xué)，色譜柱：Hypersil BDS C18色譜柱(46 mm×250 mm，5 μm)，柱前接ODS C18保護(hù)柱；流動相：CH3OH-(0.02 mol/L)NH4H2PO4(體積比70∶30，pH=2.5)；紫外檢測波長：λ=282 nm；流速：1 mL/min；柱溫：常溫；進(jìn)樣量：20 μL．

樣品制備：家兔耳緣靜脈取血約0.5 mL至含肝素的EP管中，12 000 r/min離心10 min后，精密量取上清液200 μL血漿，加入0.5 mL三氯甲烷-甲醇(體積比4∶1)溶液，渦旋振蕩5 min后離心10 min(12 000 r/min)，取有機(jī)層經(jīng)0.22 μm的微孔濾膜過濾，常溫下氮?dú)獯蹈桑尤爰状既芤?00 μL復(fù)溶，3 000 r/min離心5 min，取上清液進(jìn)行HPLC分析，每個樣品平行進(jìn)樣3次．

標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立及精密度、回收率考察：精密稱定瑞格列奈，用甲醇配成1 mg/mL的瑞格列奈儲備液，稀釋后配制成不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取20 μL加入到180 μL空白血漿中，依上法處理血漿樣品后，進(jìn)行色譜分析，以峰面積對質(zhì)量濃度(μg/mL)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線．取一定質(zhì)量濃度的瑞格列奈血漿樣品，處理后在相同條件下每隔3 h進(jìn)樣分析，連續(xù)測定5 d，考察方法的日間和日內(nèi)精密度．在含藥物的血漿中加入瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)溶液，配成低、中、高質(zhì)量濃度(1、10和40 μg/mL)的樣品各5份，處理后進(jìn)行HPLC分析，計算高、中、低3種質(zhì)量濃度的回收率．

兔體內(nèi)藥代動力學(xué)研究：將12只健康的新西蘭兔隨機(jī)分為正常組和電致孔組，每組雌雄各半，實驗前12 h禁食．除去兔背部正中至兩側(cè)5 cm×5 cm區(qū)域體毛，正常組于一側(cè)均勻涂敷瑞格列奈水凝膠，給藥劑量為10 mg/kg．電致孔組用無水乙醇潤濕兔背部皮膚后，將導(dǎo)電電極分別接在DLZ-G型電腦中頻治療儀的正負(fù)電極上，然后貼于家兔背部電致孔處理20 min，涂抹與正常組等量水凝膠．分別于0.083、0.25、0.5、1、2、4、6、8、12、24、36和48 h兔耳緣靜脈取血0.5 mL，置于含肝素的EP管中．經(jīng)處理后在選定的色譜條件下進(jìn)樣分析，采用DAS 2.0軟件計算藥物的體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)及藥-時曲線下面積(AUC)．同時，采取自制RPG-Arg水凝膠各個時間點(diǎn)下的累積釋放量(Q)與體內(nèi)累積AUC之間的相關(guān)性來評價自制載藥水凝膠的體內(nèi)外相關(guān)性．

2 結(jié)果與討論

2.1 瑞格列奈-精氨酸(RPG-Arg)復(fù)合物XRD表征

圖1A為瑞格列奈、精氨酸、RPG-Arg復(fù)合物、瑞格列奈與精氨酸的物理混合物粉末衍射圖譜.

a.瑞格列奈;b.精氨酸;c.瑞格列奈與精氨酸的物理混合物(質(zhì)量比5∶4);d.RPG-Arg復(fù)合物(質(zhì)量比5∶4).圖1 XRD衍射圖譜(A)，在PBS 7.4緩沖液中RPG-ARG復(fù)合物和RPG藥物的釋放曲線(B)Fig.1 X-ray powder diffractions(A), drug release from RPG-ARG complex and RPG at PBS 7.4 solution(B)

瑞格列奈主要特征峰出現(xiàn)在7.6°、10.0°、13.7°、15.2°、16.6°、20.1°、22.6°、25.3°和30.8°等處[14]，精氨酸的特征結(jié)晶峰出現(xiàn)在10.9°、14.9°、16.9°、18.2°、19.2°、23.1°和27.3°等處[15]．其物理混合圖譜中，瑞格列奈和精氨酸的特征結(jié)晶峰依然存在，二者結(jié)晶態(tài)未變．與游離藥物相比，RPG-Arg復(fù)合物(質(zhì)量比5∶4)中無明顯結(jié)晶峰，說明添加精氨酸助溶劑后，2種分子通過分子間氫鍵作用，形成了RPG-Arg復(fù)合物，導(dǎo)致瑞格列奈和精氨酸由原有結(jié)晶態(tài)變?yōu)闊o定形態(tài)，利于藥物的快速溶出，導(dǎo)致皮膚內(nèi)外的藥物高濃度差，可有效促進(jìn)藥物的經(jīng)皮滲透，即用RPG-Arg復(fù)合物可保證透皮給藥時皮膚滲透端的藥物高濃度．當(dāng)RPG-Arg復(fù)合物中藥物以無定形狀態(tài)存在會促進(jìn)復(fù)合物中藥物釋放，如圖1B，RPG原型藥物在PBS 7.4釋放液中釋放緩慢，5 h僅釋放38%，而同條件下，RPG-Arg復(fù)合物中藥物釋放可達(dá)88%.因此，RPG-Arg復(fù)合物可有效保證透皮給藥中RPG藥物在皮膚釋放端的高濃度，利于藥物透皮吸收.

2.2 RPG-Arg復(fù)合物凝膠體外滲透

圖2 瑞格列奈水凝膠中藥物的累積釋放曲線Fig.2 Repaglinide release profile of the hydrogel

藥物水凝膠處方成分進(jìn)行紫外掃描，水凝膠處方中基質(zhì)對藥物測定無干擾.測定瑞格列奈藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y= 0.00 947x- 0.001 67(r=0.999)，線性為0.1～10 μg/mL．日內(nèi)和日間的RSD值分別為3.47%和3.75%．在制備的凝膠劑中分別添加高、中、低質(zhì)量濃度的瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)液，測定后計算得到瑞格列奈的高、中、低平均回收率均高于98%(n=5)．結(jié)果表明，樣品檢測方法可靠、準(zhǔn)確，符合樣品分析方法要求．

計算藥物的單位面積累積滲透量(Q)和藥物透皮吸收百分率，向擴(kuò)散池中放入5 g水凝膠，含藥25 mg.以Q為縱坐標(biāo)，時間(t)為橫坐標(biāo)，得到瑞格列奈水凝膠中藥物體外累積釋放曲線．由圖2可知，藥物在12 h之內(nèi)釋放較緩慢，在12 ～ 48 h內(nèi)釋放加快，48 h藥物的累積釋放率達(dá)到了處方量的29%．此外，如表1所示，瑞格列奈水凝膠中藥物單位面積的累積釋放量與時間存在良好的線性關(guān)系(r2= 0.978)，水凝膠中藥物釋放接近零級動力學(xué)方程，遵循Fick’s擴(kuò)散機(jī)制．

表1 瑞格列奈水凝膠中藥物累積滲透量與時間的擬合方程

兔血樣中瑞格列奈標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=1 695x+15 925(r=0.997；n=6)，線性為0.1～80 μg/mL，血清中內(nèi)源性物質(zhì)對瑞格列奈測定無干擾，藥物出峰時間在8.9 min．檢測方法日內(nèi)和日間精密度RSD值分別為2.66%和5.35%．高、中和低3種質(zhì)量濃度瑞格列奈加樣回收率分別為100.1%、97.7%、95.7%(n=5)，結(jié)果均符合生物樣品定量分析的要求．

表2 瑞格列奈載藥水凝膠正常組、電致孔組兔體內(nèi)藥代動力學(xué)參數(shù)(n=3)

表2和圖3所示，正常組水凝膠涂敷兔皮膚后，被動擴(kuò)散的藥物在6 h其ρmax達(dá)到15.7 μg/mL，24 h后藥物開始緩慢釋放，直到48 h藥物質(zhì)量濃度維持在1.5 μg/mL，說明凝膠可長時間維持血藥濃度，達(dá)到緩釋的目的．對比被動擴(kuò)散組，電致孔組縮短了藥物在皮膚內(nèi)的滯留時間，兔體內(nèi)血藥質(zhì)量濃度提前至4 h達(dá)峰且增大了藥物滲透量，ρmax為23.9 μg/mL，AUC0-48為647.7 μg·h/mL，是正常組滲透量的近2倍，皮膚經(jīng)過電致孔處理后，脂質(zhì)雙分子層的排列順序被打破，形成了親水性孔道，使原本滯留在皮膚內(nèi)的藥物順利通過．此外，高壓脈沖作用可能提高了膜的滲透性，使之協(xié)同促進(jìn)藥物滲透，進(jìn)而提高藥物的滲透量，使藥物持續(xù)滲透，提高藥物的體內(nèi)生物利用度．

體內(nèi)外相關(guān)性是通過藥物體外溶出特征來預(yù)測體內(nèi)反應(yīng)的一種相關(guān)關(guān)系的數(shù)學(xué)模型，針對難溶藥物來說，建立體內(nèi)外相關(guān)性非常重要．由于體外溶出可反映藥物體內(nèi)吸收，即通過體外水凝膠藥物的釋放曲線來預(yù)測水凝膠中藥物的兔體內(nèi)吸收情況．體內(nèi)生物利用度(AUC)與藥物進(jìn)入體循環(huán)的量成正比.本實驗各時間點(diǎn)瑞格列奈凝膠劑的兔體外單位面積藥物累積滲透量(x)和體內(nèi)藥物累積AUC(y)，見表3.以AUC為縱坐標(biāo)，滲透量Q為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，以相關(guān)系數(shù)r較大者建立水凝膠的體內(nèi)外相關(guān)模型，如圖4．通過線性回歸得到體內(nèi)外相關(guān)線性方程為y=1.960 7x-25.33，r=0.98(n=12)．結(jié)果顯示自制載藥水凝膠具備良好的體內(nèi)外相關(guān)性，說明可以通過水凝膠體外釋放來預(yù)測水凝膠中藥物的透皮吸收．

表3 各時間點(diǎn)下瑞格列奈的體內(nèi)外累積釋放

圖3 兔正常組給藥與電致孔組透皮 給藥的血藥濃度-時間曲線Fig.3 Plasma drug concentration-time curve for passive diffusion and electroporation diffusion

圖4 瑞格列奈水凝膠中藥物體內(nèi)累積生物利用度(AUC) 與體外累積滲透量的線性回歸Fig.4 Linear regression plot of accumulated absorbed in vivo AUC versus accumulated released in vitro of repaglinide hydrogel

3 結(jié)論

本文考察電致孔技術(shù)對自制瑞格列奈水凝膠透皮吸收的影響.采用HPLC進(jìn)行樣品分析，以離體鼠皮為介質(zhì)，瑞格列奈水凝膠劑的體外透皮釋放接近零級方程．兔涂敷瑞格列奈水凝膠，在48 h內(nèi)可緩釋藥物．兔皮膚電致孔處理，涂敷等量藥物水凝膠，血藥濃度的達(dá)峰時間縮短2 h且體內(nèi)藥物生物利用度顯著增大．因此，電致孔處理皮膚后涂敷載藥水凝膠可有效促進(jìn)藥物的經(jīng)皮吸收．此外，瑞格列奈水凝膠劑體內(nèi)外釋放具有顯著相關(guān)性，通過水凝膠體外釋放可推測藥物水凝膠的體內(nèi)吸收．