姚亞楠，豐葉青，耿晶晶，徐玉梅*，趙增旗,2，王建明

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，晉中 030801；2. 新西蘭土地環(huán)境保護(hù)研究所，奧克蘭 1072）

根結(jié)線蟲（Root-knot nematode）是一種重要的植物病原線蟲，可侵染5500多種植物[1-3]，造成全球糧食損失的5%[4]。此外，根結(jié)線蟲還與其他病原物形成復(fù)合侵染從而增加損失程度[5]。同時(shí)因殘留、抗性和環(huán)保等問題，許多常用的化學(xué)殺線劑被禁用或限用[6]，從而造成了生產(chǎn)上可供選擇的藥劑種類大幅減少。因此尋求或開拓新的生防菌劑是生產(chǎn)上亟需解決的一個(gè)重要課題。

在生防菌劑中，細(xì)菌占有重要的位置。目前，用于防治根結(jié)線蟲的生防細(xì)菌有枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌B. cereus、阿氏芽胞桿菌B. aryabhattai、惡臭假單胞菌Pseudomonas putida、熒光假單胞菌P. fluorescens、變形斑沙雷氏菌Serratia proteamaculans、蜂房類芽胞桿菌Paenibacillus alvei等[7-10]，這些對(duì)根結(jié)線蟲都具有良好的防效和明顯的植物促生效果。由于在根結(jié)線蟲生活的根際土壤中存在著大量的有益拮抗微生物[11]，因此從根際土壤中篩選和挖掘能夠有效拮抗根結(jié)線蟲的生防菌是尋求或開拓新的生防細(xì)菌的有效途徑。

本研究以從晉中市太谷區(qū)西葫蘆大棚根結(jié)線蟲發(fā)病植株根際土壤中分離到的菌株 A-29為對(duì)象，測定其對(duì)根結(jié)線蟲2齡幼蟲和卵的抑制作用及盆栽防效；并通過形態(tài)學(xué)和生理生化特性以及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)菌株A-29進(jìn)行種類鑒定，以期為該生防菌應(yīng)用于根結(jié)線蟲的防控提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離保存

菌株 A-29采集于山西省晉中市太谷區(qū)里修村溫室中，采集根結(jié)線蟲發(fā)病的西葫蘆根際土壤，將土壤稀釋后涂布于NA培養(yǎng)基中分離純化，菌株冷藏備用。

1.2 菌株A-29發(fā)酵濾液、南方根結(jié)線蟲卵和2齡幼蟲懸浮液的制備

將菌株A-29接種在NA平板上，28 ℃光照培養(yǎng)24 h，取直徑6 mm菌餅接種于NA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)48 h后，8000 r/min離心5 min，將上清液用0.22 μm濾膜過濾，得到菌株A-29的發(fā)酵濾液（OD600＝0.8）[12]。

選取根結(jié)線蟲侵染的番茄根系，沖洗干凈后，置于體視鏡下挑取卵囊，用0.3% NaClO消毒，渦旋振蕩，加蒸餾水，制備成濃度為1000個(gè)/mL的卵懸浮液。

將消毒的卵囊置于溫潤的小皿中，28 ℃ 恒溫孵化48 h，收取2齡幼蟲（J2），加蒸餾水，制備成濃度為1000頭/mL的J2懸浮液。

1.3 菌株A-29發(fā)酵濾液對(duì)2齡幼蟲抑殺作用和卵孵化抑制率的測定

在12孔板的每孔中加入J2懸浮液50 μL，分別吸取菌株A-29發(fā)酵濾液原液、5倍和10倍稀釋液各1 mL于12孔板中，以無菌NA培養(yǎng)液為對(duì)照，重復(fù)3次，于24 h和48 h時(shí)，統(tǒng)計(jì)J2死亡情況。以體視顯微鏡下觀察，針尖接觸蟲體不動(dòng)，則視為死亡[13]。J2死亡率＝死亡線蟲數(shù)/供試線蟲總數(shù)×100%。

在12孔板中加入菌株A-29發(fā)酵濾液和卵懸浮液，處理方法同上。4 d后統(tǒng)計(jì)卵孵化情況[15]。卵孵化抑制率＝未孵化的卵量/卵總量×100%。

1.4 菌株A-29發(fā)酵液防治根結(jié)線蟲的室內(nèi)盆栽試驗(yàn)

番茄植株準(zhǔn)備：番茄種子先用NaClO消毒，然后清水沖洗2次，經(jīng)催芽后，播種于裝有經(jīng)高壓滅菌的肥沃土壤與育苗基質(zhì)1:1混合的花盆中，待番茄植株2片真葉完全展開后再移栽，每盆1株番茄苗，按常規(guī)進(jìn)行管理。

盆栽防效測定：設(shè)置菌株A-29發(fā)酵液（OD600＝0.8）、阿維菌素油乳劑和清水灌根3個(gè)處理。番茄植株移植3～5 d后，分別以菌株A-29發(fā)酵液15 mL，5%阿維菌素油乳劑1000倍200 mL，清水15 mL灌根。每處理6株，重復(fù)4次。灌根處理3 d后，在距番茄植株根部2 cm的土壤中打6～8 cm深的孔，然后注入1 mL的J2懸浮液，以后按常規(guī)進(jìn)行管理。接種60 d后，記錄并統(tǒng)計(jì)番茄植株鮮重、植株高度和根系干重，并采用Bridge & Page[14]的分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)病情級(jí)別，計(jì)算根結(jié)指數(shù)和防效，所得數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

1.5 菌株A-29的種類鑒定

形態(tài)特征及染色反應(yīng)：依照方中達(dá)等[15]進(jìn)行菌株A-29的鑒定，具體包括菌株的培養(yǎng)性狀、菌體形狀及大小、革蘭氏染色反應(yīng)、鞭毛及芽胞染色反應(yīng)。

生理生化特征分析：依照方中達(dá)等[15]進(jìn)行菌株A-29的生理生化特征分析，具體指標(biāo)包括接觸酶、氧化酶、過氧化酶活性，能否利用檸檬酸鹽、蔗糖、淀粉、亮氨酸、谷氨酸、硝酸鹽。

分子生物學(xué)鑒定：將菌株A-29接種于LB培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取1 mL培養(yǎng)菌液，按Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物（27F：5′-AGTTTATCMTGGCTC AG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[16]。25 μL PCR 擴(kuò)增體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，TaqDNA 聚合酶0.2 μL，引物各 0.5 μL，DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 19.8 μL。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸10 min。測序由上海生物工程公司完成，測序結(jié)果用Sequencher 5.1.2編輯拼接。選取序列同源性較高的蒼白桿菌屬代表性種類的 20條 16S rRNA序列，用P. lautus（NR040882）和P. alginolyticus（NR040893）做外群，構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。采用Clustal X2軟件進(jìn)行序列比對(duì)，GeneDoc編輯序列比對(duì)結(jié)果，jModelTest 2.1.4獲取最佳模型GTR＋I(xiàn)＋G，MrBayes 3.2.7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，F(xiàn)igTree v1.4.3讀取結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株A-29發(fā)酵濾液對(duì)南方根結(jié)線蟲的致死效果測定

2.1.1 對(duì)J2的致死效果 試驗(yàn)結(jié)果（圖1）表明，不同濃度的菌株A-29發(fā)酵濾液對(duì)J2都有明顯的致死效果，其中原液、5倍液和10倍液處理24 h后，J2死亡率分別為85.67%、79.61%、71.09%；處理48 h后，J2死亡率分別為95.45%、87.62%、77.04%。同時(shí)隨處理濃度的增高和處理時(shí)間的延長，J2死亡率也隨之提高。

圖1 菌株A-29發(fā)酵濾液對(duì)南方根結(jié)線蟲J2的致死效果Fig. 1 The effects of strain A-29 fermentation filtrate on J2 mortality ofM. incognita in vitro

2.1.2 對(duì)卵孵化的抑殺效果 不同濃度菌株 A-29發(fā)酵濾液對(duì)南方根結(jié)線蟲的卵孵化均有一定程度的抑制（圖2）。用原液、5倍液、10倍液處理卵4 d后，卵孵化抑制率分別為87.86%、69.30%、59.25%，且卵孵化抑制率隨著發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)的增加而降低，各處理間的抑制率呈顯著性差異。

圖2 菌株A-29發(fā)酵濾液對(duì)南方根結(jié)線蟲卵孵化的抑制效果Fig. 2 The egg hatching inhibition effect of strain A-29 fermentation filtrate onM. incognita in vitro

2.2 菌株A-29發(fā)酵液防治根結(jié)線蟲的盆栽防效及促生作用

2.2.1 盆栽防效 菌株A-29發(fā)酵液處理后根結(jié)指數(shù)明顯降低，防治效果達(dá)75.00%，而略低于阿維菌素處理防效（87.5%），但與阿維菌素處理間沒有顯著差異（表1）。

表1 菌株A-29發(fā)酵液對(duì)番茄根結(jié)線蟲的盆栽效果Table 1 Control efficacy of A-29 fermentation broth onM. incognitain pot experiments

2.2.2 促生作用 菌株A-29發(fā)酵液處理對(duì)番茄植株具有明顯的促生作用。菌株A-29發(fā)酵液處理60 d后，植株鮮重、根系干重和植株高度與清水及阿維菌素處理相比，均有顯著性增加，其中植株鮮重分別增加38.41%和21.19%，根系干重分別增加33.52%和7.55%，植株高度分別增加20.01%和21.51%（表2）。

表2 菌株A-29發(fā)酵液對(duì)盆栽番茄生物量的影響Table 2 Effects of A-29 fermentation broth on tomato biomass in pot experiments

2.3 菌株A-29的種類鑒定

2.3.1 菌株A-29的形態(tài)特征 菌株A-29在NA固體培養(yǎng)基上的菌落呈白色，不規(guī)則形，邊緣不整齊，有隆起（圖3A）。菌體為短桿狀，大小為0.6～1.7 μm×1.4～4.7 μm，革蘭氏染色為陰性（圖3B），無芽胞（圖3C），無鞭毛（圖3D）。和過氧化酶呈陽性，能利用檸檬酸鹽、蔗糖，亮氨酸，可水解淀粉，將硝酸鹽還原，不能利用谷氨酸。這些生理生化特性與假格里尼翁蒼白桿菌Ochrobactrum pseudogrignonense相符。

圖3 菌株A-29的培養(yǎng)性狀（A）、革蘭氏染色（B）、芽胞染色（C）及鞭毛染色（D）結(jié)果Fig. 3 Culture characteristics (A), gram staining (B), spore staining (C) and flagella staining (D) of strain A-29

2.3.2 菌株A-29的生理生化特征 菌株A-29的生理生化特征如表3所示。菌株A-29的接觸酶、氧化酶

表3 菌株A-29的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain A-29

2.3.3 菌株A-29的分子生物學(xué)鑒定 菌株A-29 16S rRNA基因序列目的基因片段1423 bp，提交NCBI序列比對(duì)后，與假格里尼翁蒼白桿菌（O. pseudogrignonense，JX266314）的序列相似度最高，達(dá)100%。采用GIR＋I(xiàn)＋G模型構(gòu)建16S rRNA貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）顯示，菌株A-29與4個(gè)假格里尼翁蒼白桿菌（JX266314、KF312237、AM422371和LN875377）聚在同一支上，置信度達(dá)95%。

圖4 基于16S rRNA基因序列的菌株A-29貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（后驗(yàn)概率＞50%的標(biāo)注在相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)上）Fig. 4 Bayesian phylogenetic tree of strain A-29 based on the 16S rRNA gene sequence (posterior probability values greater than 50% are given on appropriate clades)

綜合以上形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果，菌株A-29鑒定為假格里尼翁蒼白桿菌。

3 討論

菌株 A-29是從西葫蘆根際土壤中分離的對(duì)南方根結(jié)線蟲具有良好抑殺效果的生防菌株。通過形態(tài)特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析，鑒定該菌株為假格里尼翁蒼白桿菌。

假格里尼翁蒼白桿菌是Kampfer首次從瑞典人體血液和挪威人耳中分離得到的一種細(xì)菌，隸屬于變形菌門Proteobacteria，α-變形菌綱Alphaproteobacteria。本試驗(yàn)分離得到的菌株A-29在形態(tài)上與Kampfer等原始報(bào)道和向梅春[18]報(bào)道的NC1菌株略有差異，菌株A-29菌體長為前兩者報(bào)道的2倍有余，這可能是假格里尼翁蒼白桿菌在人體和土壤中存在差異所致。但有關(guān)菌株 A-29對(duì)人體的安全性需做進(jìn)一步的試驗(yàn)和評(píng)估。

目前假格里尼翁蒼白桿菌的一些菌株主要應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境修復(fù)和植物抗病研究中，如銅礦廢水和砷污染土壤修復(fù)[19,20]、小麥根腐病的防治[21]等。但有關(guān)假格里尼翁蒼白桿菌在根結(jié)線蟲生防研究中的報(bào)道較少，僅有NC1菌株用于根結(jié)線蟲的生防研究中。如向梅春等[18]報(bào)道了假格里尼翁蒼白桿菌NC1對(duì)南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲和卵有一定的抑殺效果，并以該菌為有效成分制成生防菌肥對(duì)番茄根結(jié)線蟲有一定的防效；楊婷等[22]用假格里尼翁蒼白桿菌NC1與淡紫紫孢菌和橄欖色鏈霉菌制成混合菌肥對(duì)生菜根結(jié)線蟲具有一定防效。本研究中假格里尼翁蒼白桿菌A-29對(duì)南方根結(jié)線蟲的2齡幼蟲和卵具有較高的抑殺活性，對(duì)番茄植株具有良好的促生效果，與向梅春等[18]報(bào)道一致，有關(guān)其促生機(jī)制可能與蒼白桿菌產(chǎn)生吲哚乙酸（IAA）和ACC脫氫酶，并且具有固氮和溶磷等功效有關(guān)[23-25]，還有待做進(jìn)一步的研究。