周巧玲，徐展益，鄢 茹，朱國(guó)念，陳夢(mèng)麗

（1.浙江大學(xué)農(nóng)藥與環(huán)境毒理研究所，杭州 310058；2.浙江農(nóng)林大學(xué)農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院，杭州 311300）

蚊子是黃熱病、瘧疾和登革熱等傳染性疾病傳播的媒介，登革熱是我國(guó)較嚴(yán)重的蚊子傳染性疾病，2014年廣東省登革熱病例超45000例，是登革熱發(fā)生的高峰年[1,2]。埃及伊蚊Aedesaegypti和白紋伊蚊Aedesalbopictus是登革熱的主要傳播媒介，我國(guó)埃及伊蚊主要分布在廣東、廣西、臺(tái)灣、西雙版納和海南等北緯 22°以南沿海區(qū)域[1]，白紋伊蚊的分布則更為廣泛，北至遼寧省，南至海南省，西至西藏自治區(qū)，分界線從遼寧一路向西，穿過河北、山西、陜西、甘肅省，到達(dá)四川省，再折向西南至西藏南部[3,4]。

防治傳染性疾病最有效的手段是控制疾病傳播的載體。在非洲，殺蟲劑是控制疾病傳染媒介的主要手段，包括殺蟲劑室內(nèi)噴霧（IRS）、殺蟲劑處理蚊帳（ITN）和長(zhǎng)期殺蟲劑處理蚊帳（LLINs）等方法[5]。我國(guó)主要用蚊香片和電蚊香液防止被蚊子叮咬，擬除蟲菊酯殺蟲劑是市場(chǎng)上幾乎所有滅蚊產(chǎn)品的主要成分。擬除蟲菊酯殺蟲劑的作用靶標(biāo)是昆蟲鈉離子通道，隨著擬除蟲菊酯殺蟲劑的廣泛使用，鈉離子通道發(fā)生氨基酸突變，即kdr突變，導(dǎo)致害蟲對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑的敏感性降低，擬除蟲菊酯的防效變差。擬除蟲菊酯殺蟲劑抑制鈉離子通道失活，延長(zhǎng)鈉通道開放，引起神經(jīng)細(xì)胞重復(fù)開放，最終導(dǎo)致害蟲麻痹、死亡[6]。

除殺蟲劑外，驅(qū)避劑在防止蚊蟲叮咬方面也具有重要作用，其中DEET（避蚊胺）是使用最廣泛的驅(qū)避劑。DEET作用于蚊子嗅覺系統(tǒng)，從而產(chǎn)生驅(qū)避作用[7,8]。文獻(xiàn)報(bào)道，擬除蟲菊酯殺蟲劑不僅對(duì)蚊子具有殺蟲活性，同時(shí)也具有很強(qiáng)的驅(qū)避作用[9-12]，其中四氟苯菊酯和甲氧芐呋菊酯蒸氣壓低，揮發(fā)性高，驅(qū)避作用比其他擬除蟲菊酯殺蟲劑更為明顯[12,13]。目前，對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑驅(qū)避作用的研究只是涉及行為學(xué)觀察，對(duì)其機(jī)理的研究尚在起步階段。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)四氟苯菊酯和氯氟醚菊酯能夠刺激埃及伊蚊產(chǎn)生EAG信號(hào)。但其他蚊子是否也能識(shí)別擬除蟲菊酯殺蟲劑，并產(chǎn)生 EAG信號(hào)；其他擬除蟲菊酯殺蟲劑是否也能促使蚊子產(chǎn)生 EAG信號(hào)，尚未可知，需進(jìn)一步研究。本文以白紋伊蚊和埃及伊蚊為研究對(duì)象，研究蚊香主要成分氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯的驅(qū)避作用，初步探索驅(qū)避作用機(jī)理。

1 材料和方法

1.1 供試?yán)ハx

敏感白紋伊蚊品系由浙江省疾控中心提供，采自四川省，于實(shí)驗(yàn)室中飼養(yǎng) 15年，未接觸任何農(nóng)藥。埃及伊蚊購(gòu)自BEI資源庫(kù)，敏感品系為Black Eye Liverpool，抗性品系為Puerto Rico。實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)條件為溫度（27±1）℃，相對(duì)濕度70%±10%，光周期14L∶10D，幼蟲以鼠糧為食，成蟲以10%蔗糖溶液為食，雌蚊產(chǎn)卵前飼喂小白鼠血。

1.2 供試化合物及其配制

97.3%氯氰菊酯、97.7%四氟甲醚菊酯、98.4%四氟苯菊酯、99.1%氯氟醚菊酯和 99.7%聯(lián)苯菊酯均購(gòu)自德國(guó) LGC公司；99%DEET（避蚊胺）購(gòu)自上海麥克林生化科技有限公司。驅(qū)避試驗(yàn)中，將供試化合物標(biāo)樣用丙酮分別配置成10-2、10-3和10-4mol/L濃度梯度的溶液，以丙酮為空白對(duì)照。EAG試驗(yàn)中，將供試化合物標(biāo)樣用正己烷分別配置成10-1、10-2和10-3mol/L濃度梯度的溶液，以正己烷為空白對(duì)照。

1.3 驅(qū)避行為試驗(yàn)

驅(qū)避試驗(yàn)由Boyle等[15]方法改進(jìn)而來。挑選40頭羽化后4～9 d未吸血雌蚊，轉(zhuǎn)移到30 cm×30 cm×30 cm的養(yǎng)蚊籠中，饑餓處理24 h。將500 μL藥液均勻地滴在7 cm×6 cm長(zhǎng)方形尼龍網(wǎng)上，室溫干燥5 min，揮發(fā)丙酮。在橡膠手套上剪一個(gè)6 cm×5 cm的開口，以揮發(fā)人體氣味，在手套上固定3個(gè)磁力框架，在磁力框架之間放置兩層尼龍網(wǎng)，下層為藥液處理的尼龍網(wǎng)，上層為干凈的尼龍網(wǎng)，保證蚊子喙不會(huì)接觸到皮膚和藥。試驗(yàn)前用清水洗凈雙手，帶上橡膠手套，先用溶劑對(duì)照進(jìn)行試驗(yàn)，記錄2～5 min內(nèi)落到手背方形框上的蚊子數(shù)量（一只蚊子在手套窗口停留時(shí)間超過5 s即為1次）。每次試驗(yàn)結(jié)束后間隔1 h，使蚊子完全恢復(fù)，然后進(jìn)行處理組試驗(yàn)。同一化合物同一濃度測(cè)試3批蚊子，每批蚊子設(shè)置3個(gè)重復(fù)。

1.4 觸角電位（EAG）測(cè)定

觸角電位儀由荷蘭Syntech公司的智能化數(shù)據(jù)獲取控制器（IDAC-4）、刺激氣流控制器（Syntech CS-55）、微動(dòng)操作儀（Syntech MN-151）及Syntech 軟件處理系統(tǒng)四部分組成。測(cè)試方法由Boyle等[15]改進(jìn)而來。測(cè)試時(shí)用鋒利刀片切下雌蚊的頭部，并去除觸角尖端。然后將頭部和觸角分別與參考電極和記錄電極上的玻璃針（玻璃針內(nèi)部充滿0.1% KCl和0.5% PVP）相連。取20 μL待測(cè)試樣品溶液滴在定性濾紙（2 cm×0.5 cm）上，加藥后揮發(fā)30 s，用干凈的鑷子將濾紙條塞進(jìn)干凈的巴斯德管中，然后將樣品管末端與氣體刺激裝置連接，待基線平穩(wěn)后給予刺激。持續(xù)氣流流速為20 mL/s，刺激氣流流速為2 mL/s，刺激時(shí)間0.5 s，兩次刺激間隔30 s。先用正己烷測(cè)試，然后每個(gè)化合物由低濃度到高濃度進(jìn)行測(cè)試，重復(fù)3批蚊子，每批蚊子至少取20頭羽化后4～9 d未吸血的雌蚊進(jìn)行測(cè)試。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析及作圖采用GraphPad Primse 8.0軟件。顯著性差異分析采用One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法，所有數(shù)據(jù)均為三個(gè)生物學(xué)重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Means±SE），顯著性檢測(cè)水平為P＜0.05。驅(qū)避率計(jì)算方法如下，驅(qū)避百分?jǐn)?shù)（%）＝[1—（2～5 min內(nèi)化合物處理組落到手上的蚊子數(shù)量總和/2～5 min內(nèi)溶劑對(duì)照組落到手上的蚊子數(shù)量總和）]×100。

2 結(jié)果與分析

2.1 擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅(qū)避行為反應(yīng)

本研究通過驅(qū)避行為試驗(yàn)研究擬除蟲菊酯殺蟲劑四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對(duì)埃及伊蚊和白紋伊蚊的驅(qū)避行為，如圖1和圖2所示，與陽(yáng)性對(duì)照DEET一致，四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對(duì)白紋伊蚊和埃及伊蚊具有明顯的驅(qū)避作用。DEET、四氟甲醚菊酯、氯氟醚菊酯對(duì)白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅(qū)避作用具有劑量效應(yīng)關(guān)系，且濃度10-2mol/L時(shí)，驅(qū)避率均在90%左右（圖1和圖2），可見，四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯是與DEET驅(qū)避效力相當(dāng)?shù)尿?qū)避劑。

圖1 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對(duì)白紋伊蚊具有非接觸驅(qū)避作用Fig.1 Dimefluthrin and meperfluthrin elicit spatial repellency in Ae.albopictus

圖2 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對(duì)埃及伊蚊具有非接觸驅(qū)避作用Fig.2 Dimefluthrin and meperfluthrin elicit spatial repellency in Ae.aegypti

2.2 白紋伊蚊和埃及伊蚊對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應(yīng)

研究表明驅(qū)避劑DEET主要通過嗅覺系統(tǒng)對(duì)蚊子起驅(qū)避作用[16]，為了探索擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)蚊子的驅(qū)避作用是否與DEET一樣，由嗅覺系統(tǒng)引起，本文測(cè)定白紋伊蚊和埃及伊蚊觸角對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應(yīng)。結(jié)果表明，兩種蚊子觸角都對(duì)DEET具有明顯的EAG響應(yīng)，四氟甲醚菊酯產(chǎn)生微弱的EAG反應(yīng)，而氯氟醚菊酯則完全沒有EAG反應(yīng)。此外，本文還檢測(cè)了兩種伊蚊對(duì)其他3種常見的擬除蟲菊酯殺蟲劑氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯的EAG響應(yīng)，結(jié)果表明其他擬除蟲菊酯殺蟲劑均無明顯的EAG反應(yīng)（圖3，4）。

圖3 白紋伊蚊對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應(yīng)Fig.3 EAG responses of female Ae.albopictus to pyrethroids

圖4 埃及伊蚊對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應(yīng)Fig.4 EAG responses of female Ae.aegypti to pyrethroids

2.3 擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)埃及伊蚊抗性品系的驅(qū)避行為反應(yīng)

白紋伊蚊和埃及伊蚊對(duì)四氟甲醚菊酯具有微弱EAG反應(yīng)，而對(duì)氯氟醚菊酯沒有EAG反應(yīng)，但是這兩種擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)白紋伊蚊和埃及伊蚊卻有非常強(qiáng)的驅(qū)避作用，表明除了嗅覺系統(tǒng)外，很可能有其他的靶標(biāo)參與了驅(qū)避作用。本文進(jìn)一步檢測(cè)擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)攜帶有鈉離子通道kdr突變的抗性埃及伊蚊的驅(qū)避作用，結(jié)果表明DEET、四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對(duì)抗性埃及伊蚊的驅(qū)避作用呈現(xiàn)濃度劑量效應(yīng)關(guān)系，且DEET對(duì)敏感和抗性埃及伊蚊的驅(qū)避作用無顯著性差異，而四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對(duì)抗性埃及伊蚊的驅(qū)避作用都比敏感埃及伊蚊弱，差異顯著（圖5）。

圖5 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對(duì)抗性埃及伊蚊的非接觸驅(qū)避作用Fig.5 Spatial repellency of dimefluthrin and meperfluthrin against pyrethroid resistant Ae.aegypti

本文測(cè)試了白紋伊蚊和埃及伊蚊對(duì)10 mg擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應(yīng)，對(duì)氯氟醚菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯均無明顯EAG反應(yīng)（圖6）。

圖6 白紋伊紋和埃及伊蚊對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應(yīng)Fig.6 EAG responses of female Ae.albopictus and Ae.aegypti to pyrethroids

3 討論

蚊子驅(qū)避劑的研究主要集中在DEET，而對(duì)其他驅(qū)避劑的機(jī)理研究較少。2013年，Kain等[17]在Nature上發(fā)表文章表明物種間保守性很高的Ir40a是DEET的靶標(biāo)嗅覺受體，然而后續(xù)通過CRISPR敲除技術(shù)構(gòu)建Ir40a基因敲除果蠅，發(fā)現(xiàn)Ir40a基因敲除果蠅對(duì)DEET的驅(qū)避作用并沒有減弱，因此重新修正結(jié)果[18]。Xu等[16]結(jié)合雙電極電壓鉗技術(shù)和RNA干擾技術(shù)，發(fā)現(xiàn)蚊子驅(qū)避劑DEET作用于庫(kù)蚊嗅覺受體OR136，從而實(shí)現(xiàn)驅(qū)避作用，但是在其他蚊蟲品系中沒有發(fā)現(xiàn)庫(kù)蚊OR136的同源嗅覺受體，因此DEET的靶標(biāo)受體還需進(jìn)一步考證，但是毋庸置疑DEET作用于嗅覺系統(tǒng)而對(duì)蚊子產(chǎn)生驅(qū)避作用。

擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)蚊子的驅(qū)避作用有接觸驅(qū)避作用[19,20]和非接觸驅(qū)避作用[21-23]，本研究發(fā)現(xiàn)氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯對(duì)白紋伊蚊和埃及伊蚊具有非接觸驅(qū)避作用。埃及伊蚊Puerto Rico抗性品系中鈉離子通道含有kdr突變位點(diǎn)V1023I和F1565C[24]，對(duì)擬除蟲菊酯殺蟲劑具有高抗性。本研究中氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯對(duì)Puerto Rico品系的驅(qū)避作用均減弱，而DEET對(duì)Puerto Rico品系的驅(qū)避作用則與敏感品系無顯著性差異。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)埃及伊蚊Puerto Rico品系對(duì)DEET、四氟苯菊酯、除蟲菊素和氯氟醚菊酯的驅(qū)避作用均比敏感品系弱，且氯氟醚菊酯的驅(qū)避作用減弱程度比四氟甲醚菊酯高，差異顯著。而Bowman等[25]則發(fā)現(xiàn)氯菊酯、溴氰菊酯和醚菊酯對(duì)Puerto Rico品系的接觸驅(qū)避作用和非接觸驅(qū)避作用均與敏感品系無顯著性差異。

EAG試驗(yàn)結(jié)果表明白紋伊蚊和埃及伊蚊能識(shí)別高濃度四氟甲醚菊酯，但是不能識(shí)別氯氟醚菊酯和其他測(cè)試的擬除蟲菊酯殺蟲劑。四氟甲醚菊酯與氯氟醚菊酯、四氟苯菊酯屬于易揮發(fā)性擬除蟲菊酯殺蟲劑，揮發(fā)性無顯著性差異（ChemicalBook），所以造成這一現(xiàn)象的原因不是由于藥物揮發(fā)性，很可能是由于四氟甲醚菊酯純度低，含有少量雜質(zhì)，而蚊子觸角對(duì)雜質(zhì)有較強(qiáng)的嗅覺反應(yīng)（未發(fā)表），正如最近Liu等[26]研究表明天然除蟲菊素中微量物質(zhì)(E)-β-法尼烯（EBF）在對(duì)蚊子的驅(qū)避行為中起重要作用。Yang等[14]發(fā)現(xiàn)四氟苯菊酯和氯氟醚菊酯具有很強(qiáng)的EAG響應(yīng)，四氟苯菊酯的EAG反應(yīng)甚至是DEET的2倍，這與本文研究結(jié)果不一致。Yang等[14]在EAG試驗(yàn)中采用10 mg擬除蟲菊酯，遠(yuǎn)高于行為試驗(yàn)中藥劑使用濃度，而本文EAG試驗(yàn)藥劑濃度與驅(qū)避行為試驗(yàn)一致，設(shè)計(jì)更合理，驅(qū)避行為試驗(yàn)與EAG試驗(yàn)的結(jié)果對(duì)比更能說明驅(qū)避作用不只是由嗅覺系統(tǒng)引起的。此外，本文也測(cè)試了白紋伊蚊和埃及伊蚊對(duì)10 mg擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應(yīng)，與文中上述結(jié)果一致，氯氟醚菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯均無明顯EAG反應(yīng)（圖6）。本文與Yang等[14]研究結(jié)果不一致的原因很有可能是因?yàn)槿軇┎煌?，Yang等[14]使用丙酮作為溶劑，蚊子對(duì)丙酮的嗅覺反應(yīng)強(qiáng)烈，測(cè)試過程中丙酮揮發(fā)不完全會(huì)導(dǎo)致蚊子產(chǎn)生強(qiáng)烈的 EAG反應(yīng)，而本文使用正己烷作為溶劑，正己烷引起的嗅覺反應(yīng)非常小，因此試驗(yàn)結(jié)果較為可靠。

本研究發(fā)現(xiàn)10-3、10-2mol/L四氟甲醚菊酯只有微弱的EAG反應(yīng)，而氯氟醚菊酯完全沒有EAG反應(yīng)，但是對(duì)白紋伊蚊和埃及伊蚊卻有顯著的驅(qū)避現(xiàn)象，可見擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅(qū)避作用主要不是通過嗅覺系統(tǒng)產(chǎn)生的。擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)Puerto Rico品系的驅(qū)避作用減弱，而DEET對(duì)Puerto Rico品系的驅(qū)避作用則與敏感品系無顯著性差異，由于擬除蟲菊酯殺蟲劑的靶標(biāo)是鈉離子通道，而DEET則不是，表明很有可能鈉離子通道上的kdr突變?cè)跀M除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)埃及伊蚊的驅(qū)避行為中具有一定的作用，即鈉離子通道可能在擬除蟲菊酯殺蟲劑的驅(qū)避作用中行使一定功能，但是要確證鈉離子通道在擬除蟲菊酯殺蟲劑對(duì)蚊子的驅(qū)避行為中發(fā)揮功能還需進(jìn)一步的研究。