姚亞楠，豐葉青，耿晶晶，徐玉梅*，趙增旗,2，王建明

（1. 山西農業(yè)大學植物保護學院，晉中 030801；2. 新西蘭土地環(huán)境保護研究所，奧克蘭 1072）

根結線蟲（Root-knot nematode）是一種重要的植物病原線蟲，可侵染5500多種植物[1-3]，造成全球糧食損失的5%[4]。此外，根結線蟲還與其他病原物形成復合侵染從而增加損失程度[5]。同時因殘留、抗性和環(huán)保等問題，許多常用的化學殺線劑被禁用或限用[6]，從而造成了生產上可供選擇的藥劑種類大幅減少。因此尋求或開拓新的生防菌劑是生產上亟需解決的一個重要課題。

在生防菌劑中，細菌占有重要的位置。目前，用于防治根結線蟲的生防細菌有枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、堅強芽胞桿菌B. cereus、阿氏芽胞桿菌B. aryabhattai、惡臭假單胞菌Pseudomonas putida、熒光假單胞菌P. fluorescens、變形斑沙雷氏菌Serratia proteamaculans、蜂房類芽胞桿菌Paenibacillus alvei等[7-10]，這些對根結線蟲都具有良好的防效和明顯的植物促生效果。由于在根結線蟲生活的根際土壤中存在著大量的有益拮抗微生物[11]，因此從根際土壤中篩選和挖掘能夠有效拮抗根結線蟲的生防菌是尋求或開拓新的生防細菌的有效途徑。

本研究以從晉中市太谷區(qū)西葫蘆大棚根結線蟲發(fā)病植株根際土壤中分離到的菌株 A-29為對象，測定其對根結線蟲2齡幼蟲和卵的抑制作用及盆栽防效；并通過形態(tài)學和生理生化特性以及分子生物學技術對菌株A-29進行種類鑒定，以期為該生防菌應用于根結線蟲的防控提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 供試菌株的分離保存

菌株 A-29采集于山西省晉中市太谷區(qū)里修村溫室中，采集根結線蟲發(fā)病的西葫蘆根際土壤，將土壤稀釋后涂布于NA培養(yǎng)基中分離純化，菌株冷藏備用。

1.2 菌株A-29發(fā)酵濾液、南方根結線蟲卵和2齡幼蟲懸浮液的制備

將菌株A-29接種在NA平板上，28 ℃光照培養(yǎng)24 h，取直徑6 mm菌餅接種于NA液體培養(yǎng)基中，在28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)48 h后，8000 r/min離心5 min，將上清液用0.22 μm濾膜過濾，得到菌株A-29的發(fā)酵濾液（OD600＝0.8）[12]。

選取根結線蟲侵染的番茄根系，沖洗干凈后，置于體視鏡下挑取卵囊，用0.3% NaClO消毒，渦旋振蕩，加蒸餾水，制備成濃度為1000個/mL的卵懸浮液。

將消毒的卵囊置于溫潤的小皿中，28 ℃ 恒溫孵化48 h，收取2齡幼蟲（J2），加蒸餾水，制備成濃度為1000頭/mL的J2懸浮液。

1.3 菌株A-29發(fā)酵濾液對2齡幼蟲抑殺作用和卵孵化抑制率的測定

在12孔板的每孔中加入J2懸浮液50 μL，分別吸取菌株A-29發(fā)酵濾液原液、5倍和10倍稀釋液各1 mL于12孔板中，以無菌NA培養(yǎng)液為對照，重復3次，于24 h和48 h時，統(tǒng)計J2死亡情況。以體視顯微鏡下觀察，針尖接觸蟲體不動，則視為死亡[13]。J2死亡率＝死亡線蟲數/供試線蟲總數×100%。

在12孔板中加入菌株A-29發(fā)酵濾液和卵懸浮液，處理方法同上。4 d后統(tǒng)計卵孵化情況[15]。卵孵化抑制率＝未孵化的卵量/卵總量×100%。

1.4 菌株A-29發(fā)酵液防治根結線蟲的室內盆栽試驗

番茄植株準備：番茄種子先用NaClO消毒，然后清水沖洗2次，經催芽后，播種于裝有經高壓滅菌的肥沃土壤與育苗基質1:1混合的花盆中，待番茄植株2片真葉完全展開后再移栽，每盆1株番茄苗，按常規(guī)進行管理。

盆栽防效測定：設置菌株A-29發(fā)酵液（OD600＝0.8）、阿維菌素油乳劑和清水灌根3個處理。番茄植株移植3～5 d后，分別以菌株A-29發(fā)酵液15 mL，5%阿維菌素油乳劑1000倍200 mL，清水15 mL灌根。每處理6株，重復4次。灌根處理3 d后，在距番茄植株根部2 cm的土壤中打6～8 cm深的孔，然后注入1 mL的J2懸浮液，以后按常規(guī)進行管理。接種60 d后，記錄并統(tǒng)計番茄植株鮮重、植株高度和根系干重，并采用Bridge & Page[14]的分級標準統(tǒng)計病情級別，計算根結指數和防效，所得數據采用Excel和SPSS進行統(tǒng)計和方差分析。

1.5 菌株A-29的種類鑒定

形態(tài)特征及染色反應：依照方中達等[15]進行菌株A-29的鑒定，具體包括菌株的培養(yǎng)性狀、菌體形狀及大小、革蘭氏染色反應、鞭毛及芽胞染色反應。

生理生化特征分析：依照方中達等[15]進行菌株A-29的生理生化特征分析，具體指標包括接觸酶、氧化酶、過氧化酶活性，能否利用檸檬酸鹽、蔗糖、淀粉、亮氨酸、谷氨酸、硝酸鹽。

分子生物學鑒定：將菌株A-29接種于LB培養(yǎng)基中，180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，取1 mL培養(yǎng)菌液，按Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。16S rRNA基因PCR擴增采用細菌通用引物（27F：5′-AGTTTATCMTGGCTC AG-3′；1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）[16]。25 μL PCR 擴增體系：10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1.0 μL，TaqDNA 聚合酶0.2 μL，引物各 0.5 μL，DNA 模板 0.5 μL，ddH2O 19.8 μL。PCR反應程序：94 ℃預變性4 min，94 ℃變性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min。測序由上海生物工程公司完成，測序結果用Sequencher 5.1.2編輯拼接。選取序列同源性較高的蒼白桿菌屬代表性種類的 20條 16S rRNA序列，用P. lautus（NR040882）和P. alginolyticus（NR040893）做外群，構建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。采用Clustal X2軟件進行序列比對，GeneDoc編輯序列比對結果，jModelTest 2.1.4獲取最佳模型GTR＋I＋G，MrBayes 3.2.7軟件構建系統(tǒng)進化樹，FigTree v1.4.3讀取結果。

2 結果與分析

2.1 菌株A-29發(fā)酵濾液對南方根結線蟲的致死效果測定

2.1.1 對J2的致死效果 試驗結果（圖1）表明，不同濃度的菌株A-29發(fā)酵濾液對J2都有明顯的致死效果，其中原液、5倍液和10倍液處理24 h后，J2死亡率分別為85.67%、79.61%、71.09%；處理48 h后，J2死亡率分別為95.45%、87.62%、77.04%。同時隨處理濃度的增高和處理時間的延長，J2死亡率也隨之提高。

圖1 菌株A-29發(fā)酵濾液對南方根結線蟲J2的致死效果Fig. 1 The effects of strain A-29 fermentation filtrate on J2 mortality ofM. incognita in vitro

2.1.2 對卵孵化的抑殺效果 不同濃度菌株 A-29發(fā)酵濾液對南方根結線蟲的卵孵化均有一定程度的抑制（圖2）。用原液、5倍液、10倍液處理卵4 d后，卵孵化抑制率分別為87.86%、69.30%、59.25%，且卵孵化抑制率隨著發(fā)酵濾液稀釋倍數的增加而降低，各處理間的抑制率呈顯著性差異。

圖2 菌株A-29發(fā)酵濾液對南方根結線蟲卵孵化的抑制效果Fig. 2 The egg hatching inhibition effect of strain A-29 fermentation filtrate onM. incognita in vitro

2.2 菌株A-29發(fā)酵液防治根結線蟲的盆栽防效及促生作用

2.2.1 盆栽防效 菌株A-29發(fā)酵液處理后根結指數明顯降低，防治效果達75.00%，而略低于阿維菌素處理防效（87.5%），但與阿維菌素處理間沒有顯著差異（表1）。

表1 菌株A-29發(fā)酵液對番茄根結線蟲的盆栽效果Table 1 Control efficacy of A-29 fermentation broth onM. incognitain pot experiments

2.2.2 促生作用 菌株A-29發(fā)酵液處理對番茄植株具有明顯的促生作用。菌株A-29發(fā)酵液處理60 d后，植株鮮重、根系干重和植株高度與清水及阿維菌素處理相比，均有顯著性增加，其中植株鮮重分別增加38.41%和21.19%，根系干重分別增加33.52%和7.55%，植株高度分別增加20.01%和21.51%（表2）。

表2 菌株A-29發(fā)酵液對盆栽番茄生物量的影響Table 2 Effects of A-29 fermentation broth on tomato biomass in pot experiments

2.3 菌株A-29的種類鑒定

2.3.1 菌株A-29的形態(tài)特征 菌株A-29在NA固體培養(yǎng)基上的菌落呈白色，不規(guī)則形，邊緣不整齊，有隆起（圖3A）。菌體為短桿狀，大小為0.6～1.7 μm×1.4～4.7 μm，革蘭氏染色為陰性（圖3B），無芽胞（圖3C），無鞭毛（圖3D）。和過氧化酶呈陽性，能利用檸檬酸鹽、蔗糖，亮氨酸，可水解淀粉，將硝酸鹽還原，不能利用谷氨酸。這些生理生化特性與假格里尼翁蒼白桿菌Ochrobactrum pseudogrignonense相符。

圖3 菌株A-29的培養(yǎng)性狀（A）、革蘭氏染色（B）、芽胞染色（C）及鞭毛染色（D）結果Fig. 3 Culture characteristics (A), gram staining (B), spore staining (C) and flagella staining (D) of strain A-29

2.3.2 菌株A-29的生理生化特征 菌株A-29的生理生化特征如表3所示。菌株A-29的接觸酶、氧化酶

表3 菌株A-29的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain A-29

2.3.3 菌株A-29的分子生物學鑒定 菌株A-29 16S rRNA基因序列目的基因片段1423 bp，提交NCBI序列比對后，與假格里尼翁蒼白桿菌（O. pseudogrignonense，JX266314）的序列相似度最高，達100%。采用GIR＋I＋G模型構建16S rRNA貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（圖4）顯示，菌株A-29與4個假格里尼翁蒼白桿菌（JX266314、KF312237、AM422371和LN875377）聚在同一支上，置信度達95%。

圖4 基于16S rRNA基因序列的菌株A-29貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹（后驗概率＞50%的標注在相應的節(jié)點上）Fig. 4 Bayesian phylogenetic tree of strain A-29 based on the 16S rRNA gene sequence (posterior probability values greater than 50% are given on appropriate clades)

綜合以上形態(tài)學特征、生理生化特性和分子生物學鑒定結果，菌株A-29鑒定為假格里尼翁蒼白桿菌。

3 討論

菌株 A-29是從西葫蘆根際土壤中分離的對南方根結線蟲具有良好抑殺效果的生防菌株。通過形態(tài)特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及其系統(tǒng)發(fā)育關系分析，鑒定該菌株為假格里尼翁蒼白桿菌。

假格里尼翁蒼白桿菌是Kampfer首次從瑞典人體血液和挪威人耳中分離得到的一種細菌，隸屬于變形菌門Proteobacteria，α-變形菌綱Alphaproteobacteria。本試驗分離得到的菌株A-29在形態(tài)上與Kampfer等原始報道和向梅春[18]報道的NC1菌株略有差異，菌株A-29菌體長為前兩者報道的2倍有余，這可能是假格里尼翁蒼白桿菌在人體和土壤中存在差異所致。但有關菌株 A-29對人體的安全性需做進一步的試驗和評估。

目前假格里尼翁蒼白桿菌的一些菌株主要應用于生態(tài)環(huán)境修復和植物抗病研究中，如銅礦廢水和砷污染土壤修復[19,20]、小麥根腐病的防治[21]等。但有關假格里尼翁蒼白桿菌在根結線蟲生防研究中的報道較少，僅有NC1菌株用于根結線蟲的生防研究中。如向梅春等[18]報道了假格里尼翁蒼白桿菌NC1對南方根結線蟲2齡幼蟲和卵有一定的抑殺效果，并以該菌為有效成分制成生防菌肥對番茄根結線蟲有一定的防效；楊婷等[22]用假格里尼翁蒼白桿菌NC1與淡紫紫孢菌和橄欖色鏈霉菌制成混合菌肥對生菜根結線蟲具有一定防效。本研究中假格里尼翁蒼白桿菌A-29對南方根結線蟲的2齡幼蟲和卵具有較高的抑殺活性，對番茄植株具有良好的促生效果，與向梅春等[18]報道一致，有關其促生機制可能與蒼白桿菌產生吲哚乙酸（IAA）和ACC脫氫酶，并且具有固氮和溶磷等功效有關[23-25]，還有待做進一步的研究。