侯曉杰 梁魁景 于占晶

（衡水學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院 河北 衡水 053000）

梨黑斑病(A.kikuchiana)的發(fā)生給廣大梨農(nóng)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。梨黑斑病具有發(fā)病部位廣、危害時間長等特點(diǎn)，主要危害梨的葉、芽和果實(shí)。2004年，美國和加拿大對有梨黑斑病的品種進(jìn)行篩選和舍取，在當(dāng)時很大程度上影響了我國果樹經(jīng)濟(jì)的發(fā)展趨勢。

目前，對梨黑斑病的防治主要從化學(xué)療法方面進(jìn)行干預(yù)。然而，化學(xué)殺菌劑對人類的健康會造成很大影響，并且長期依賴單一殺菌劑可能導(dǎo)致病原菌變異。因此，急需尋找一種更安全的防治梨黑斑病的技術(shù)，代替或者輔助化學(xué)農(nóng)藥防治。

生物防治具有成本低、無污染、不破壞土壤結(jié)構(gòu)、能保持農(nóng)業(yè)生態(tài)平衡、有害微生物不易產(chǎn)生抗性、易于產(chǎn)業(yè)化等一系列優(yōu)點(diǎn)，因此被認(rèn)為是最高效的生物控制措施，近年來在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到越來越廣泛的應(yīng)用，可作為植物病害防治的新的發(fā)展途徑。目前，植物內(nèi)生細(xì)菌的生物防范研究和實(shí)踐在全世界生物研究領(lǐng)域中具有不可忽視的重要作用。李長根等采用分離自銀杏組織的內(nèi)生細(xì)菌的發(fā)酵液提取物來抑制林木變色真菌。宋美仙從銀杏組織中分離篩選出對蘿卜軟腐病菌有較強(qiáng)抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌。研究人員對從西梅(PrunusdomesticaL.)果實(shí)表面分離到的拮抗細(xì)菌XM2進(jìn)行鑒定，進(jìn)一步證實(shí)細(xì)菌XM2對梨黑斑病菌的產(chǎn)生能夠起到抑制作用。本試驗(yàn)的目的是篩選優(yōu)質(zhì)梨黑斑病拮抗菌。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料。梨黑斑病菌、20種中藥內(nèi)生細(xì)菌，均由衡水學(xué)院園林植物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果初篩。采用平板對峙法。超凈工作臺上對梨黑斑菌邊緣打取菌餅，用接種鏟將其接種到PDA平板中心。用無菌接種環(huán)將中藥內(nèi)生菌接種在病原菌上下2.5cm處，畫一直線，每株菌設(shè)3個重復(fù)，同時設(shè)置對照。倒置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，48h后觀察并測量菌落生長情況，之后每隔24h測量1次，直到對照滿為止，計算抑制率。選擇對梨黑斑病有較好抑制作用的內(nèi)生細(xì)菌繼續(xù)進(jìn)行試驗(yàn)。

1.2.2 梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果復(fù)篩。采用濾紙片法。同上將梨黑斑病菌菌餅接種在PDA平板中央，在距離病原菌周圍3cm處放置3個無菌濾紙片，使之形成等邊三角形，在濾紙上滴入20μlOD值為0.600的細(xì)菌菌懸液，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，待48h后觀察并測量菌落生長情況，之后每隔24h測量1次，直至對照長滿，并計算抑菌率。抑菌率計算公式：菌絲生長抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。使用MicrsoftExcel2019繪制和分析數(shù)據(jù)，并使用SPSS22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 梨黑斑病菌拮抗中藥內(nèi)生菌的篩選。由表1可知，在20種內(nèi)生菌中，益母草葉6、益母草葉2、益母草葉4、益母草葉1、知母根6和益母草葉8等6種內(nèi)生菌對梨黑斑病菌有較顯著抑制作用，抑制率分別達(dá)到92.55%、90.98%、88.63%、83.92%、80.78%和80.00%。這6種細(xì)菌之間差異不顯著，選取進(jìn)行下一步試驗(yàn)；而益母草根2、益母草根4、知母根5、知母葉2、知母根3、知母葉1、知母根4這7種細(xì)菌抑菌效果不明顯，抑菌率低于30%，分別為2.74%、7.84%、7.84%、9.41%、14.15%、17.25%、26.27%，這7種細(xì)菌的抑菌效果較差，舍去；其余7種細(xì)菌抑菌效果一般，抑菌率在30%～80%，與內(nèi)生菌益母草葉4、益母草葉1、知母根6、益母草葉6、益母草葉2、益母草葉8差異顯著，舍去。

表1 中藥內(nèi)生細(xì)菌對梨黑斑病菌菌絲生長抑制效果

2.2 中藥內(nèi)生細(xì)菌對梨黑斑病菌菌絲生長的拮抗性能比較。根據(jù)初篩結(jié)果，對選用的6種對病菌抑制效果較好的內(nèi)生菌，用濾紙片法進(jìn)行復(fù)篩，結(jié)果如表2所示。由表2可知，這6種中藥內(nèi)生細(xì)菌對梨黑斑病菌都具有抑制作用，其中益母草葉4抑制效果最好，平均抑菌率達(dá)到60.39%，益母草葉1、知母根6和益母草葉6抑菌效果次之，平均抑菌率分別為50.72%、49.15%和47.96%，而益母草葉2和益母草葉8抑制效果一般，平均抑菌率分別為42.75%、40.39%。益母草葉4與其他幾種內(nèi)生細(xì)菌之間差異顯著。益母草葉1、知母根6和益母草葉6三者之間無顯著差異，但三者與益母草葉8和益母草葉2差異顯著。益母草葉8和益母草葉2兩者無顯著差異。

表2 初篩得到的內(nèi)生細(xì)菌對梨黑斑病菌菌絲生長抑制效果

3 結(jié)論與討論

本次試驗(yàn)是對從藥用植物益母草和知母的根、莖、葉中分離提取出的20種內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研究，大部分內(nèi)生細(xì)菌對梨黑斑病菌有著較好的抑菌效果，這之中益母草葉4對抗菌群產(chǎn)生的防御最強(qiáng)，抑菌率達(dá)60.39%，能夠達(dá)到比其他內(nèi)生細(xì)菌更加穩(wěn)定和強(qiáng)烈的效果，而益母草葉1、知母根6、益母草葉6對病原菌抑制效果較好，抑菌率分別是50.72%、49.15%、47.96%，對拮抗性菌株需要一步研究其作用機(jī)理及發(fā)酵條件等。

內(nèi)生細(xì)菌在防治植物病害和促進(jìn)植物健康生長方面具有非常巨大的應(yīng)用潛力。內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)一步構(gòu)成植物內(nèi)部自然的防御體系，在植物生長中，起到全面化、多元性的預(yù)防和促進(jìn)的作用。內(nèi)生細(xì)菌在藥用植物益母草、黃芪、防風(fēng)和知母等的根、莖、葉中廣泛存在，種類多樣。目前，學(xué)術(shù)界對農(nóng)作物、果樹以及蔬菜方面的病害生防菌的篩選研究為本試驗(yàn)提供了大量理論依據(jù)。本試驗(yàn)研究表明，益母草葉4的抑制作用能夠在梨黑斑病菌中發(fā)揮效用，這為進(jìn)一步研究中藥內(nèi)生菌防治梨黑斑病奠定了基礎(chǔ)。隨著生物防治技術(shù)的提高，再配合合理的化學(xué)防治，將會更好的促進(jìn)農(nóng)林業(yè)健康發(fā)展，更好地維護(hù)環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。