馬 娟,郭笑笑,李秀花,王容燕,高 波,陳書龍
(河北省農林科學院植物保護研究所/河北省農業(yè)有害生物綜合防治工程技術研究中心/農業(yè)農村部華北北部作物有害生物綜合治理重點實驗室,保定 071000)
昆蟲病原線蟲(entomopathogenic nematodes,EPNs)可以寄生昆蟲,其中的斯氏屬Steinernema和異小桿屬Heterorhabditis線蟲對地下害蟲[1,2]和一些鉆蛀性害蟲[3]都具有較好的防治效果,是一類新型高效生物殺蟲劑。昆蟲病原線蟲可以主動搜尋寄主,具有殺蟲范圍廣、易于人工培養(yǎng)、使用安全等優(yōu)點[4]。昆蟲病原線蟲還可以與化學農藥混用,在一些區(qū)域是可替代化學殺蟲劑的環(huán)境友好型生防因子,已在世界上很多地區(qū)進行了商業(yè)化生產和銷售[5,6]。昆蟲病原線蟲成功地侵染寄主昆蟲需要適宜的外界條件,如合適的溫度、濕度和紫外輻射等。能否克服不良外界環(huán)境、成功在田間持續(xù)生存決定了昆蟲病原線蟲對害蟲的防控效果。近年來隨著抗干燥劑和抗輻射劑等保護性助劑的應用,昆蟲病原線蟲防治效果不斷提高,應用范圍不斷擴大[7]。然而在農業(yè)生產實踐中,土壤環(huán)境復雜,極端高溫、低溫或者干燥的條件都不利于昆蟲病原線蟲的實際應用。因此,對不良環(huán)境具備較強耐受能力的昆蟲病原線蟲品系具有更廣泛應用的價值。
當前已報道的斯氏屬昆蟲病原線蟲有100個種,異小桿屬昆蟲病原線蟲有21個種[8],它們對不良環(huán)境的抵御能力存在較大差異。吳霞等[9]對S.feltiae0619HT、S.bicornutum631PG、S.affine0619M、S.kraussei0657L、S.karii0663YC、H.megidis0627M、H.brevicaudis0641TY、H.marelatu0639G 八種昆蟲病原線蟲進行了測試,發(fā)現S.kraussei抗低濕脅迫能力最強,異小桿線蟲抗低濕脅迫能力較斯氏線蟲弱;低濕脅迫對昆蟲病原線蟲致病力無顯著影響,且對S.felitiae和H.megidis的生殖力無顯著影響。Patel 等[10]研究后發(fā)現小卷蛾斯氏線蟲S.carpocapsae對快速干燥的耐性比S.feltiae、S.glasseri和S.riobrave更強。同一種類的昆蟲病原線蟲的不同地理種群之間,經過適應不同的生存環(huán)境,其抗逆能力也會發(fā)生較大變化。SteinernemafeltiaeIS-6 和IS-15品系(以色列)比S.feltiaeN8品系(德國)更耐干燥[11]。Somasekhar等[12]報道來自美國不同地理種群的S.carpocapsae線蟲對高滲和缺氧脅迫的耐受能力差異顯著。
為拓寬昆蟲病原線蟲防治害蟲的范圍和更有效地防治害蟲,需要不斷挖掘線蟲資源,系統(tǒng)研究其生物學、生理生化等特性,為昆蟲病原線蟲的田間應用提供科學依據。本實驗室多年來在我國不同地域采樣,陸續(xù)分離到大量昆蟲病原線蟲種群。本文中對 17個不同種類的EPN品系進行了耐低溫、高溫和干燥等生物學測定,以期為生產提供優(yōu)質的昆蟲病原線蟲種群,為不同種類的昆蟲病原線蟲的田間應用提供科學依據。
SteinernemacarpocapsaeAll為本實驗室保存,HeterorhabditismegidisXY-4和S.litoraleB13由新疆農業(yè)科學院微生物研究所饋贈。其他線蟲品系均由本實驗室在不同地區(qū)土壤中采集獲得(表1)。不同種群的昆蟲病原線蟲均在 25 ℃用大蠟螟末齡幼蟲活體培養(yǎng),采用 White trap法收集侵染期幼蟲(Infective juveniles,IJs),用滅菌水洗凈后備用,試驗用線蟲保存時間不超過2周。
將1 mL線蟲懸浮液(1000 IJs/mL)轉移至24孔板孔中,封口膜封口后置于40 ℃恒溫培養(yǎng)箱內,分別于1、2、3、4、6、18 h后從每孔中取出100 μL線蟲液,加蒸餾水800 μL后,置于25 ℃恒溫箱內。24 h后顯微鏡下檢查線蟲死亡數,物理刺激后不動的線蟲判定為死亡。每個處理6個重復。以放置于25 ℃處理的線蟲為對照。分別統(tǒng)計各處理線蟲死亡率。
取1 mL線蟲懸浮液(1000 IJs/mL)于24孔板中,用封口膜密封置于(-5±1)℃培養(yǎng)箱,分別于6、12、24、36、48、72 h后取出100 μL線蟲懸浮液,加蒸餾水800 μL后置于25 ℃培養(yǎng)箱中,24 h后鏡檢線蟲死亡數,判別線蟲死活方法同上。以放置于25 ℃處理的線蟲為對照,每個處理6個重復。
取各品系侵染期線蟲,分別滴加1 mL含有1000條線蟲的甘油懸浮液(甘油濃度為25%)于24孔板中,封口后置于(25±1)℃培養(yǎng)箱中,分別于24、39、48、60、72 h后取出100 μL線蟲懸浮液,加蒸餾水2 mL后置于25 ℃培養(yǎng)箱中,24 h后鏡檢線蟲死亡數。以未添加甘油的線蟲液作為對照,每處理6個重復[13,14]。
取不同品系昆蟲病原線蟲懸浮液,調整線蟲液濃度使其一致。24孔板中每孔放入2 g滅菌沙土,加入200 μL線蟲懸浮液(含50條線蟲),放入1頭大蠟螟末齡幼蟲,置于25 ℃培養(yǎng)箱中,24 h后檢查死亡率。每個處理8頭大蠟螟幼蟲,重復3次。
百分數值經反正弦轉換后運用SPSS 16.0進行方差分析,Tukey法檢驗不同處理之間的差異顯著性,概率水平設P<0.05。
不同品系的昆蟲病原線蟲在25 ℃放置18 h后線蟲個體死亡率均低于3%。將不同種類的線蟲在40 ℃高溫處理不同時間后取出置于25 ℃,線蟲開始復蘇并恢復運動能力。在40 ℃處理18 h后所有線蟲幾乎全部死亡。不同種群的昆蟲病原線蟲耐熱能力不同,S.xinbinenseLFS48和S.sp ZLS3 耐熱能力顯著低于其他種群,經40 ℃處理1 h 后就有90%以上線蟲個體死亡;S.hebeienseG6、S.feltiaeJY-90 和LFS67耐熱力亦較低,40 ℃處理1 h后,雖然三個種群線蟲個體死亡率低于6%,但是經40 ℃處理2 h后線蟲幾乎全部死亡。高溫處理3 h后,所有參試的異小桿線蟲品系的死亡率均在15%以下,而參試的斯氏線蟲除S.tielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll外,其余的幾乎全部死亡。HeterorhabditisbacteriophoraHQ-4和H.beicherrianaNCWZ1經高溫處理4 h后線蟲個體死亡率低于10%,抗高溫能力相對較強。SteinernematielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll線蟲對高溫的抗性強,連續(xù)高溫處理6 h后,線蟲個體死亡率仍低于10%;而其他種類的昆蟲病原線蟲幾乎全部死亡(表2)。
表2 不同品系昆蟲病原線蟲在高溫下(40 ℃)的死亡率Table 2 Mortality of different entomopathogenic nematode strains exposed to 40 ℃ stress
不同品系的昆蟲病原線蟲在25 ℃放置72 h后線蟲個體死亡率均低于5%。Steinenemasp.ZLS3、S.carpocapsaeAll對低溫耐受性最好,-5 ℃處理72 h后線蟲個體死亡率分別為1.14%和1.93%;其次是S.feltiaeLFS67、S.feltiaeJY90和H.beicherrianaNCWZ1,-5 ℃處理72 h后線蟲個體死亡率低于40%。H.indicaHNPY2和S.litoraleB13線蟲的低溫耐受性差,-5 ℃處理24 h后線蟲死亡率分別是100%和81.72%,均顯著高于其他線蟲種群。經過低溫處理72 h后,H.beicherriana種內采集地不同的CD-11、LJ-24和NCWZ1三個品系線蟲死亡率分別為100%、84.14%和23.65%,差異顯著;S.feltiae種內4個品系線蟲死亡率最低的為15.87%,最高的死亡率達到93%(表3)。
表3 不同品系昆蟲病原線蟲在低溫(-5 ℃)下的死亡率Table 3 Mortality of different strains of entomopathogenic nematode exposed to -5 ℃ stress
不同昆蟲病原線蟲種類與品系耐干燥能力測試結果參見表 4。所測試的各昆蟲病原線蟲在 25 ℃放置72 h后線蟲個體死亡率均低于5%。經25%甘油水溶液處理72 h后,Steinernemasp ZLS3、S.ceratophorumHQA87、S.carpocapsaeAll和S.hebeienseG6線蟲個體死亡率較低,分別為9.05%、7.25%、1.34%和15.86%,顯著低于其他品系線蟲的死亡率(P<0.05)。所測試的異小桿線蟲H.bacteriophora、H.beicherriana、H.indica和H.megidis耐干燥性都較差,干燥處理24 h后線蟲死亡率均在85%以上。
表4 不同品系昆蟲病原線蟲經25%甘油水溶液處理后在干燥條件下的死亡率Table 4 Mortality of different strains of entomopathogenic nematodes exposure to 25% glycerol
通過上述試驗篩選出9種在高溫、低溫或干燥的環(huán)境條件下有較強抗性的線蟲品系,并測試其對大蠟螟末齡幼蟲的致病力(圖1)。在處理36 h后,S.ceratophorumHQA87、S.tielingenseLFS65、S.feltiaeJY-90和S.carpocapsaeAll對大蠟螟致死率達到100%。處理48 h后,H.beicherrianaLJ-24、S.feltiaeJY20-1對大蠟螟致死率也達到了 100%;對照大蠟螟無死亡。所測試的異小桿線蟲H.bacteriophoraHQ-4、H.beicherrianaNCWZ1對大蠟螟致死時間比所測試的斯氏線蟲稍長,24 h時大蠟螟無死亡,48 h時大蠟螟死亡率分別為73%和92%。
圖1 不同品系昆蟲病原線蟲對大蠟螟末齡幼蟲致死率Fig.1 Infectivity of infective juveniles from different EPN strains to last instars of G.mellonella
隨著我國綠色農業(yè)發(fā)展,今后昆蟲病原線蟲在農業(yè)害蟲防治中必將發(fā)揮重要的作用。當前昆蟲病原線蟲已成功地應用于很多農業(yè)害蟲的防治[15,16],但在實際生產中昆蟲病原線蟲的防治效果會受到線蟲種類及品系、環(huán)境條件和施用技術等制約。不良的環(huán)境條件影響昆蟲病原線蟲的存活、侵入、致病和繁殖,發(fā)掘環(huán)境適應性強的線蟲種群是拓展昆蟲病原線蟲在不同區(qū)域商業(yè)化應用的保障。
土壤溫度是決定昆蟲病原線蟲防效的重要因素,較高或較低的溫度對線蟲的遷移、侵染寄主、繁殖和存活等都有不利的影響。已有報道不同種類EPN或不同來源的EPN品系對溫度的抗性存在差異[17,18]。由甘肅省采集的H.megidis在25 ℃時對大蠟螟致死率最高,而S.feltiae在15 ℃、25 ℃和30 ℃下對大蠟螟致死率無顯著差異[19]。Ali和Wharton[20]報道S.feltiae和H.bacteriophora對低溫具有中等抗性,線蟲經-13 ℃低溫處理后對大蠟螟致病力未受影響。李星月等[21]發(fā)現線蟲H.beicherrianaCherry品系在38 ℃放置44 h后線蟲全部死亡,在40 ℃放置220 min后線蟲全部死亡。在本試驗中H.beicherrianaNCWZ1和H.beicherrianaLJ24在40 ℃放置4 h后死亡率僅為7.96%和0.69%。存在差異的原因可能是由于三者采集地不同。在本試驗中,除了S.tielingenseLFS65、S.ceratophorumHQA87 和S.carpocapsaeAll外,所測試的異小桿線蟲H.bacteriophora、H.beicherriana、H.indica、H.megidis耐熱性均高于所測試的斯氏線蟲(S.hebeiense、S.feltiae、S.litorale);Heterorhabditisbacteriophora和S.feltiae同一種內不同品系間耐低溫能力差異顯著。SteinernematielingenseLFS65和S.xinbinenseLFS48 是本團隊在遼寧省采集到的斯氏線蟲新種類[22,23];在其他地區(qū)尚未有這兩種線蟲的相關報道。本研究發(fā)現S.tielingenseLFS65具有很強的耐熱性,不耐干燥;而S.xinbinenseLFS48耐干燥能力較強,但不耐高溫。
昆蟲病原線蟲對水分具有很強的依賴性,干燥的環(huán)境條件限制了昆蟲病原線蟲在葉部和土壤害蟲中的應用。濕度過大或者干燥都不利于昆蟲病原線蟲的侵染和長期存活,不同種類的EPN侵染昆蟲的最適濕度不同[24]。Shapiro-Ilan等[25]報道S.carpocapsae抗干燥能力最強,其次是S.feltiae,異小桿線蟲抗干燥能力較弱。邢玉芳等[26]報道經過低濕條件處理后甘肅省采集的斯氏屬線蟲S.feltiae、S.affine和S.kraussei等存活率高于H.megidis,H.brevicaudis和H.marelatu。甘油溶液可以使線蟲進行滲透脫水[27]。在本試驗中,利用甘油水溶液測試了不同EPN品系經過滲透壓脫水后的存活狀態(tài)。已商業(yè)化生產的S.carpocapsaeAll品系存活率最高,耐干燥能力強,與已有報道一致;Steinernemasp ZLS3及S.ceratophorumHQA87線蟲的抗干燥能力高于其他測試線蟲,與S.carpocapsaeAll無顯著差異,可以作為干旱地區(qū)農業(yè)生產上線蟲應用資源。
本文分別研究了溫度和干燥條件對不同昆蟲病原線蟲存活的影響,測試了近幾年在我國分離到的昆蟲病原線蟲新種類(S.tielingense、S.xinbinense、H.beicherriana、S.sp.ZLS3)的抗逆性等特征,根據不同條件篩選出了S.ceratophorumHQA87及S.tielingenseLFS65等優(yōu)良線蟲品系。在不同地域環(huán)境中有針對性地應用不同抗性的EPN品系可提高其殺蟲效果,擴大其應用范圍。本研究可對昆蟲病原線蟲更好地推廣和應用提供支撐。