李 蕾，張 雷，趙宗祥，王夢茹，李世廣

（安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院/植物病蟲害生物學(xué)與綠色防控安徽普通高校重點實驗室，合肥 230036）

菜粉蝶Pieris rapae的幼蟲菜青蟲是十字花科蔬菜上的重要害蟲，目前國內(nèi)外防治菜青蟲主要以化學(xué)防治為主[1]。長期使用化學(xué)農(nóng)藥防治，會造成害蟲抗藥性，蔬菜農(nóng)藥殘留超標(biāo)及環(huán)境污染等一系列副作用，開發(fā)應(yīng)用真菌制劑、植物次生代謝產(chǎn)物等進(jìn)行生物防治是解決上述問題的重要途徑[2,3]。

黃綠綠僵菌Metiarium flavoride是一種重要的昆蟲病原真菌，廣泛用于蔬菜害蟲、地下害蟲、牧草害蟲、林業(yè)害蟲等的生物防治，尤其對小菜蛾plutella xylostella、菜青蟲、蚜蟲、飛蝗Locusta migratoria、白蟻、桃小食心蟲Carposina sasakii等防治效果俱佳，其防治效果可與白僵菌媲美[4]。

植物次生代謝產(chǎn)物反式茴香腦（trans-anethole）是茴香精油與羅勒精油的主要成分，經(jīng)GC-MS分析反式茴香腦在茴香精油中占比91.32%，具抗氧化、抗真菌、細(xì)胞毒性等生物活性[5]。反式茴香腦對桃蚜Myzus persicae、埃及伊蚊Aedes aegypti、致倦庫蚊Culex quinquefasciatus、粉紋夜蛾Trichoplusia ni、豇豆象Callosobruchus maculatus、沫蟬等多種害蟲具殺滅活性[6-11]；還對桃小食心蟲和米象Sitophilus oryzae具有驅(qū)避作用[12,13]；并且影響成蟲壽命、產(chǎn)卵及抑制體內(nèi)保護(hù)酶活性[5]。與化學(xué)殺蟲劑相比，植物中的化合物屬天然產(chǎn)物，對環(huán)境友好、易降解，符合無公害農(nóng)業(yè)的發(fā)展潮流，可作為高毒高殘留化學(xué)農(nóng)藥的替代品；天然產(chǎn)物通常殺蟲效率高，成本低，比合成產(chǎn)物對非目標(biāo)生物的危害小，而且它們具有可降解性，因而是對環(huán)境友好的天然殺蟲劑[14]。

黃綠綠僵菌等生防真菌防治害蟲具有持效性等優(yōu)點，但缺乏速效性；據(jù)報道，反式茴香腦具有作為生物殺蟲劑的潛力，而且有較強(qiáng)的速效性[11]。兩種及以上藥劑的聯(lián)合使用越來越成為害蟲防治的重要策略[15]，除了生物制劑與化學(xué)殺蟲劑聯(lián)合使用，真菌殺蟲劑與天然植物代謝產(chǎn)物兩種生物制劑聯(lián)合使用也是有效提高害蟲生物防治效果的重要途徑。真菌殺蟲劑與天然植物代謝產(chǎn)物混合施用的最低要求是使真菌孢子保持活力[2]。因此，本文評價了反式茴香腦對黃綠綠僵菌Mf82菌株菌絲生長和孢子萌發(fā)的影響，同時測定了反式茴香腦與黃綠綠僵菌 Mf82聯(lián)合使用對菜青蟲的毒力，以期為指導(dǎo)田間聯(lián)用防治菜青蟲提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

黃綠綠僵菌菌株Mf82由安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病蟲害生物防治研究室提供。用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）在溫度（25±1）℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)形成菌落供試。

1.2 供試藥劑

反式茴香腦（99%）購于美國Sigma-Aldrich公司。

1.3 供試?yán)ハx

菜粉蝶采自安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)翠園未噴藥的甘藍(lán)地，移入室內(nèi)養(yǎng)蟲室用白菜或甘藍(lán)盆栽進(jìn)行連續(xù)多代飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對濕度 75%，光周期 14L:10D。選取體型大小一致、健康活潑的 2齡幼蟲供試。

1.4 黃綠綠僵菌Mf82對菜青蟲的生物測定

刮取供試菌株分生孢子在0.05% Tween-80溶液中，分別配制成1.5×104～1.5×108孢子/mL的5個濃度梯度孢子懸浮液，每個濃度3個重復(fù)，每個重復(fù)15頭2齡幼蟲，設(shè)0.05% Tween-80水溶液為對照。采用浸漬法接種[14]，將每重復(fù)的15頭幼蟲挑選放置在干凈的白紗布中，用鑷子夾著帶有菜青蟲的紗布在各濃度的孢子懸浮液中浸10 s，拿出后放于濾紙上吸干蟲體表面多余水分，再放在墊有新鮮甘藍(lán)葉片的培養(yǎng)皿中，于25 ℃、相對濕度75%，光周期0L:24D 恒溫培養(yǎng)箱飼養(yǎng)觀察，連續(xù)觀察記錄5～6 d，計算校正死亡率。

1.5 反式茴香腦對菜青蟲的生物活性測定

用5%丙酮水溶液將反式茴香腦配制成5個濃度，即1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、2.5 mg/mL、5.0 mg/mL和7.5 mg/mL，以5%丙酮水為對照。采用浸漬法接種，方法同1.4。分別于處理后的6 h、12 h、24 h、36 h、48 h觀察記錄死亡蟲數(shù)，并計算處理試蟲48 h后的LC50。

1.6 反式茴香腦對菌株Mf82菌絲生長影響的測定

反式茴香腦藥劑LC50分別與上述5個濃度孢子懸浮液以體積比5:5、4:6、3:7、2:8和1:9分別混合在1.5 mL離心管里，用滅過菌的200 μL移液槍頭在PDA平板中央戳一個小淺坑，用移液槍吸取5 μL各處理組混合藥劑，點接到平板中央的淺坑里，對照組點接不加藥劑的各濃度孢子懸浮液，接種用量和方法保持一致[16]，各處理組重復(fù)5次，移入光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，溫度（25±1）℃，相對濕度75%，光周期0L:24D。從第2 d開始在平板底部采用十字交叉法測量菌落直徑，連續(xù)測量10 d，以測量所得的各個重復(fù)的平均值為菌落直徑。利用下式計算菌落生長抑制率：菌絲生長抑制率（%）＝（1－處理組菌落直徑/空白組菌落直徑）×100。

1.7 反式茴香腦對菌株Mf82孢子萌發(fā)影響的測定

以不加藥劑的孢子懸浮液為對照，將反式茴香腦藥劑LC50分別與上述5個濃度孢子懸浮液以不同比例混合后的藥劑放入光照培養(yǎng)箱中，24 h后測定分生孢子萌發(fā)情況，計算孢子萌發(fā)百分率。吸取10 μL藥液在載玻片上，于光學(xué)顯微鏡10×40倍下觀察孢子萌發(fā)情況，每個玻片隨機(jī)計數(shù)5個視野。當(dāng)胚芽管長于分生孢子直徑時，即確定為分生孢子已萌發(fā)[17,18]。利用下式計算孢子萌發(fā)率和校正孢子萌發(fā)率，孢子萌發(fā)率（%）＝（萌發(fā)孢子數(shù)/觀察孢子總數(shù)）×100，校正孢子萌發(fā)率（%）＝（處理組孢子萌發(fā)率/對照組孢子萌發(fā)率）×100。

1.8 反式茴香腦與黃綠綠僵菌Mf82聯(lián)合使用對菜青蟲的生物活性測定

按照所求反式茴香腦藥劑LC50與配制好的孢子懸浮液（1.5×104～1.5×108孢子/mL）以體積比5:5、4:6、3:7、2:8和1:9分別混合，浸漬接種。對照組按照0.05% Tween-80和5%丙酮水溶液按相應(yīng)比例混合接種，方法參照1.4。單劑毒力指數(shù)（TI）＝標(biāo)準(zhǔn)藥劑LC50/供試藥劑LC50×100；混合藥劑實測毒力指數(shù)（ATI）＝標(biāo)準(zhǔn)藥劑LC50/混合藥劑LC50×100；混合藥劑理論毒力指數(shù)（TTI）＝混合藥劑中A的毒力指數(shù)×混劑中A所占比例（A%）＋混合藥劑中B的毒力指數(shù)×混劑中B所占比例（B%）；共毒系數(shù)（CTC）＝混合藥劑實測毒力指數(shù)ATI/混合藥劑理論毒力指數(shù)TTI×100。

在測定兩種藥劑對菜青蟲的聯(lián)合毒力時以黃綠綠僵菌為標(biāo)準(zhǔn)藥劑A，則黃綠綠僵菌的毒力指數(shù)為100。若計算得到共毒系數(shù)＞120，則為增效作用；80＜共毒系數(shù)≤120，為相加作用；共毒系數(shù)＜80，為拮抗作用[19]。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)的分析與處理采用SPSS 22.0，計算平均值、標(biāo)準(zhǔn)誤、毒力回歸方程、LC50及95%置信限，對于不同處理組間采用一維方差分析（One-Way ANOVA）中的最小差異顯著法（LSD Test）進(jìn)行多重分析，差異顯著性水平為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃綠綠僵菌Mf82對菜青蟲的校正死亡率

黃綠綠僵菌孢子懸浮液對菜青蟲2齡幼蟲的毒力隨著濃度的升高而增強(qiáng)，處理5 d時菌株Mf82濃度為1.5×106孢子/mL、1.5×107孢子/mL、1.5×108孢子/mL孢子懸浮液對菜青蟲2齡幼蟲的校正死亡率分別為81.08%、91.89%和97.30%；并且同一濃度隨著時間延長試蟲死亡率顯著上升，從處理后第2 d開始各供試濃度的試蟲死亡率上升明顯（表1）。

表1 黃綠綠僵菌Mf82不同濃度分生孢子懸浮液對菜青蟲的累計校正死亡率Table 1 Cumulative corrected mortality ofM. flavoride82 with different concentrations againstP. rapae

2.2 反式茴香腦對菜青蟲的校正死亡率

不同濃度的反式茴香腦對菜青蟲的累計校正死亡率見表2。反式茴香腦對菜青蟲的毒力隨濃度的升高而顯著增強(qiáng)。在施藥處理6 h后最高濃度7.5 mg/mL表現(xiàn)出低死亡率，隨著時間延長各濃度死亡率明顯升高，在處理48 h 時，1.0 mg/mL的校正死亡率超出20.00%，5.0 mg/mL和7.5 mg/mL對菜青蟲的校正死亡率分別達(dá)到了92.68%和97.56%，且各濃度死亡率差異顯著（F＝47.742，df＝5，P＝0.000）。

表2 反式茴香腦不同濃度對菜青蟲的累計校正死亡率Table 2 Cumulative corrected mortality of trans-anethole with different concentrations againstP. rapae

由Probit analysis分析得到反式茴香腦處理菜青蟲48 h后的LC50為1.495 mg/mL，因此，選取反式茴香腦致死中濃度LC501.495 mg/mL對本文接下來菌藥相容性及菌藥混合使用效果進(jìn)行下一步探究。

2.3 反式茴香腦對菌株Mf82菌絲生長的影響

反式茴香腦與Mf82菌株孢子懸浮液各濃度以5個不同體積比混合后均能促進(jìn)菌落生長，與反式茴香腦具較好的相容性，但隨著時間的延長，菌落生長速率減慢（表3）。

表3 反式茴香腦LC50對黃綠綠僵菌Mf82菌落生長的影響Table 3 Effect of LC50of trans-anethole on the mycelia growth ofM. flavorideMf82

2.4 反式茴香腦對菌株Mf82孢子萌發(fā)的影響

菌株Mf82不同濃度的孢子懸浮液的孢子萌發(fā)率不同，高濃度孢子懸浮液與反式茴香腦LC50混用其孢子萌發(fā)率更高。TA LC50＋Mf828在各混合比例中均能促進(jìn)菌株Mf82孢子萌發(fā)，孢子萌發(fā)率96.13%～111.03%，各混合比例間差異顯著（F＝3.740，df＝4，P＝0.034）；TA LC50＋Mf827在各混合比例中孢子萌發(fā)率在75.00%以上，各混合比例間差異顯著（F＝4.810，df＝4，P＝0.015），其中，二者以體積比5:5和4:6混合后綠僵菌分生孢子萌發(fā)率均超過90.00%，分別為94.68%和93.07%；TA LC50＋Mf826、TA LC50＋Mf825與TA LC50＋Mf824的混合處理中反式茴香腦所占比例越高，孢子萌發(fā)率越高（TA LC50＋Mf826：F＝3.510，df＝4，P＝0.037；TA LC50＋Mf825：F＝3.783，df＝4，P＝0.028；TA LC50＋Mf824：F＝3.434，df＝4，P＝0.044）（表4）。

表4 反式茴香腦對菌株Mf82孢子萌發(fā)的影響（24 h）Table 4 Effect of trans-anethole to conidia germination ofM. flavorideMf82 (24 h)

2.5 反式茴香腦與黃綠綠僵菌Mf82聯(lián)合使用對菜青蟲的校正死亡率

反式茴香腦LC50與同一濃度孢子懸浮液以不同體積比混合后，混劑中反式茴香腦占比越大，試蟲死亡率越高，而且以5:5、4:6和3:7混合后的試蟲死亡率高于孢子懸浮液單用的死亡率，2:8和1:9混合后試蟲死亡率低于單用，且死亡率隨時間的延長而升高。處理后第5 d，TA LC50＋Mf828（5:5）、TA LC50＋Mf828（4:6）和TA LC50＋Mf828（3:7）處理組試蟲死亡率達(dá)100.00%，比TA LC50＋Mf828（2:8）和TA LC50＋Mf828（1:9）組死亡率高；各濃度孢子懸浮液處理后，兩者混合處理試蟲死亡率為：TA LC50＋Mf827（5:5）＞TA LC50＋Mf827（4:6）＞TA LC50＋Mf827（3:7）＞TA LC50＋Mf827（2:8）＞TA LC50＋Mf827（1:9）；TA LC50＋Mf826（5:5）＞TA LC50＋Mf826（4:6）＞TA LC50＋Mf826（3:7）＞TA LC50＋Mf826（2:8）＞TA LC50＋Mf826（1:9）；TA LC50＋Mf825（5:5）＞TA LC50＋Mf825（4:6）＞TA LC50＋Mf825（3:7）＞TA LC50＋Mf825（2:8）＞TA LC50＋Mf825（1:9）；TA LC50＋Mf824（5:5）＞TA LC50＋Mf824（4:6）＞TA LC50＋Mf824（3:7）＞TA LC50＋Mf824（2:8）＞TA LC50＋Mf824（1:9）（表5）。

表5 反式茴香腦與黃綠綠僵菌Mf82聯(lián)合使用對菜青蟲的校正死亡率Table 5 Laboratory toxicity of mixedM. flavorideMf82 with trans-anethole againstP. rapae

2.6 反式茴香腦與黃綠綠僵菌Mf82聯(lián)合使用對菜青蟲的毒力

反式茴香腦LC50與綠僵菌5個濃度以不同體積比混合后，其混劑的LC50大小順序為：TA LC50＋Mf82（5:5）＜TA LC50＋Mf82（4:6）＜TA LC50＋Mf82（3:7）＜TA LC50＋Mf82（2:8）＜TA LC50＋Mf82（1:9），說明混合后的毒力隨著反式茴香腦在混劑中所占比例的減少而降低；反式茴香腦LC50與菌株Mf82（濃度1.5×108、1.5×107、1.5×106、1.5×105和1.5×104孢子/mL）以體積比5:5混合后，CTC為287＞120，說明兩者以5:5混用具協(xié)同增效作用；同理，反式茴香腦LC50與菌株Mf82以體積比4:6和3:7混合后，CTC分別為108和83，在80～120，說明兩者以體積比4:6和3:7混合后對菜青蟲的毒力具相加作用；而反式茴香腦LC50與菌株Mf82以體積比2:8和1:9混合后，共毒系數(shù)分別為32和16，明顯小于80，說明菌藥混合表現(xiàn)拮抗作用。從聯(lián)合作用中藥劑LC50與單用藥劑的LC50的比值中也可看出，二者以體積比5:5、4:6、3:7混合后比值均顯著小于1，說明聯(lián)用不僅可以減少藥劑的使用量，還具增效作用；二者以體積比2:8混合后比值0.86趨于1，說明聯(lián)合使用具相加作用；反之，二者以體積比1:9混合后比值大于1，聯(lián)用不具增效作用（表6）。

表6 反式茴香腦與黃綠綠僵菌Mf82對菜青蟲的聯(lián)合毒力Table 6 The combined toxicity of trans-anethole andM. flavorideMf82 on the 2ndinstar larvae ofP. rapae

反式茴香腦LC50與黃綠綠僵菌孢子懸浮液5個濃度以不同比例混合處理試蟲后，各個比例所得的LT50差異明顯，二者以體積比5:5、4:6和3:7聯(lián)合使用的LT50明顯比菌株Mf82單用的LT50短，而以體積比2:8和1:9聯(lián)用的LT50比菌株單用時的LT50長（表7）。

表7 黃綠綠僵菌Mf82與反式茴香腦聯(lián)合使用對菜青蟲的致死中時Table 7 LT50ofM. flavorideMf82 with trans-anethole againstP.rapae

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)黃綠綠僵菌Mf82菌株與反式茴香腦聯(lián)合使用不僅提高了黃綠綠僵菌Mf82菌株對菜青蟲的毒力，而且致死速度加快。菌株Mf82在濃度1.5×107孢子/mL處理5 d后足以使菜青蟲死亡率在90.00%以上。有研究也顯示了在較高濃度昆蟲病原真菌孢懸液作用下，對靶標(biāo)害蟲的控制效果好。例如，Duarte等[2]選用濃度為107孢子/mL的球孢白僵菌、綠僵菌屬、萊氏綠僵菌在防治小菜蛾2齡幼蟲7 d后校正死亡率就已達(dá)到98.00%、100.00%和95.00%。在處理48 h時，反式茴香腦濃度5.0 mg/mL和7.5 mg/mL對菜青蟲的校正死亡率就分別達(dá)到了92.68%和97.56%，這與Rana等[8]證實了十種芳香植物精油及其主要成分（其中包括反式茴香腦）在處理濃度僅為0.25 mL/L時，2 h內(nèi)對致倦庫蚊4齡幼蟲的致死率為100.00% 的結(jié)論相似，均表明反式茴香腦對靶標(biāo)害蟲的速效性。

研究菌藥相容性的報道很多，但多集中在昆蟲病原真菌與化學(xué)殺蟲劑的聯(lián)合應(yīng)用上，針對黃綠綠僵菌與植物次生代謝產(chǎn)物相容性的研究則鮮有報道。高毒力菌株綠僵菌分生孢子耐受性強(qiáng)，與其他藥劑混合后，對菌落生長影響小[20,21]。張英財?shù)萚22]報道了18種化學(xué)農(nóng)藥與綠僵菌的相容性，結(jié)果表明殺蟲劑、除草劑、植物生長調(diào)節(jié)劑在田間推薦濃度下對綠僵菌菌落生長及孢子萌發(fā)影響不顯著，相容性好。本試驗中反式茴香腦對黃綠綠僵菌的菌落生長和孢子萌發(fā)有一定的促進(jìn)作用，與化學(xué)藥劑對真菌營養(yǎng)生長的影響相反，這與諸多學(xué)者研究昆蟲病原真菌與農(nóng)藥的相容性而得出植物源農(nóng)藥與真菌的相容性較好，而化學(xué)農(nóng)藥對真菌的抑制率較大的結(jié)論一致[23-25]。黃綠綠僵菌與反式茴香腦的相容性，可能與反式茴香腦的化學(xué)分子在混劑中的低劑量對微生物低毒性有關(guān)，也可能與昆蟲病原真菌具有降解這些化合物的能力，以最終不影響自身菌落繁殖有關(guān)[26]。

昆蟲病原真菌與植物代謝產(chǎn)物復(fù)配目的就是為了提高滅殺效果，降低化學(xué)防治造成的環(huán)境壓力，擴(kuò)展生物農(nóng)藥的滅殺譜，從而提高產(chǎn)品的應(yīng)用范圍與商業(yè)價值[27]。當(dāng)反式茴香腦 LC50與黃綠綠僵菌以體積比5:5、4:6和3:7聯(lián)合使用時，試蟲死亡率高于2:8與1:9混用的死亡率，共毒系數(shù)分別為287、108和83，說明具有增效與相加作用；而且反式茴香腦與黃綠綠僵菌聯(lián)用比黃綠綠僵菌單用的LT50縮短，因此聯(lián)合使用效果更好。原因可能是因為混劑中高比重反式茴香腦影響幼蟲的神經(jīng)系統(tǒng)，與已經(jīng)侵入到體內(nèi)的黃綠綠僵菌結(jié)合破壞昆蟲免疫系統(tǒng)而導(dǎo)致更高的死亡率，也可能是反式茴香腦導(dǎo)致昆蟲停止取食和延遲發(fā)育，從而增加真菌侵染造成的死亡率[28-30]。另一方面，由于綠僵菌分生孢子產(chǎn)生的芽管分泌溶幾丁質(zhì)酶和蛋白酶，溶解昆蟲體壁，使得其他藥劑能快速進(jìn)入昆蟲體內(nèi)，共同作用加速昆蟲死亡[31]。此外，同一藥劑在不同濃度范圍內(nèi)與綠僵菌聯(lián)用效果存在差異，這可能與藥劑的組分類型、作用機(jī)制、環(huán)境因素及混劑中其有效成分含量多少有關(guān)。

綜上所述，本文對黃綠綠僵菌Mf82與反式茴香腦菌藥相容性及其對菜青蟲聯(lián)合作用的研究結(jié)果表明，反式茴香腦具備防治菜青蟲的潛力，可作為生物源農(nóng)藥進(jìn)行商業(yè)化推廣。防治菜青蟲時推薦使用黃綠綠僵菌Mf82與反式茴香腦聯(lián)用，并且優(yōu)先選用反式茴香腦LC50與黃綠綠僵菌以體積比5:5、4:6和3:7處理組使用。推廣黃綠綠僵菌和反式茴香腦聯(lián)用防治菜青蟲，既能發(fā)揮昆蟲病原真菌的持效性與植物代謝物的速效性，還能緩解化學(xué)農(nóng)藥使用帶來的“3 R”危害，保證蔬菜生產(chǎn)的安全性；但黃綠綠僵菌Mf82和反式茴香腦聯(lián)合作用的最佳使用條件及其對菜青蟲的田間防效還需進(jìn)一步研究。