侯曉杰 梁魁景 于占晶

（衡水學院生命科學學院 河北 衡水 053000）

梨黑斑病(A.kikuchiana)的發(fā)生給廣大梨農(nóng)造成了嚴重的經(jīng)濟損失。梨黑斑病具有發(fā)病部位廣、危害時間長等特點，主要危害梨的葉、芽和果實。2004年，美國和加拿大對有梨黑斑病的品種進行篩選和舍取，在當時很大程度上影響了我國果樹經(jīng)濟的發(fā)展趨勢。

目前，對梨黑斑病的防治主要從化學療法方面進行干預。然而，化學殺菌劑對人類的健康會造成很大影響，并且長期依賴單一殺菌劑可能導致病原菌變異。因此，急需尋找一種更安全的防治梨黑斑病的技術，代替或者輔助化學農(nóng)藥防治。

生物防治具有成本低、無污染、不破壞土壤結構、能保持農(nóng)業(yè)生態(tài)平衡、有害微生物不易產(chǎn)生抗性、易于產(chǎn)業(yè)化等一系列優(yōu)點，因此被認為是最高效的生物控制措施，近年來在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中得到越來越廣泛的應用，可作為植物病害防治的新的發(fā)展途徑。目前，植物內(nèi)生細菌的生物防范研究和實踐在全世界生物研究領域中具有不可忽視的重要作用。李長根等采用分離自銀杏組織的內(nèi)生細菌的發(fā)酵液提取物來抑制林木變色真菌。宋美仙從銀杏組織中分離篩選出對蘿卜軟腐病菌有較強抑制作用的內(nèi)生細菌。研究人員對從西梅(PrunusdomesticaL.)果實表面分離到的拮抗細菌XM2進行鑒定，進一步證實細菌XM2對梨黑斑病菌的產(chǎn)生能夠起到抑制作用。本試驗的目的是篩選優(yōu)質(zhì)梨黑斑病拮抗菌。

1 材料與方法

1.1 試驗材料。梨黑斑病菌、20種中藥內(nèi)生細菌，均由衡水學院園林植物實驗室提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果初篩。采用平板對峙法。超凈工作臺上對梨黑斑菌邊緣打取菌餅，用接種鏟將其接種到PDA平板中心。用無菌接種環(huán)將中藥內(nèi)生菌接種在病原菌上下2.5cm處，畫一直線，每株菌設3個重復，同時設置對照。倒置于28℃培養(yǎng)箱內(nèi)暗培養(yǎng)，48h后觀察并測量菌落生長情況，之后每隔24h測量1次，直到對照滿為止，計算抑制率。選擇對梨黑斑病有較好抑制作用的內(nèi)生細菌繼續(xù)進行試驗。

1.2.2 梨黑斑病菌菌絲生長的室內(nèi)抑菌效果復篩。采用濾紙片法。同上將梨黑斑病菌菌餅接種在PDA平板中央，在距離病原菌周圍3cm處放置3個無菌濾紙片，使之形成等邊三角形，在濾紙上滴入20μlOD值為0.600的細菌菌懸液，在28℃恒溫培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，待48h后觀察并測量菌落生長情況，之后每隔24h測量1次，直至對照長滿，并計算抑菌率。抑菌率計算公式：菌絲生長抑制率(%)=[(對照菌落直徑-處理菌落直徑)/對照菌落直徑]×100%。

1.2.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。使用MicrsoftExcel2019繪制和分析數(shù)據(jù)，并使用SPSS22.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。

2 結果與分析

2.1 梨黑斑病菌拮抗中藥內(nèi)生菌的篩選。由表1可知，在20種內(nèi)生菌中，益母草葉6、益母草葉2、益母草葉4、益母草葉1、知母根6和益母草葉8等6種內(nèi)生菌對梨黑斑病菌有較顯著抑制作用，抑制率分別達到92.55%、90.98%、88.63%、83.92%、80.78%和80.00%。這6種細菌之間差異不顯著，選取進行下一步試驗；而益母草根2、益母草根4、知母根5、知母葉2、知母根3、知母葉1、知母根4這7種細菌抑菌效果不明顯，抑菌率低于30%，分別為2.74%、7.84%、7.84%、9.41%、14.15%、17.25%、26.27%，這7種細菌的抑菌效果較差，舍去；其余7種細菌抑菌效果一般，抑菌率在30%～80%，與內(nèi)生菌益母草葉4、益母草葉1、知母根6、益母草葉6、益母草葉2、益母草葉8差異顯著，舍去。

表1 中藥內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌菌絲生長抑制效果

2.2 中藥內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌菌絲生長的拮抗性能比較。根據(jù)初篩結果，對選用的6種對病菌抑制效果較好的內(nèi)生菌，用濾紙片法進行復篩，結果如表2所示。由表2可知，這6種中藥內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌都具有抑制作用，其中益母草葉4抑制效果最好，平均抑菌率達到60.39%，益母草葉1、知母根6和益母草葉6抑菌效果次之，平均抑菌率分別為50.72%、49.15%和47.96%，而益母草葉2和益母草葉8抑制效果一般，平均抑菌率分別為42.75%、40.39%。益母草葉4與其他幾種內(nèi)生細菌之間差異顯著。益母草葉1、知母根6和益母草葉6三者之間無顯著差異，但三者與益母草葉8和益母草葉2差異顯著。益母草葉8和益母草葉2兩者無顯著差異。

表2 初篩得到的內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌菌絲生長抑制效果

3 結論與討論

本次試驗是對從藥用植物益母草和知母的根、莖、葉中分離提取出的20種內(nèi)生細菌進行研究，大部分內(nèi)生細菌對梨黑斑病菌有著較好的抑菌效果，這之中益母草葉4對抗菌群產(chǎn)生的防御最強，抑菌率達60.39%，能夠達到比其他內(nèi)生細菌更加穩(wěn)定和強烈的效果，而益母草葉1、知母根6、益母草葉6對病原菌抑制效果較好，抑菌率分別是50.72%、49.15%、47.96%，對拮抗性菌株需要一步研究其作用機理及發(fā)酵條件等。

內(nèi)生細菌在防治植物病害和促進植物健康生長方面具有非常巨大的應用潛力。內(nèi)生細菌進一步構成植物內(nèi)部自然的防御體系，在植物生長中，起到全面化、多元性的預防和促進的作用。內(nèi)生細菌在藥用植物益母草、黃芪、防風和知母等的根、莖、葉中廣泛存在，種類多樣。目前，學術界對農(nóng)作物、果樹以及蔬菜方面的病害生防菌的篩選研究為本試驗提供了大量理論依據(jù)。本試驗研究表明，益母草葉4的抑制作用能夠在梨黑斑病菌中發(fā)揮效用，這為進一步研究中藥內(nèi)生菌防治梨黑斑病奠定了基礎。隨著生物防治技術的提高，再配合合理的化學防治，將會更好的促進農(nóng)林業(yè)健康發(fā)展，更好地維護環(huán)境的可持續(xù)發(fā)展。