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        假格里尼翁蒼白桿菌A-29對南方根結(jié)線蟲的防治效果及其鑒定

        2022-04-22 04:29:18姚亞楠豐葉青耿晶晶徐玉梅趙增旗王建明
        中國生物防治學(xué)報(bào) 2022年2期
        關(guān)鍵詞:生防格里濾液

        姚亞楠,豐葉青,耿晶晶,徐玉梅*,趙增旗,2,王建明

        (1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院,晉中 030801;2. 新西蘭土地環(huán)境保護(hù)研究所,奧克蘭 1072)

        根結(jié)線蟲(Root-knot nematode)是一種重要的植物病原線蟲,可侵染5500多種植物[1-3],造成全球糧食損失的5%[4]。此外,根結(jié)線蟲還與其他病原物形成復(fù)合侵染從而增加損失程度[5]。同時因殘留、抗性和環(huán)保等問題,許多常用的化學(xué)殺線劑被禁用或限用[6],從而造成了生產(chǎn)上可供選擇的藥劑種類大幅減少。因此尋求或開拓新的生防菌劑是生產(chǎn)上亟需解決的一個重要課題。

        在生防菌劑中,細(xì)菌占有重要的位置。目前,用于防治根結(jié)線蟲的生防細(xì)菌有枯草芽胞桿菌Bacillus subtilis、堅(jiān)強(qiáng)芽胞桿菌B. cereus、阿氏芽胞桿菌B. aryabhattai、惡臭假單胞菌Pseudomonas putida、熒光假單胞菌P. fluorescens、變形斑沙雷氏菌Serratia proteamaculans、蜂房類芽胞桿菌Paenibacillus alvei等[7-10],這些對根結(jié)線蟲都具有良好的防效和明顯的植物促生效果。由于在根結(jié)線蟲生活的根際土壤中存在著大量的有益拮抗微生物[11],因此從根際土壤中篩選和挖掘能夠有效拮抗根結(jié)線蟲的生防菌是尋求或開拓新的生防細(xì)菌的有效途徑。

        本研究以從晉中市太谷區(qū)西葫蘆大棚根結(jié)線蟲發(fā)病植株根際土壤中分離到的菌株 A-29為對象,測定其對根結(jié)線蟲2齡幼蟲和卵的抑制作用及盆栽防效;并通過形態(tài)學(xué)和生理生化特性以及分子生物學(xué)技術(shù)對菌株A-29進(jìn)行種類鑒定,以期為該生防菌應(yīng)用于根結(jié)線蟲的防控提供理論基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 供試菌株的分離保存

        菌株 A-29采集于山西省晉中市太谷區(qū)里修村溫室中,采集根結(jié)線蟲發(fā)病的西葫蘆根際土壤,將土壤稀釋后涂布于NA培養(yǎng)基中分離純化,菌株冷藏備用。

        1.2 菌株A-29發(fā)酵濾液、南方根結(jié)線蟲卵和2齡幼蟲懸浮液的制備

        將菌株A-29接種在NA平板上,28 ℃光照培養(yǎng)24 h,取直徑6 mm菌餅接種于NA液體培養(yǎng)基中,在28 ℃、180 r/min恒溫培養(yǎng)48 h后,8000 r/min離心5 min,將上清液用0.22 μm濾膜過濾,得到菌株A-29的發(fā)酵濾液(OD600=0.8)[12]。

        選取根結(jié)線蟲侵染的番茄根系,沖洗干凈后,置于體視鏡下挑取卵囊,用0.3% NaClO消毒,渦旋振蕩,加蒸餾水,制備成濃度為1000個/mL的卵懸浮液。

        將消毒的卵囊置于溫潤的小皿中,28 ℃ 恒溫孵化48 h,收取2齡幼蟲(J2),加蒸餾水,制備成濃度為1000頭/mL的J2懸浮液。

        1.3 菌株A-29發(fā)酵濾液對2齡幼蟲抑殺作用和卵孵化抑制率的測定

        在12孔板的每孔中加入J2懸浮液50 μL,分別吸取菌株A-29發(fā)酵濾液原液、5倍和10倍稀釋液各1 mL于12孔板中,以無菌NA培養(yǎng)液為對照,重復(fù)3次,于24 h和48 h時,統(tǒng)計(jì)J2死亡情況。以體視顯微鏡下觀察,針尖接觸蟲體不動,則視為死亡[13]。J2死亡率=死亡線蟲數(shù)/供試線蟲總數(shù)×100%。

        在12孔板中加入菌株A-29發(fā)酵濾液和卵懸浮液,處理方法同上。4 d后統(tǒng)計(jì)卵孵化情況[15]。卵孵化抑制率=未孵化的卵量/卵總量×100%。

        1.4 菌株A-29發(fā)酵液防治根結(jié)線蟲的室內(nèi)盆栽試驗(yàn)

        番茄植株準(zhǔn)備:番茄種子先用NaClO消毒,然后清水沖洗2次,經(jīng)催芽后,播種于裝有經(jīng)高壓滅菌的肥沃土壤與育苗基質(zhì)1:1混合的花盆中,待番茄植株2片真葉完全展開后再移栽,每盆1株番茄苗,按常規(guī)進(jìn)行管理。

        盆栽防效測定:設(shè)置菌株A-29發(fā)酵液(OD600=0.8)、阿維菌素油乳劑和清水灌根3個處理。番茄植株移植3~5 d后,分別以菌株A-29發(fā)酵液15 mL,5%阿維菌素油乳劑1000倍200 mL,清水15 mL灌根。每處理6株,重復(fù)4次。灌根處理3 d后,在距番茄植株根部2 cm的土壤中打6~8 cm深的孔,然后注入1 mL的J2懸浮液,以后按常規(guī)進(jìn)行管理。接種60 d后,記錄并統(tǒng)計(jì)番茄植株鮮重、植株高度和根系干重,并采用Bridge & Page[14]的分級標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)計(jì)病情級別,計(jì)算根結(jié)指數(shù)和防效,所得數(shù)據(jù)采用Excel和SPSS進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和方差分析。

        1.5 菌株A-29的種類鑒定

        形態(tài)特征及染色反應(yīng):依照方中達(dá)等[15]進(jìn)行菌株A-29的鑒定,具體包括菌株的培養(yǎng)性狀、菌體形狀及大小、革蘭氏染色反應(yīng)、鞭毛及芽胞染色反應(yīng)。

        生理生化特征分析:依照方中達(dá)等[15]進(jìn)行菌株A-29的生理生化特征分析,具體指標(biāo)包括接觸酶、氧化酶、過氧化酶活性,能否利用檸檬酸鹽、蔗糖、淀粉、亮氨酸、谷氨酸、硝酸鹽。

        分子生物學(xué)鑒定:將菌株A-29接種于LB培養(yǎng)基中,180 r/min、28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h,取1 mL培養(yǎng)菌液,按Ezup柱式細(xì)菌基因組DNA抽提試劑盒提取DNA。16S rRNA基因PCR擴(kuò)增采用細(xì)菌通用引物(27F:5′-AGTTTATCMTGGCTC AG-3′;1492R:5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′)[16]。25 μL PCR 擴(kuò)增體系:10×Buffer 2.5 μL,dNTP 1.0 μL,TaqDNA 聚合酶0.2 μL,引物各 0.5 μL,DNA 模板 0.5 μL,ddH2O 19.8 μL。PCR反應(yīng)程序:94 ℃預(yù)變性4 min,94 ℃變性45 s,55 ℃退火45 s,72 ℃延伸1 min,30個循環(huán),72 ℃延伸10 min。測序由上海生物工程公司完成,測序結(jié)果用Sequencher 5.1.2編輯拼接。選取序列同源性較高的蒼白桿菌屬代表性種類的 20條 16S rRNA序列,用P. lautus(NR040882)和P. alginolyticus(NR040893)做外群,構(gòu)建貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹。采用Clustal X2軟件進(jìn)行序列比對,GeneDoc編輯序列比對結(jié)果,jModelTest 2.1.4獲取最佳模型GTR+I(xiàn)+G,MrBayes 3.2.7軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹,F(xiàn)igTree v1.4.3讀取結(jié)果。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 菌株A-29發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲的致死效果測定

        2.1.1 對J2的致死效果 試驗(yàn)結(jié)果(圖1)表明,不同濃度的菌株A-29發(fā)酵濾液對J2都有明顯的致死效果,其中原液、5倍液和10倍液處理24 h后,J2死亡率分別為85.67%、79.61%、71.09%;處理48 h后,J2死亡率分別為95.45%、87.62%、77.04%。同時隨處理濃度的增高和處理時間的延長,J2死亡率也隨之提高。

        圖1 菌株A-29發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲J2的致死效果Fig. 1 The effects of strain A-29 fermentation filtrate on J2 mortality ofM. incognita in vitro

        2.1.2 對卵孵化的抑殺效果 不同濃度菌株 A-29發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲的卵孵化均有一定程度的抑制(圖2)。用原液、5倍液、10倍液處理卵4 d后,卵孵化抑制率分別為87.86%、69.30%、59.25%,且卵孵化抑制率隨著發(fā)酵濾液稀釋倍數(shù)的增加而降低,各處理間的抑制率呈顯著性差異。

        圖2 菌株A-29發(fā)酵濾液對南方根結(jié)線蟲卵孵化的抑制效果Fig. 2 The egg hatching inhibition effect of strain A-29 fermentation filtrate onM. incognita in vitro

        2.2 菌株A-29發(fā)酵液防治根結(jié)線蟲的盆栽防效及促生作用

        2.2.1 盆栽防效 菌株A-29發(fā)酵液處理后根結(jié)指數(shù)明顯降低,防治效果達(dá)75.00%,而略低于阿維菌素處理防效(87.5%),但與阿維菌素處理間沒有顯著差異(表1)。

        表1 菌株A-29發(fā)酵液對番茄根結(jié)線蟲的盆栽效果Table 1 Control efficacy of A-29 fermentation broth onM. incognitain pot experiments

        2.2.2 促生作用 菌株A-29發(fā)酵液處理對番茄植株具有明顯的促生作用。菌株A-29發(fā)酵液處理60 d后,植株鮮重、根系干重和植株高度與清水及阿維菌素處理相比,均有顯著性增加,其中植株鮮重分別增加38.41%和21.19%,根系干重分別增加33.52%和7.55%,植株高度分別增加20.01%和21.51%(表2)。

        表2 菌株A-29發(fā)酵液對盆栽番茄生物量的影響Table 2 Effects of A-29 fermentation broth on tomato biomass in pot experiments

        2.3 菌株A-29的種類鑒定

        2.3.1 菌株A-29的形態(tài)特征 菌株A-29在NA固體培養(yǎng)基上的菌落呈白色,不規(guī)則形,邊緣不整齊,有隆起(圖3A)。菌體為短桿狀,大小為0.6~1.7 μm×1.4~4.7 μm,革蘭氏染色為陰性(圖3B),無芽胞(圖3C),無鞭毛(圖3D)。和過氧化酶呈陽性,能利用檸檬酸鹽、蔗糖,亮氨酸,可水解淀粉,將硝酸鹽還原,不能利用谷氨酸。這些生理生化特性與假格里尼翁蒼白桿菌Ochrobactrum pseudogrignonense相符。

        圖3 菌株A-29的培養(yǎng)性狀(A)、革蘭氏染色(B)、芽胞染色(C)及鞭毛染色(D)結(jié)果Fig. 3 Culture characteristics (A), gram staining (B), spore staining (C) and flagella staining (D) of strain A-29

        2.3.2 菌株A-29的生理生化特征 菌株A-29的生理生化特征如表3所示。菌株A-29的接觸酶、氧化酶

        表3 菌株A-29的生理生化特征Table 3 Physiological and biochemical characteristics of strain A-29

        2.3.3 菌株A-29的分子生物學(xué)鑒定 菌株A-29 16S rRNA基因序列目的基因片段1423 bp,提交NCBI序列比對后,與假格里尼翁蒼白桿菌(O. pseudogrignonense,JX266314)的序列相似度最高,達(dá)100%。采用GIR+I(xiàn)+G模型構(gòu)建16S rRNA貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)顯示,菌株A-29與4個假格里尼翁蒼白桿菌(JX266314、KF312237、AM422371和LN875377)聚在同一支上,置信度達(dá)95%。

        圖4 基于16S rRNA基因序列的菌株A-29貝葉斯系統(tǒng)發(fā)育樹(后驗(yàn)概率>50%的標(biāo)注在相應(yīng)的節(jié)點(diǎn)上)Fig. 4 Bayesian phylogenetic tree of strain A-29 based on the 16S rRNA gene sequence (posterior probability values greater than 50% are given on appropriate clades)

        綜合以上形態(tài)學(xué)特征、生理生化特性和分子生物學(xué)鑒定結(jié)果,菌株A-29鑒定為假格里尼翁蒼白桿菌。

        3 討論

        菌株 A-29是從西葫蘆根際土壤中分離的對南方根結(jié)線蟲具有良好抑殺效果的生防菌株。通過形態(tài)特征、生理生化特征、16S rRNA基因序列及其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系分析,鑒定該菌株為假格里尼翁蒼白桿菌。

        假格里尼翁蒼白桿菌是Kampfer首次從瑞典人體血液和挪威人耳中分離得到的一種細(xì)菌,隸屬于變形菌門Proteobacteria,α-變形菌綱Alphaproteobacteria。本試驗(yàn)分離得到的菌株A-29在形態(tài)上與Kampfer等原始報(bào)道和向梅春[18]報(bào)道的NC1菌株略有差異,菌株A-29菌體長為前兩者報(bào)道的2倍有余,這可能是假格里尼翁蒼白桿菌在人體和土壤中存在差異所致。但有關(guān)菌株 A-29對人體的安全性需做進(jìn)一步的試驗(yàn)和評估。

        目前假格里尼翁蒼白桿菌的一些菌株主要應(yīng)用于生態(tài)環(huán)境修復(fù)和植物抗病研究中,如銅礦廢水和砷污染土壤修復(fù)[19,20]、小麥根腐病的防治[21]等。但有關(guān)假格里尼翁蒼白桿菌在根結(jié)線蟲生防研究中的報(bào)道較少,僅有NC1菌株用于根結(jié)線蟲的生防研究中。如向梅春等[18]報(bào)道了假格里尼翁蒼白桿菌NC1對南方根結(jié)線蟲2齡幼蟲和卵有一定的抑殺效果,并以該菌為有效成分制成生防菌肥對番茄根結(jié)線蟲有一定的防效;楊婷等[22]用假格里尼翁蒼白桿菌NC1與淡紫紫孢菌和橄欖色鏈霉菌制成混合菌肥對生菜根結(jié)線蟲具有一定防效。本研究中假格里尼翁蒼白桿菌A-29對南方根結(jié)線蟲的2齡幼蟲和卵具有較高的抑殺活性,對番茄植株具有良好的促生效果,與向梅春等[18]報(bào)道一致,有關(guān)其促生機(jī)制可能與蒼白桿菌產(chǎn)生吲哚乙酸(IAA)和ACC脫氫酶,并且具有固氮和溶磷等功效有關(guān)[23-25],還有待做進(jìn)一步的研究。

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