符 偉，唐 濤，王 培，王 勇，尹 麗，馬明勇，張政兵*

（1. 湖南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所，長(zhǎng)沙 410125；2. 湖南省植保植檢站，長(zhǎng)沙 410005）

小菜蛾P(guān)lutella xylostella(L.)是十字花科作物上一種世界性重要害蟲(chóng)[1]，全世界每年用于防治小菜蛾的費(fèi)用高達(dá)40～50億美元[2,3]。目前，我國(guó)對(duì)小菜蛾的控制策略仍以化學(xué)防治為主。然而，化學(xué)農(nóng)藥的大量連續(xù)使用，導(dǎo)致其對(duì)化學(xué)藥劑的抗性水平上升，而與之相應(yīng)的是田間防治效果逐漸下降[4]。因此，用以蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）為代表的生物農(nóng)藥防治小菜蛾近年來(lái)日益受到關(guān)注和應(yīng)用。

蘇云金芽胞桿菌是一種從土壤或死亡昆蟲(chóng)體內(nèi)分離出來(lái)的革蘭氏陽(yáng)性細(xì)菌。它在芽胞形成時(shí)期產(chǎn)生一種或多種殺蟲(chóng)晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），可對(duì)鱗翅目等多種昆蟲(chóng)產(chǎn)生毒殺活性[5]。在Bt制劑及轉(zhuǎn)Bt基因作物的應(yīng)用與推廣之初，不僅對(duì)田間害蟲(chóng)的有效控制成績(jī)斐然；同時(shí)有利于提高作物的產(chǎn)量和質(zhì)量，且減少了化學(xué)農(nóng)藥的使用頻次與使用量，從而對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)和環(huán)境保護(hù)發(fā)揮了積極的作用[6]。然而，隨著時(shí)間的推移及廣泛應(yīng)用，部分害蟲(chóng)已對(duì)Bt產(chǎn)生了一定程度的抗藥性。Tabashnik等[7]在長(zhǎng)期使用Bt制劑的美國(guó)夏威夷田間首次發(fā)現(xiàn)小菜蛾對(duì)Bt 制劑產(chǎn)生抗藥性。戴承鏞等[8]首次報(bào)道了我國(guó)部分地區(qū)小菜蛾對(duì)Bt制劑的抗藥性問(wèn)題，其中華南地區(qū)（廣州及深圳一帶）對(duì)Bt制劑的抗性比揚(yáng)州地區(qū)高10～25倍，而泰國(guó)曼谷地區(qū)的抗性又比華南地區(qū)高40%左右。Pardo-Lopez等[9]總結(jié)了Bt Cry毒素在鱗翅目昆蟲(chóng)中產(chǎn)生抗藥性的多種機(jī)理，特別值得注意的是一種昆蟲(chóng)可能形成一套抗性機(jī)制對(duì)同種或是不同種Cry毒素都產(chǎn)生抗性。

蘇云金芽胞桿菌的不同殺蟲(chóng)晶體蛋白由不同種類(lèi)的Cry基因控制，而不同種類(lèi)的Cry殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)小菜蛾的殺蟲(chóng)活性不一致，而且在 Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的選擇壓力下，其抗性發(fā)展亦有所差別。王崇利等[10]報(bào)道廣東惠州小菜蛾田間種群對(duì)Cry1Ab和Cry1Ac蛋白的抗藥性達(dá)到高抗水平，但對(duì)Cry1Aa 和Cry2Aa仍然保持較高的敏感性。目前，用于防治小菜蛾的Bt菌株主要為庫(kù)斯塔克亞種（Bt var.kurstaki，Btk），大多數(shù)含有對(duì)鱗翅目害蟲(chóng)有特異殺蟲(chóng)活性的Cry1Aa、Cry1Ab和Cry1Ac，其中Cry1Ac是殺蟲(chóng)毒力最高的基因[11]。已有研究表明，基因疊加策略可為害蟲(chóng) Bt抗性治理策略提供新途徑，即利用無(wú)交互抗性的殺蟲(chóng)晶體蛋白組合來(lái)拓寬與增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因作物的抗蟲(chóng)譜，從而使得靶標(biāo)害蟲(chóng)極難對(duì)轉(zhuǎn)基因作物產(chǎn)生抗性[12]。

小菜蛾田間種群對(duì) Bt制劑及不同殺蟲(chóng)晶體蛋白抗性水平屢有報(bào)道，但田間害蟲(chóng)產(chǎn)生抗性影響因素較為復(fù)雜。為此，本研究中使用Btk制劑汰選獲得小菜蛾抗性品系（F80代和F100代），采用葉片浸漬法測(cè)定了Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ah和Cry1Ca殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)小菜蛾抗性品系的室內(nèi)毒力，旨在明確主效基因?yàn)镃ry1Ac的Btk制劑選擇壓力下小菜蛾對(duì)Cry1Ac的抗性發(fā)展趨勢(shì)，以及與其他Cry1類(lèi)殺蟲(chóng)晶體是否存在交互抗性，從而為Bt多價(jià)殺蟲(chóng)晶體蛋白的應(yīng)用與小菜蛾的抗性治理提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試?yán)ハx(chóng)

小菜蛾相對(duì)敏感品系（SS）：將2003年采自廣州的田間品系于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所養(yǎng)蟲(chóng)室內(nèi)用無(wú)蟲(chóng)甘藍(lán)苗繼代飼養(yǎng)，期間未接觸任何殺蟲(chóng)劑。小菜蛾Btk抗性品系：該種群由2005年采自上海市郊的甘藍(lán)種植田間的小菜蛾蛹和幼蟲(chóng)建立的，隨后采用Btk可濕性粉劑浸漬甘藍(lán)苗葉片后喂食小菜蛾，連續(xù)汰選80代和100代后，分別獲得F80代和F100代供試試蟲(chóng)，二者對(duì)Btk的抗性倍數(shù)分別大約為1800倍和1900倍。

1.2 供試藥劑

蘇云金芽胞桿菌庫(kù)斯塔克亞種可濕性粉劑由湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院Bt研究開(kāi)發(fā)中心提供，效價(jià)為16000 IU/mg，屬Bacillus thuringiensissubsp.kurstaki。Cry1Ac原毒素從Bt標(biāo)準(zhǔn)菌株HD-1中提取獲得，消化后的Cry1Ab、Cry1Ah及Cry1Ca原毒素由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所提供，用牛清蛋白BSA結(jié)合SDS-PAGE進(jìn)行Bradford定量，存儲(chǔ)于-80 ℃待用[13]。

1.3 室內(nèi)毒力測(cè)定

參照Tabashnik和Cushing[14]的葉片浸漬飼喂法。先進(jìn)行預(yù)備試驗(yàn)，然后根據(jù)預(yù)備試驗(yàn)的結(jié)果，以校正死亡率在10%～90%的濃度范圍作為正式試驗(yàn)的濃度范圍。先用0.1% TritonX-100水溶液稀釋藥劑，按等比級(jí)數(shù)稀釋法，順次配制成5～7個(gè)系列濃度，以0.1% TritonX-100水溶液作為對(duì)照。將直徑為5 cm的新鮮甘藍(lán)苗嫩葉蝶在系列濃度的藥液中浸10 s，自然晾干后轉(zhuǎn)入培養(yǎng)皿（底部鋪一層浸過(guò)適量蒸餾水的濾紙片用于保濕）中。每皿接入10頭3齡初期幼蟲(chóng)，每處理4次重復(fù)。然后，將其置于培養(yǎng)箱中，溫度（25±1）℃，光周期16L∶8D，相對(duì)濕度70%，72 h后檢查幼蟲(chóng)死亡數(shù)。最后，用Abbott公式計(jì)算各處理的校正死亡率，并運(yùn)用DPS軟件計(jì)算供試藥劑的LC50值、95%置信限、毒力回歸方程（y＝a＋bx）相關(guān)系數(shù)及卡方值?？剐员稊?shù)（resistance ratio，RR）＝抗性品系的LC50/相對(duì)敏感品系的LC50。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)小菜蛾相對(duì)敏感品系的室內(nèi)毒力

Cry1Ab、Cry1Ac和Cry1Ca對(duì)小菜蛾相對(duì)敏感品系有較好的殺蟲(chóng)活性，其中以Cry1Ac最好，LC50為0.71 mg/L；Cry1Ah的活性較差，LC50高達(dá)40.03 mg/L（表1）。

表1 四種Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)小菜蛾敏感品系的室內(nèi)毒力Table 1 Toxictiy of four Bt-insecticidal crystal proteins against Bt-susceptible strain ofP. xylostella

2.2 對(duì)小菜蛾Btk抗性品系的室內(nèi)毒力

不同Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)Btk抗性種群毒力有較大的差異。Cry1Ca對(duì)F80代及F100代抗性品系的活性均最高，LC50約12.07～21.37 mg/L。Cry1Ac對(duì)F80代的活性中等（LC50為47.75 mg/L），而對(duì)F100代的活性較低（LC50為75.72 mg/L）。Cry1Ab對(duì)F80代的活性最低（LC50為65.43 mg/L）而對(duì)F100代的活性較低（LC50為72.18 mg/L）。Cry1Ah對(duì)F80代及F100代的活性均低，LC50約65.21～100.18 mg/L（表2）。

表2 四種Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白對(duì)小菜蛾Btk抗性品系的室內(nèi)毒力Table 2 Toxicity of four Bt-insecticidal crystal proteins against Bt-resistant strain ofP. xylostella

2.3 小菜蛾Btk抗性品系對(duì)四種殺蟲(chóng)晶體蛋白的抗性發(fā)展規(guī)律

經(jīng)Btk制劑汰選80至100代后，小菜蛾Btk抗性品系對(duì)Cry1Ac的抗性發(fā)展較快，其抗性倍數(shù)高達(dá)67.3～106.8倍；對(duì)Cry1Ab的抗性發(fā)展速度次之，其抗性倍數(shù)達(dá)60.0～66.1倍；對(duì)Cry1Ca和Cry1Ah的抗性發(fā)展緩慢，其抗性倍數(shù)分別為3.3～6.0倍和1.6～2.5倍（圖1）。

圖1 小菜蛾Btk抗性品系對(duì)四種Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的抗性演變Fig. 1 The resistance development of four insecticidal crystal proteins in the Bt-resistant strain ofP. xylostella

3 討論

1986年，Halpin[15]首次發(fā)現(xiàn)美國(guó)夏威夷長(zhǎng)期使用Bt制劑的田間小菜蛾已對(duì)Bt制劑產(chǎn)生了抗藥性。迄今為止，全世界已有美國(guó)、巴西、中國(guó)、馬來(lái)西亞、菲律賓及日本等地相繼報(bào)道小菜蛾對(duì)Cry1Aa、Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Aa、Cry2Ab、Cry2B、Cry1Ca和 Cry1Da等Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白存在不同程度的抗藥性[16]。研究表明，小菜蛾不僅在田間表現(xiàn)出對(duì)Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的抗藥性，而且在室內(nèi)可通過(guò)藥劑篩選表現(xiàn)出較高的抗性水平。Guo等[17]在室內(nèi)分別用Cry1Ac殺蟲(chóng)晶體蛋白和Btk制劑繼代汰選獲得SZ-R及SH-R品系小菜蛾，其抗性倍數(shù)依次高達(dá)450倍和1900倍。本研究結(jié)果表明，在主效基因?yàn)镃ry1Ac的Btk制劑的連續(xù)汰選壓力下，小菜蛾對(duì)Cry1Ac的抗性上升速度最快，并且對(duì)Cry1Ab產(chǎn)生較高的交互抗性，對(duì)Cry1Ah和Cry1Ca的抗性發(fā)展較慢。因此，為延緩小菜蛾對(duì)Bt抗性的產(chǎn)生與發(fā)展，應(yīng)設(shè)法減小選擇壓力，以保護(hù)小菜蛾對(duì)Bt的敏感性。

不同Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的組合混用亦是抗性治理的重要策略之一[18]。該策略既可應(yīng)用于傳統(tǒng)的Bt制劑加工及后期的施用，又可用于轉(zhuǎn)基因植物的選育與應(yīng)用。如Cao等[19]將Cry1Ac和Cry1C同時(shí)導(dǎo)入青花菜中，結(jié)果表明：轉(zhuǎn)雙價(jià)基因的青花菜比轉(zhuǎn)單價(jià)的青花菜具有更好的殺蟲(chóng)效果，且前者對(duì)抗Cry1Ac和Cry1C殺蟲(chóng)晶體蛋白的小菜蛾均有毒殺作用。然而，小菜蛾對(duì)不同的Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白可能存在交互抗性。為此，僅僅簡(jiǎn)單地將不同Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白混用，則難以達(dá)到抗性治理的最佳效果，而是在混用前必須針對(duì)Bt殺蟲(chóng)晶體蛋白的交互抗性進(jìn)行充分研究。