周巧玲，徐展益，鄢 茹，朱國念，陳夢麗

（1.浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州 310058；2.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 311300）

蚊子是黃熱病、瘧疾和登革熱等傳染性疾病傳播的媒介，登革熱是我國較嚴(yán)重的蚊子傳染性疾病，2014年廣東省登革熱病例超45000例，是登革熱發(fā)生的高峰年[1,2]。埃及伊蚊Aedesaegypti和白紋伊蚊Aedesalbopictus是登革熱的主要傳播媒介，我國埃及伊蚊主要分布在廣東、廣西、臺灣、西雙版納和海南等北緯 22°以南沿海區(qū)域[1]，白紋伊蚊的分布則更為廣泛，北至遼寧省，南至海南省，西至西藏自治區(qū)，分界線從遼寧一路向西，穿過河北、山西、陜西、甘肅省，到達(dá)四川省，再折向西南至西藏南部[3,4]。

防治傳染性疾病最有效的手段是控制疾病傳播的載體。在非洲，殺蟲劑是控制疾病傳染媒介的主要手段，包括殺蟲劑室內(nèi)噴霧（IRS）、殺蟲劑處理蚊帳（ITN）和長期殺蟲劑處理蚊帳（LLINs）等方法[5]。我國主要用蚊香片和電蚊香液防止被蚊子叮咬，擬除蟲菊酯殺蟲劑是市場上幾乎所有滅蚊產(chǎn)品的主要成分。擬除蟲菊酯殺蟲劑的作用靶標(biāo)是昆蟲鈉離子通道，隨著擬除蟲菊酯殺蟲劑的廣泛使用，鈉離子通道發(fā)生氨基酸突變，即kdr突變，導(dǎo)致害蟲對擬除蟲菊酯殺蟲劑的敏感性降低，擬除蟲菊酯的防效變差。擬除蟲菊酯殺蟲劑抑制鈉離子通道失活，延長鈉通道開放，引起神經(jīng)細(xì)胞重復(fù)開放，最終導(dǎo)致害蟲麻痹、死亡[6]。

除殺蟲劑外，驅(qū)避劑在防止蚊蟲叮咬方面也具有重要作用，其中DEET（避蚊胺）是使用最廣泛的驅(qū)避劑。DEET作用于蚊子嗅覺系統(tǒng)，從而產(chǎn)生驅(qū)避作用[7,8]。文獻(xiàn)報道，擬除蟲菊酯殺蟲劑不僅對蚊子具有殺蟲活性，同時也具有很強(qiáng)的驅(qū)避作用[9-12]，其中四氟苯菊酯和甲氧芐呋菊酯蒸氣壓低，揮發(fā)性高，驅(qū)避作用比其他擬除蟲菊酯殺蟲劑更為明顯[12,13]。目前，對擬除蟲菊酯殺蟲劑驅(qū)避作用的研究只是涉及行為學(xué)觀察，對其機(jī)理的研究尚在起步階段。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)四氟苯菊酯和氯氟醚菊酯能夠刺激埃及伊蚊產(chǎn)生EAG信號。但其他蚊子是否也能識別擬除蟲菊酯殺蟲劑，并產(chǎn)生 EAG信號；其他擬除蟲菊酯殺蟲劑是否也能促使蚊子產(chǎn)生 EAG信號，尚未可知，需進(jìn)一步研究。本文以白紋伊蚊和埃及伊蚊為研究對象，研究蚊香主要成分氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯的驅(qū)避作用，初步探索驅(qū)避作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx

敏感白紋伊蚊品系由浙江省疾控中心提供，采自四川省，于實驗室中飼養(yǎng) 15年，未接觸任何農(nóng)藥。埃及伊蚊購自BEI資源庫，敏感品系為Black Eye Liverpool，抗性品系為Puerto Rico。實驗室飼養(yǎng)條件為溫度（27±1）℃，相對濕度70%±10%，光周期14L∶10D，幼蟲以鼠糧為食，成蟲以10%蔗糖溶液為食，雌蚊產(chǎn)卵前飼喂小白鼠血。

1.2 供試化合物及其配制

97.3%氯氰菊酯、97.7%四氟甲醚菊酯、98.4%四氟苯菊酯、99.1%氯氟醚菊酯和 99.7%聯(lián)苯菊酯均購自德國 LGC公司；99%DEET（避蚊胺）購自上海麥克林生化科技有限公司。驅(qū)避試驗中，將供試化合物標(biāo)樣用丙酮分別配置成10-2、10-3和10-4mol/L濃度梯度的溶液，以丙酮為空白對照。EAG試驗中，將供試化合物標(biāo)樣用正己烷分別配置成10-1、10-2和10-3mol/L濃度梯度的溶液，以正己烷為空白對照。

1.3 驅(qū)避行為試驗

驅(qū)避試驗由Boyle等[15]方法改進(jìn)而來。挑選40頭羽化后4～9 d未吸血雌蚊，轉(zhuǎn)移到30 cm×30 cm×30 cm的養(yǎng)蚊籠中，饑餓處理24 h。將500 μL藥液均勻地滴在7 cm×6 cm長方形尼龍網(wǎng)上，室溫干燥5 min，揮發(fā)丙酮。在橡膠手套上剪一個6 cm×5 cm的開口，以揮發(fā)人體氣味，在手套上固定3個磁力框架，在磁力框架之間放置兩層尼龍網(wǎng)，下層為藥液處理的尼龍網(wǎng)，上層為干凈的尼龍網(wǎng)，保證蚊子喙不會接觸到皮膚和藥。試驗前用清水洗凈雙手，帶上橡膠手套，先用溶劑對照進(jìn)行試驗，記錄2～5 min內(nèi)落到手背方形框上的蚊子數(shù)量（一只蚊子在手套窗口停留時間超過5 s即為1次）。每次試驗結(jié)束后間隔1 h，使蚊子完全恢復(fù)，然后進(jìn)行處理組試驗。同一化合物同一濃度測試3批蚊子，每批蚊子設(shè)置3個重復(fù)。

1.4 觸角電位（EAG）測定

觸角電位儀由荷蘭Syntech公司的智能化數(shù)據(jù)獲取控制器（IDAC-4）、刺激氣流控制器（Syntech CS-55）、微動操作儀（Syntech MN-151）及Syntech 軟件處理系統(tǒng)四部分組成。測試方法由Boyle等[15]改進(jìn)而來。測試時用鋒利刀片切下雌蚊的頭部，并去除觸角尖端。然后將頭部和觸角分別與參考電極和記錄電極上的玻璃針（玻璃針內(nèi)部充滿0.1% KCl和0.5% PVP）相連。取20 μL待測試樣品溶液滴在定性濾紙（2 cm×0.5 cm）上，加藥后揮發(fā)30 s，用干凈的鑷子將濾紙條塞進(jìn)干凈的巴斯德管中，然后將樣品管末端與氣體刺激裝置連接，待基線平穩(wěn)后給予刺激。持續(xù)氣流流速為20 mL/s，刺激氣流流速為2 mL/s，刺激時間0.5 s，兩次刺激間隔30 s。先用正己烷測試，然后每個化合物由低濃度到高濃度進(jìn)行測試，重復(fù)3批蚊子，每批蚊子至少取20頭羽化后4～9 d未吸血的雌蚊進(jìn)行測試。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析及作圖采用GraphPad Primse 8.0軟件。顯著性差異分析采用One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法，所有數(shù)據(jù)均為三個生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means±SE），顯著性檢測水平為P＜0.05。驅(qū)避率計算方法如下，驅(qū)避百分?jǐn)?shù)（%）＝[1—（2～5 min內(nèi)化合物處理組落到手上的蚊子數(shù)量總和/2～5 min內(nèi)溶劑對照組落到手上的蚊子數(shù)量總和）]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬除蟲菊酯殺蟲劑對白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅(qū)避行為反應(yīng)

本研究通過驅(qū)避行為試驗研究擬除蟲菊酯殺蟲劑四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對埃及伊蚊和白紋伊蚊的驅(qū)避行為，如圖1和圖2所示，與陽性對照DEET一致，四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對白紋伊蚊和埃及伊蚊具有明顯的驅(qū)避作用。DEET、四氟甲醚菊酯、氯氟醚菊酯對白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅(qū)避作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系，且濃度10-2mol/L時，驅(qū)避率均在90%左右（圖1和圖2），可見，四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯是與DEET驅(qū)避效力相當(dāng)?shù)尿?qū)避劑。

圖1 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對白紋伊蚊具有非接觸驅(qū)避作用Fig.1 Dimefluthrin and meperfluthrin elicit spatial repellency in Ae.albopictus

圖2 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對埃及伊蚊具有非接觸驅(qū)避作用Fig.2 Dimefluthrin and meperfluthrin elicit spatial repellency in Ae.aegypti

2.2 白紋伊蚊和埃及伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應(yīng)

研究表明驅(qū)避劑DEET主要通過嗅覺系統(tǒng)對蚊子起驅(qū)避作用[16]，為了探索擬除蟲菊酯殺蟲劑對蚊子的驅(qū)避作用是否與DEET一樣，由嗅覺系統(tǒng)引起，本文測定白紋伊蚊和埃及伊蚊觸角對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應(yīng)。結(jié)果表明，兩種蚊子觸角都對DEET具有明顯的EAG響應(yīng)，四氟甲醚菊酯產(chǎn)生微弱的EAG反應(yīng)，而氯氟醚菊酯則完全沒有EAG反應(yīng)。此外，本文還檢測了兩種伊蚊對其他3種常見的擬除蟲菊酯殺蟲劑氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯的EAG響應(yīng)，結(jié)果表明其他擬除蟲菊酯殺蟲劑均無明顯的EAG反應(yīng)（圖3，4）。

圖3 白紋伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應(yīng)Fig.3 EAG responses of female Ae.albopictus to pyrethroids

圖4 埃及伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應(yīng)Fig.4 EAG responses of female Ae.aegypti to pyrethroids

2.3 擬除蟲菊酯殺蟲劑對埃及伊蚊抗性品系的驅(qū)避行為反應(yīng)

白紋伊蚊和埃及伊蚊對四氟甲醚菊酯具有微弱EAG反應(yīng)，而對氯氟醚菊酯沒有EAG反應(yīng)，但是這兩種擬除蟲菊酯殺蟲劑對白紋伊蚊和埃及伊蚊卻有非常強(qiáng)的驅(qū)避作用，表明除了嗅覺系統(tǒng)外，很可能有其他的靶標(biāo)參與了驅(qū)避作用。本文進(jìn)一步檢測擬除蟲菊酯殺蟲劑對攜帶有鈉離子通道kdr突變的抗性埃及伊蚊的驅(qū)避作用，結(jié)果表明DEET、四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對抗性埃及伊蚊的驅(qū)避作用呈現(xiàn)濃度劑量效應(yīng)關(guān)系，且DEET對敏感和抗性埃及伊蚊的驅(qū)避作用無顯著性差異，而四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對抗性埃及伊蚊的驅(qū)避作用都比敏感埃及伊蚊弱，差異顯著（圖5）。

圖5 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對抗性埃及伊蚊的非接觸驅(qū)避作用Fig.5 Spatial repellency of dimefluthrin and meperfluthrin against pyrethroid resistant Ae.aegypti

本文測試了白紋伊蚊和埃及伊蚊對10 mg擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應(yīng)，對氯氟醚菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯均無明顯EAG反應(yīng)（圖6）。

圖6 白紋伊紋和埃及伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應(yīng)Fig.6 EAG responses of female Ae.albopictus and Ae.aegypti to pyrethroids

3 討論

蚊子驅(qū)避劑的研究主要集中在DEET，而對其他驅(qū)避劑的機(jī)理研究較少。2013年，Kain等[17]在Nature上發(fā)表文章表明物種間保守性很高的Ir40a是DEET的靶標(biāo)嗅覺受體，然而后續(xù)通過CRISPR敲除技術(shù)構(gòu)建Ir40a基因敲除果蠅，發(fā)現(xiàn)Ir40a基因敲除果蠅對DEET的驅(qū)避作用并沒有減弱，因此重新修正結(jié)果[18]。Xu等[16]結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)和RNA干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)蚊子驅(qū)避劑DEET作用于庫蚊嗅覺受體OR136，從而實現(xiàn)驅(qū)避作用，但是在其他蚊蟲品系中沒有發(fā)現(xiàn)庫蚊OR136的同源嗅覺受體，因此DEET的靶標(biāo)受體還需進(jìn)一步考證，但是毋庸置疑DEET作用于嗅覺系統(tǒng)而對蚊子產(chǎn)生驅(qū)避作用。

擬除蟲菊酯殺蟲劑對蚊子的驅(qū)避作用有接觸驅(qū)避作用[19,20]和非接觸驅(qū)避作用[21-23]，本研究發(fā)現(xiàn)氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯對白紋伊蚊和埃及伊蚊具有非接觸驅(qū)避作用。埃及伊蚊Puerto Rico抗性品系中鈉離子通道含有kdr突變位點V1023I和F1565C[24]，對擬除蟲菊酯殺蟲劑具有高抗性。本研究中氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯對Puerto Rico品系的驅(qū)避作用均減弱，而DEET對Puerto Rico品系的驅(qū)避作用則與敏感品系無顯著性差異。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊Puerto Rico品系對DEET、四氟苯菊酯、除蟲菊素和氯氟醚菊酯的驅(qū)避作用均比敏感品系弱，且氯氟醚菊酯的驅(qū)避作用減弱程度比四氟甲醚菊酯高，差異顯著。而Bowman等[25]則發(fā)現(xiàn)氯菊酯、溴氰菊酯和醚菊酯對Puerto Rico品系的接觸驅(qū)避作用和非接觸驅(qū)避作用均與敏感品系無顯著性差異。

EAG試驗結(jié)果表明白紋伊蚊和埃及伊蚊能識別高濃度四氟甲醚菊酯，但是不能識別氯氟醚菊酯和其他測試的擬除蟲菊酯殺蟲劑。四氟甲醚菊酯與氯氟醚菊酯、四氟苯菊酯屬于易揮發(fā)性擬除蟲菊酯殺蟲劑，揮發(fā)性無顯著性差異（ChemicalBook），所以造成這一現(xiàn)象的原因不是由于藥物揮發(fā)性，很可能是由于四氟甲醚菊酯純度低，含有少量雜質(zhì)，而蚊子觸角對雜質(zhì)有較強(qiáng)的嗅覺反應(yīng)（未發(fā)表），正如最近Liu等[26]研究表明天然除蟲菊素中微量物質(zhì)(E)-β-法尼烯（EBF）在對蚊子的驅(qū)避行為中起重要作用。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)四氟苯菊酯和氯氟醚菊酯具有很強(qiáng)的EAG響應(yīng)，四氟苯菊酯的EAG反應(yīng)甚至是DEET的2倍，這與本文研究結(jié)果不一致。Yang等[14]在EAG試驗中采用10 mg擬除蟲菊酯，遠(yuǎn)高于行為試驗中藥劑使用濃度，而本文EAG試驗藥劑濃度與驅(qū)避行為試驗一致，設(shè)計更合理，驅(qū)避行為試驗與EAG試驗的結(jié)果對比更能說明驅(qū)避作用不只是由嗅覺系統(tǒng)引起的。此外，本文也測試了白紋伊蚊和埃及伊蚊對10 mg擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應(yīng)，與文中上述結(jié)果一致，氯氟醚菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯均無明顯EAG反應(yīng)（圖6）。本文與Yang等[14]研究結(jié)果不一致的原因很有可能是因為溶劑不同，Yang等[14]使用丙酮作為溶劑，蚊子對丙酮的嗅覺反應(yīng)強(qiáng)烈，測試過程中丙酮揮發(fā)不完全會導(dǎo)致蚊子產(chǎn)生強(qiáng)烈的 EAG反應(yīng)，而本文使用正己烷作為溶劑，正己烷引起的嗅覺反應(yīng)非常小，因此試驗結(jié)果較為可靠。

本研究發(fā)現(xiàn)10-3、10-2mol/L四氟甲醚菊酯只有微弱的EAG反應(yīng)，而氯氟醚菊酯完全沒有EAG反應(yīng)，但是對白紋伊蚊和埃及伊蚊卻有顯著的驅(qū)避現(xiàn)象，可見擬除蟲菊酯殺蟲劑對白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅(qū)避作用主要不是通過嗅覺系統(tǒng)產(chǎn)生的。擬除蟲菊酯殺蟲劑對Puerto Rico品系的驅(qū)避作用減弱，而DEET對Puerto Rico品系的驅(qū)避作用則與敏感品系無顯著性差異，由于擬除蟲菊酯殺蟲劑的靶標(biāo)是鈉離子通道，而DEET則不是，表明很有可能鈉離子通道上的kdr突變在擬除蟲菊酯殺蟲劑對埃及伊蚊的驅(qū)避行為中具有一定的作用，即鈉離子通道可能在擬除蟲菊酯殺蟲劑的驅(qū)避作用中行使一定功能，但是要確證鈉離子通道在擬除蟲菊酯殺蟲劑對蚊子的驅(qū)避行為中發(fā)揮功能還需進(jìn)一步的研究。