周巧玲，徐展益，鄢 茹，朱國念，陳夢麗

（1.浙江大學農藥與環(huán)境毒理研究所，杭州 310058；2.浙江農林大學農業(yè)與食品科學學院，杭州 311300）

蚊子是黃熱病、瘧疾和登革熱等傳染性疾病傳播的媒介，登革熱是我國較嚴重的蚊子傳染性疾病，2014年廣東省登革熱病例超45000例，是登革熱發(fā)生的高峰年[1,2]。埃及伊蚊Aedesaegypti和白紋伊蚊Aedesalbopictus是登革熱的主要傳播媒介，我國埃及伊蚊主要分布在廣東、廣西、臺灣、西雙版納和海南等北緯 22°以南沿海區(qū)域[1]，白紋伊蚊的分布則更為廣泛，北至遼寧省，南至海南省，西至西藏自治區(qū)，分界線從遼寧一路向西，穿過河北、山西、陜西、甘肅省，到達四川省，再折向西南至西藏南部[3,4]。

防治傳染性疾病最有效的手段是控制疾病傳播的載體。在非洲，殺蟲劑是控制疾病傳染媒介的主要手段，包括殺蟲劑室內噴霧（IRS）、殺蟲劑處理蚊帳（ITN）和長期殺蟲劑處理蚊帳（LLINs）等方法[5]。我國主要用蚊香片和電蚊香液防止被蚊子叮咬，擬除蟲菊酯殺蟲劑是市場上幾乎所有滅蚊產品的主要成分。擬除蟲菊酯殺蟲劑的作用靶標是昆蟲鈉離子通道，隨著擬除蟲菊酯殺蟲劑的廣泛使用，鈉離子通道發(fā)生氨基酸突變，即kdr突變，導致害蟲對擬除蟲菊酯殺蟲劑的敏感性降低，擬除蟲菊酯的防效變差。擬除蟲菊酯殺蟲劑抑制鈉離子通道失活，延長鈉通道開放，引起神經細胞重復開放，最終導致害蟲麻痹、死亡[6]。

除殺蟲劑外，驅避劑在防止蚊蟲叮咬方面也具有重要作用，其中DEET（避蚊胺）是使用最廣泛的驅避劑。DEET作用于蚊子嗅覺系統(tǒng)，從而產生驅避作用[7,8]。文獻報道，擬除蟲菊酯殺蟲劑不僅對蚊子具有殺蟲活性，同時也具有很強的驅避作用[9-12]，其中四氟苯菊酯和甲氧芐呋菊酯蒸氣壓低，揮發(fā)性高，驅避作用比其他擬除蟲菊酯殺蟲劑更為明顯[12,13]。目前，對擬除蟲菊酯殺蟲劑驅避作用的研究只是涉及行為學觀察，對其機理的研究尚在起步階段。Yang等[14]發(fā)現四氟苯菊酯和氯氟醚菊酯能夠刺激埃及伊蚊產生EAG信號。但其他蚊子是否也能識別擬除蟲菊酯殺蟲劑，并產生 EAG信號；其他擬除蟲菊酯殺蟲劑是否也能促使蚊子產生 EAG信號，尚未可知，需進一步研究。本文以白紋伊蚊和埃及伊蚊為研究對象，研究蚊香主要成分氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯的驅避作用，初步探索驅避作用機理。

1 材料和方法

1.1 供試昆蟲

敏感白紋伊蚊品系由浙江省疾控中心提供，采自四川省，于實驗室中飼養(yǎng) 15年，未接觸任何農藥。埃及伊蚊購自BEI資源庫，敏感品系為Black Eye Liverpool，抗性品系為Puerto Rico。實驗室飼養(yǎng)條件為溫度（27±1）℃，相對濕度70%±10%，光周期14L∶10D，幼蟲以鼠糧為食，成蟲以10%蔗糖溶液為食，雌蚊產卵前飼喂小白鼠血。

1.2 供試化合物及其配制

97.3%氯氰菊酯、97.7%四氟甲醚菊酯、98.4%四氟苯菊酯、99.1%氯氟醚菊酯和 99.7%聯(lián)苯菊酯均購自德國 LGC公司；99%DEET（避蚊胺）購自上海麥克林生化科技有限公司。驅避試驗中，將供試化合物標樣用丙酮分別配置成10-2、10-3和10-4mol/L濃度梯度的溶液，以丙酮為空白對照。EAG試驗中，將供試化合物標樣用正己烷分別配置成10-1、10-2和10-3mol/L濃度梯度的溶液，以正己烷為空白對照。

1.3 驅避行為試驗

驅避試驗由Boyle等[15]方法改進而來。挑選40頭羽化后4～9 d未吸血雌蚊，轉移到30 cm×30 cm×30 cm的養(yǎng)蚊籠中，饑餓處理24 h。將500 μL藥液均勻地滴在7 cm×6 cm長方形尼龍網上，室溫干燥5 min，揮發(fā)丙酮。在橡膠手套上剪一個6 cm×5 cm的開口，以揮發(fā)人體氣味，在手套上固定3個磁力框架，在磁力框架之間放置兩層尼龍網，下層為藥液處理的尼龍網，上層為干凈的尼龍網，保證蚊子喙不會接觸到皮膚和藥。試驗前用清水洗凈雙手，帶上橡膠手套，先用溶劑對照進行試驗，記錄2～5 min內落到手背方形框上的蚊子數量（一只蚊子在手套窗口停留時間超過5 s即為1次）。每次試驗結束后間隔1 h，使蚊子完全恢復，然后進行處理組試驗。同一化合物同一濃度測試3批蚊子，每批蚊子設置3個重復。

1.4 觸角電位（EAG）測定

觸角電位儀由荷蘭Syntech公司的智能化數據獲取控制器（IDAC-4）、刺激氣流控制器（Syntech CS-55）、微動操作儀（Syntech MN-151）及Syntech 軟件處理系統(tǒng)四部分組成。測試方法由Boyle等[15]改進而來。測試時用鋒利刀片切下雌蚊的頭部，并去除觸角尖端。然后將頭部和觸角分別與參考電極和記錄電極上的玻璃針（玻璃針內部充滿0.1% KCl和0.5% PVP）相連。取20 μL待測試樣品溶液滴在定性濾紙（2 cm×0.5 cm）上，加藥后揮發(fā)30 s，用干凈的鑷子將濾紙條塞進干凈的巴斯德管中，然后將樣品管末端與氣體刺激裝置連接，待基線平穩(wěn)后給予刺激。持續(xù)氣流流速為20 mL/s，刺激氣流流速為2 mL/s，刺激時間0.5 s，兩次刺激間隔30 s。先用正己烷測試，然后每個化合物由低濃度到高濃度進行測試，重復3批蚊子，每批蚊子至少取20頭羽化后4～9 d未吸血的雌蚊進行測試。

1.5 數據統(tǒng)計與分析

數據的統(tǒng)計分析及作圖采用GraphPad Primse 8.0軟件。顯著性差異分析采用One-Way ANOVA-Fisher中的LSD方法，所有數據均為三個生物學重復的平均值±標準誤（Means±SE），顯著性檢測水平為P＜0.05。驅避率計算方法如下，驅避百分數（%）＝[1—（2～5 min內化合物處理組落到手上的蚊子數量總和/2～5 min內溶劑對照組落到手上的蚊子數量總和）]×100。

2 結果與分析

2.1 擬除蟲菊酯殺蟲劑對白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅避行為反應

本研究通過驅避行為試驗研究擬除蟲菊酯殺蟲劑四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對埃及伊蚊和白紋伊蚊的驅避行為，如圖1和圖2所示，與陽性對照DEET一致，四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對白紋伊蚊和埃及伊蚊具有明顯的驅避作用。DEET、四氟甲醚菊酯、氯氟醚菊酯對白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅避作用具有劑量效應關系，且濃度10-2mol/L時，驅避率均在90%左右（圖1和圖2），可見，四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯是與DEET驅避效力相當的驅避劑。

圖1 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對白紋伊蚊具有非接觸驅避作用Fig.1 Dimefluthrin and meperfluthrin elicit spatial repellency in Ae.albopictus

圖2 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對埃及伊蚊具有非接觸驅避作用Fig.2 Dimefluthrin and meperfluthrin elicit spatial repellency in Ae.aegypti

2.2 白紋伊蚊和埃及伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應

研究表明驅避劑DEET主要通過嗅覺系統(tǒng)對蚊子起驅避作用[16]，為了探索擬除蟲菊酯殺蟲劑對蚊子的驅避作用是否與DEET一樣，由嗅覺系統(tǒng)引起，本文測定白紋伊蚊和埃及伊蚊觸角對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應。結果表明，兩種蚊子觸角都對DEET具有明顯的EAG響應，四氟甲醚菊酯產生微弱的EAG反應，而氯氟醚菊酯則完全沒有EAG反應。此外，本文還檢測了兩種伊蚊對其他3種常見的擬除蟲菊酯殺蟲劑氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯的EAG響應，結果表明其他擬除蟲菊酯殺蟲劑均無明顯的EAG反應（圖3，4）。

圖3 白紋伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應Fig.3 EAG responses of female Ae.albopictus to pyrethroids

圖4 埃及伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應Fig.4 EAG responses of female Ae.aegypti to pyrethroids

2.3 擬除蟲菊酯殺蟲劑對埃及伊蚊抗性品系的驅避行為反應

白紋伊蚊和埃及伊蚊對四氟甲醚菊酯具有微弱EAG反應，而對氯氟醚菊酯沒有EAG反應，但是這兩種擬除蟲菊酯殺蟲劑對白紋伊蚊和埃及伊蚊卻有非常強的驅避作用，表明除了嗅覺系統(tǒng)外，很可能有其他的靶標參與了驅避作用。本文進一步檢測擬除蟲菊酯殺蟲劑對攜帶有鈉離子通道kdr突變的抗性埃及伊蚊的驅避作用，結果表明DEET、四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對抗性埃及伊蚊的驅避作用呈現濃度劑量效應關系，且DEET對敏感和抗性埃及伊蚊的驅避作用無顯著性差異，而四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對抗性埃及伊蚊的驅避作用都比敏感埃及伊蚊弱，差異顯著（圖5）。

圖5 四氟甲醚菊酯和氯氟醚菊酯對抗性埃及伊蚊的非接觸驅避作用Fig.5 Spatial repellency of dimefluthrin and meperfluthrin against pyrethroid resistant Ae.aegypti

本文測試了白紋伊蚊和埃及伊蚊對10 mg擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應，對氯氟醚菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯均無明顯EAG反應（圖6）。

圖6 白紋伊紋和埃及伊蚊對擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG響應Fig.6 EAG responses of female Ae.albopictus and Ae.aegypti to pyrethroids

3 討論

蚊子驅避劑的研究主要集中在DEET，而對其他驅避劑的機理研究較少。2013年，Kain等[17]在Nature上發(fā)表文章表明物種間保守性很高的Ir40a是DEET的靶標嗅覺受體，然而后續(xù)通過CRISPR敲除技術構建Ir40a基因敲除果蠅，發(fā)現Ir40a基因敲除果蠅對DEET的驅避作用并沒有減弱，因此重新修正結果[18]。Xu等[16]結合雙電極電壓鉗技術和RNA干擾技術，發(fā)現蚊子驅避劑DEET作用于庫蚊嗅覺受體OR136，從而實現驅避作用，但是在其他蚊蟲品系中沒有發(fā)現庫蚊OR136的同源嗅覺受體，因此DEET的靶標受體還需進一步考證，但是毋庸置疑DEET作用于嗅覺系統(tǒng)而對蚊子產生驅避作用。

擬除蟲菊酯殺蟲劑對蚊子的驅避作用有接觸驅避作用[19,20]和非接觸驅避作用[21-23]，本研究發(fā)現氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯對白紋伊蚊和埃及伊蚊具有非接觸驅避作用。埃及伊蚊Puerto Rico抗性品系中鈉離子通道含有kdr突變位點V1023I和F1565C[24]，對擬除蟲菊酯殺蟲劑具有高抗性。本研究中氯氟醚菊酯和四氟甲醚菊酯對Puerto Rico品系的驅避作用均減弱，而DEET對Puerto Rico品系的驅避作用則與敏感品系無顯著性差異。Yang等[14]發(fā)現埃及伊蚊Puerto Rico品系對DEET、四氟苯菊酯、除蟲菊素和氯氟醚菊酯的驅避作用均比敏感品系弱，且氯氟醚菊酯的驅避作用減弱程度比四氟甲醚菊酯高，差異顯著。而Bowman等[25]則發(fā)現氯菊酯、溴氰菊酯和醚菊酯對Puerto Rico品系的接觸驅避作用和非接觸驅避作用均與敏感品系無顯著性差異。

EAG試驗結果表明白紋伊蚊和埃及伊蚊能識別高濃度四氟甲醚菊酯，但是不能識別氯氟醚菊酯和其他測試的擬除蟲菊酯殺蟲劑。四氟甲醚菊酯與氯氟醚菊酯、四氟苯菊酯屬于易揮發(fā)性擬除蟲菊酯殺蟲劑，揮發(fā)性無顯著性差異（ChemicalBook），所以造成這一現象的原因不是由于藥物揮發(fā)性，很可能是由于四氟甲醚菊酯純度低，含有少量雜質，而蚊子觸角對雜質有較強的嗅覺反應（未發(fā)表），正如最近Liu等[26]研究表明天然除蟲菊素中微量物質(E)-β-法尼烯（EBF）在對蚊子的驅避行為中起重要作用。Yang等[14]發(fā)現四氟苯菊酯和氯氟醚菊酯具有很強的EAG響應，四氟苯菊酯的EAG反應甚至是DEET的2倍，這與本文研究結果不一致。Yang等[14]在EAG試驗中采用10 mg擬除蟲菊酯，遠高于行為試驗中藥劑使用濃度，而本文EAG試驗藥劑濃度與驅避行為試驗一致，設計更合理，驅避行為試驗與EAG試驗的結果對比更能說明驅避作用不只是由嗅覺系統(tǒng)引起的。此外，本文也測試了白紋伊蚊和埃及伊蚊對10 mg擬除蟲菊酯殺蟲劑的EAG反應，與文中上述結果一致，氯氟醚菊酯、氯氰菊酯、聯(lián)苯菊酯、四氟苯菊酯均無明顯EAG反應（圖6）。本文與Yang等[14]研究結果不一致的原因很有可能是因為溶劑不同，Yang等[14]使用丙酮作為溶劑，蚊子對丙酮的嗅覺反應強烈，測試過程中丙酮揮發(fā)不完全會導致蚊子產生強烈的 EAG反應，而本文使用正己烷作為溶劑，正己烷引起的嗅覺反應非常小，因此試驗結果較為可靠。

本研究發(fā)現10-3、10-2mol/L四氟甲醚菊酯只有微弱的EAG反應，而氯氟醚菊酯完全沒有EAG反應，但是對白紋伊蚊和埃及伊蚊卻有顯著的驅避現象，可見擬除蟲菊酯殺蟲劑對白紋伊蚊和埃及伊蚊的驅避作用主要不是通過嗅覺系統(tǒng)產生的。擬除蟲菊酯殺蟲劑對Puerto Rico品系的驅避作用減弱，而DEET對Puerto Rico品系的驅避作用則與敏感品系無顯著性差異，由于擬除蟲菊酯殺蟲劑的靶標是鈉離子通道，而DEET則不是，表明很有可能鈉離子通道上的kdr突變在擬除蟲菊酯殺蟲劑對埃及伊蚊的驅避行為中具有一定的作用，即鈉離子通道可能在擬除蟲菊酯殺蟲劑的驅避作用中行使一定功能，但是要確證鈉離子通道在擬除蟲菊酯殺蟲劑對蚊子的驅避行為中發(fā)揮功能還需進一步的研究。