楊小龍，石朝慧，喬 燚，游鐘浩，顧 鋼，林智慧，周 挺，梁頒捷，陳承亮，劉國坤，肖 順*

（1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，福州 350002；2.福建省煙草公司煙草科學(xué)研究所，福州 350003；3.福建省煙草公司三明市公司，三明 365000）

木霉菌Trichodermaspp.是一類適應(yīng)性強，生長迅速，分布廣泛的真菌[1-5]。木霉菌種類眾多，在植物病害生物防治、土壤修復(fù)、促進(jìn)植物生長等方面得到廣泛的關(guān)注與應(yīng)用[6]。棘孢木霉T.asperellum是目前國內(nèi)外研究相對較多的生防菌，其可通過競爭作用、重寄生作用、促生作用、抗生作用等多重生防機制抑制植物病原菌[7]。近年來，大多數(shù)木霉菌商業(yè)制劑都使用分生孢子作為制劑的有效成分[8]，獲得高產(chǎn)量、易收獲、低成本的木霉菌分生孢子的研究仍是研究的熱點[9]。固態(tài)發(fā)酵仍是目前被公認(rèn)為生產(chǎn)木霉菌分生孢子最好的方法[10,11]。

固體發(fā)酵又稱為固態(tài)發(fā)酵，根據(jù)固態(tài)發(fā)酵所使用固相的性質(zhì)，可將固態(tài)發(fā)酵分為營養(yǎng)載體固體發(fā)酵與惰性載體固體發(fā)酵[12,13]。營養(yǎng)載體固體發(fā)酵雖然歷史悠久、成本較低，但也存在過程繁瑣、周期較長、易污染、不易收集純孢粉、底物容易結(jié)塊導(dǎo)致通氣不足等缺點[14,15]，在工業(yè)化生產(chǎn)中存在一定的局限性。惰性載體固體發(fā)酵是一種新型固體發(fā)酵技術(shù)，利用惰性載體固體發(fā)酵后可以更清潔地獲取產(chǎn)物，加之其發(fā)酵載體性狀穩(wěn)定，還可以被多次重復(fù)利用[16-18]。惰性載體固體發(fā)酵木霉菌的研究可能是解決當(dāng)前木霉菌發(fā)酵工藝中存在局限性問題的一種有效途徑。

聚氨酯海綿Polyurethane Sponges具有較規(guī)律的孔隙排列、穩(wěn)定的物理結(jié)構(gòu)及較好的持水率，可為真菌發(fā)酵提供良好的通氣和散熱途徑。近幾年，惰性載體固體發(fā)酵研究比較廣泛，展現(xiàn)出較好的發(fā)展前景，但主要集中于活性物質(zhì)的生產(chǎn)[19-21]，Hu等[22]利用聚氨酯海綿固態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)纖維素酶，酶產(chǎn)率顯著高于不使用惰性載體的對照。但是對于惰性載體固體發(fā)酵生產(chǎn)真菌分生孢子的文章鮮有報道。

本實驗室在前期研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉菌THGY-01可在吸有液體培養(yǎng)基的聚氨酯海綿惰性載體上生長良好并產(chǎn)孢，由于培養(yǎng)基的組成是直接影響發(fā)酵代謝產(chǎn)物和孢子產(chǎn)量最重要的影響因素之一[23]，所以對培養(yǎng)基的篩選和優(yōu)化是聚氨酯海綿惰性載體發(fā)酵的一個基礎(chǔ)性研究。

因此，本研究以棘孢木霉THGY-01為試驗菌株，以單位質(zhì)量聚氨酯海綿載體產(chǎn)孢量為指標(biāo)，篩選產(chǎn)孢最佳的培養(yǎng)基配方，為發(fā)酵條件優(yōu)化和發(fā)酵工藝構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：棘孢木霉Trichodermaasperellum（CGMCC No：22422）THGY-01，由本實驗室保藏（從食用菌栽培培養(yǎng)獲得）。

供試載體：聚氨酯海綿（購買自瑞安市方圓聚氨酯有限公司，ρ＝28 kg/m3，孔徑：30 ppi（約0.4～0.6 mm），前期試驗篩選確定使用該密度與孔徑大?。?/p>

供試培養(yǎng)液：基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅰ）：蛋白胨2.5 g，MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43.0 g；基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅱ）：葡萄糖20.0 g、MgSO4·7H2O 1.5 g，KH2PO43.0 g；基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅲ）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨2.5 g；基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅳ）：葡萄糖20.0 g，蛋白胨2.5 g，KH2PO43.0 g；各物質(zhì)溶解后，均定容至1000 mL，分裝至500 mL的錐形瓶內(nèi)（裝量為250 mL/瓶），1.01×105Pa，121 ℃高壓濕熱滅菌20 min。

1.2 試驗方法

1.2.1 種子液的制備 用無菌水將培養(yǎng)6～7 d的木霉菌斜面配制成濃度為1.0×107孢子/mL的孢子懸浮液，按4%（V/V）的比例接種至不同培養(yǎng)液中，恒溫振蕩（28 ℃、150 r/min）培養(yǎng)24 h制成種子液。

1.2.2 接種與發(fā)酵 將洗凈的聚氨酯海綿于電熱鼓風(fēng)干燥箱 100 ℃條件下烘干，用紙包好于 121 ℃高壓濕熱滅菌30 min，備用。按載體與種子液固液比1:10（M/V，每塊持液量為8 mL），將種子液倒入盛有無菌聚氨酯海綿載體（長10 cm×寬3 cm×高1 cm）的無菌淺盤中，用無菌玻璃涂布器均勻擠壓海綿，讓所有種子液被載體充分吸收。將接種后的聚氨酯海綿載體放入無菌發(fā)酵盤（長35 cm×寬25 cm×高10 cm）內(nèi)，于25 ℃發(fā)酵室內(nèi)恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵盤用透氣的Parafilm封口膜封口。

1.2.3 載體產(chǎn)孢量的測定 分別于培養(yǎng)的第3、4、5、6和7 d測定載體產(chǎn)孢量。每個處理隨機取3塊聚氨酯海綿載體，用一定量的0.15%吐溫-80（V/V）充分清洗載體至載體表面無明顯木霉培養(yǎng)物。用血球計數(shù)板計數(shù)并計算產(chǎn)孢量。

1.2.4 單因素試驗設(shè)計 碳源的篩選[24]：選取11種碳源，分兩批次進(jìn)行。第一批6種碳源：葡萄糖、蔗糖、甘露醇、果糖、可溶性淀粉、甘油，第二批5種碳源：麥芽糖、海藻糖、糖蜜、木糖、乳糖。所有碳源均以2.0%（M/V）的用量分別添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Ⅰ）中，設(shè)無添加碳源的培養(yǎng)基為對照，每處理3次重復(fù)。

氮源的篩選[25]：分別以酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、NH4NO3、NH4Cl和尿素為氮源，以0.25%（M/V）用量分別添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)基（Ⅱ）中，設(shè)無添加氮源的培養(yǎng)基為對照，每處理3次重復(fù)。

無機鹽的篩選：分別以 MgSO4·7H2O、Na2SO4、KCl、CaCl2、KH2PO4、NH4H2PO4、NaNO3和 KNO3為大量元素，以0.2%（M/V）用量分別添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅲ）中，設(shè)無添加無機鹽的培養(yǎng)液為對照，每處理3次重復(fù)。

對篩選出的碳源、氮源以及無機鹽進(jìn)行濃度優(yōu)化，選取基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅰ），分別添加濃度為1.0%、2.0%、3.0%、4.0%和5.0%（M/V）蔗糖和糖蜜；選取基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅱ），分別添加濃度為0.1%、0.2%、0.4%、0.8%和1.6%（M/V）的酵母粉；選擇基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅲ），分別添加濃度為0.05%、0.10%、0.20%、0.40%和0.80%（M/V）的KH2PO4，每處理3次重復(fù)。

1.2.5 不同微量元素對產(chǎn)孢的影響 選用 FeSO4·7H2O、CuSO4·5H2O、ZnSO4·7H2O、MnSO4·H2O、H3BO3和Na2MoO4·2H2O分別測定其對產(chǎn)孢的影響，以0.2%（M/V）的用量分別添加至基礎(chǔ)培養(yǎng)液（Ⅳ）中，設(shè)無添加微量元素的培養(yǎng)液為對照，每處理3次重復(fù)。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

運用Microsoft Excel-2016、IBM SPSS Statistics-22.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析（Duncan’ s法方差分析）。

2 結(jié)果與分析

2.1 碳源的篩選與優(yōu)化

2.1.1 碳源種類的選擇 第一批碳源篩選試驗結(jié)果表明，發(fā)酵第3 d時，供試的6種碳源中，可溶性淀粉的處理產(chǎn)孢量最高，達(dá)5.60×108孢子/g，與其他處理差異顯著；發(fā)酵第5 d時，蔗糖的處理產(chǎn)孢量最高，達(dá)10.79×108孢子/g，與其他處理差異顯著；發(fā)酵至7 d時，葡萄糖與蔗糖處理的產(chǎn)孢量均較高，分別達(dá)到10.93×108和10.43×108孢子/g，與其他處理產(chǎn)孢量差異顯著；可溶性淀粉處理的產(chǎn)孢量最低，僅為7.03×108孢子/g（表1）。

表1 不同碳源對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢的影響（第一批）Table 1 The influence of different carbon sources on the sporulation of Trichoderma by inert carrier (first batch)

第二批碳源篩選試驗結(jié)果表明，發(fā)酵第5～7 d時，麥芽糖與糖蜜是5種供試碳源中產(chǎn)孢量最高的處理；發(fā)酵第7 d時，產(chǎn)孢量分別達(dá)到18.51×108和16.90×108孢子/g，與其他處理的產(chǎn)孢量差異顯著（表2）。

表2 不同碳源對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢的影響（第二批）Table 2 The effect of different carbon sources on the sporulation of Trichoderma by inert carriers (second batch)

綜合產(chǎn)孢量（表1，2）和碳源成本等因素，選擇蔗糖（雙糖）、糖蜜（副產(chǎn)物）為進(jìn)一步試驗的供試碳源，繼續(xù)探究其不同濃度對菌株THGY-01在聚氨酯海綿載體發(fā)酵產(chǎn)孢的影響。

2.1.2 兩種碳源濃度的確定 不同濃度的蔗糖對木霉菌在聚氨酯海綿上產(chǎn)孢結(jié)果表明，發(fā)酵第7 d時，不同濃度處理組中2.0%（M/V）處理的產(chǎn)孢量最大，達(dá)到15.81×108孢子/g，高濃度的蔗糖反而不利于其產(chǎn)孢（表3）；不同濃度的糖蜜對產(chǎn)孢的影響試驗結(jié)果表明，高濃度的糖蜜有利于木霉菌的產(chǎn)孢，發(fā)酵第6 d時，5.0%（V/V）處理的產(chǎn)孢量最高，達(dá) 49.23×108孢子/g，與其他處理組差異顯著，是蔗糖處理最高產(chǎn)孢量的2.99倍（表4）。綜合2種碳源不同濃度的產(chǎn)孢量及成本等因素，確定糖蜜為菌株THGY-01在聚氨酯海綿載體發(fā)酵產(chǎn)孢的碳源，并繼續(xù)對其濃度進(jìn)行優(yōu)化。

表3 蔗糖濃度對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢的影響Table 3 The influence of sucrose concentration on the sporulation of Trichoderma by the inert carrier

表4 糖蜜濃度對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢的影響Table 4 The influence of molasses concentration on the sporulation of Trichoderma by the inert carrier

2.1.3 糖蜜濃度的選擇 對糖蜜的濃度進(jìn)行優(yōu)化試驗結(jié)果表明，發(fā)酵第5 d時，10.0%（V/V）處理的產(chǎn)孢量最高，達(dá)9.15×109孢子/g，與其他處理組差異顯著；發(fā)酵第8和10 d時，30.0%（V/V）處理的產(chǎn)孢量最高，產(chǎn)孢量達(dá)到18.86×109和16.78×109孢子/g，與其他處理組差異顯著；隨著糖蜜濃度的增加，產(chǎn)孢量變大，濃度達(dá)到 40.0%（V/V）時，產(chǎn)孢量變小，發(fā)酵周期也延長，因此選擇糖蜜的使用濃度為 30.0%（V/V）（圖1，表5）。

表5 糖蜜濃度對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢的影響Table 5 The influence of molasses concentration on the sporulation of Trichoderma by the inert carrier

圖1 木霉菌在不同濃度糖蜜處理聚氨酯海綿上的產(chǎn)孢情況Fig.1 Sporulation of Trichoderma on polyurethane sponge with different molasses concentration treatments

2.2 氮源的篩選與優(yōu)化

2.2.1 氮源種類的選擇 試驗結(jié)果（表6）表明，在發(fā)酵的第6、7 d時，酵母粉和牛肉浸膏處理的產(chǎn)孢量均較高，其中發(fā)酵7 d時產(chǎn)孢量分別達(dá)10.87×108和11.88×108孢子/g，與其他處理差異顯著；氮源為氯化銨和尿素處理的產(chǎn)孢量較低，其產(chǎn)孢量分別為3.02×108和1.60×108孢子/g。綜合產(chǎn)孢量、成本與使用方便性，選擇酵母粉為菌株THGY-01聚氨酯海綿載體發(fā)酵產(chǎn)孢的氮源，并繼續(xù)進(jìn)行濃度篩選試驗。

表6 不同氮源對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢的影響Table 6 The effect of different nitrogen sources on the spore production of Trichoderma by inert carrier

2.2.2 氮源濃度的篩選 不同濃度的酵母粉對產(chǎn)孢的影響試驗結(jié)果（表7）表明，發(fā)酵第6 d時，濃度為0.2%、0.4%、0.8%（M/V）處理的產(chǎn)孢量較高，產(chǎn)孢量分別達(dá)到11.98×108、14.16×108和11.65×108孢子/g，與其他處理差異顯著；發(fā)酵第7 d時，濃度為0.4%（M/V）處理的產(chǎn)孢量最高，達(dá)15.46×108孢子/g；1.6%（M/V）處理的產(chǎn)孢量最低，產(chǎn)孢量僅為0.63×108孢子/g。綜合考慮，確定酵母粉的添加量為0.4%（M/V）。

表7 酵母粉濃度對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢的影響Table 7 The effect of yeast concentration on sporulation of Trichoderma by inert carrier

2.3 無機鹽的篩選與優(yōu)化

2.3.1 無機鹽種類的選擇 不同無機鹽對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢影響的試驗結(jié)果（表 8）表明，在發(fā)酵的不同時間，KH2PO4處理的產(chǎn)孢量均高于其他處理；發(fā)酵第6 d時，產(chǎn)孢量達(dá)到21.03×108孢子/g，與其他處理的差異顯著；含鉀元素的3個處理的產(chǎn)孢量在發(fā)酵的3～7 d中產(chǎn)孢量均高于其他處理，其他不含鉀元素的5個處理的產(chǎn)孢量較低，與CK無顯著性差異。含鉀離子的無機鹽添加有利于木霉菌的生長與產(chǎn)孢。根據(jù)試驗結(jié)果，選擇KH2PO4為菌株THGY-01聚氨酯海綿載體發(fā)酵產(chǎn)孢的無機鹽，并繼續(xù)進(jìn)行濃度篩選試驗。

表8 不同無機鹽對木霉菌惰性載體產(chǎn)孢的影響Table 8 The effect of different inorganic salt on the spore production of Trichoderma by inert carrier

2.3.2 KH2PO4濃度的篩選 試驗結(jié)果表明，不同濃度KH2PO4的添加對木霉菌聚氨酯海綿產(chǎn)孢均有影響，添加一定濃度的KH2PO4有利于其產(chǎn)孢。發(fā)酵6 d時，濃度為0.20%（M/V）處理的產(chǎn)孢量最高，達(dá)23.09×108孢子/g，與其他處理差異顯著；0.80%（M/V）處理的產(chǎn)孢量最低，僅為 13.18×108孢子/g。因此，確定KH2PO4的添加濃度為0.2%（M/V）（表9）。

表9 不同KH2PO4濃度對木霉惰性載體產(chǎn)孢的影響Table 9 The influence of different KH2PO4 concentration on the sporulation of Trichoderma by inert carrier

2.4 微量元素對產(chǎn)孢的影響

微量元素對產(chǎn)孢影響的試驗結(jié)果表明，發(fā)酵6 d時，添加Cu、Zn和Mn元素處理的產(chǎn)孢量較高，分別達(dá)到9.83×108、11.87×108和12.06×108孢子/g，與CK差異顯著。向培養(yǎng)基中添加一定種類適當(dāng)濃度的Cu、Zn和Mn元素對木霉菌聚氨酯海綿載體發(fā)酵的產(chǎn)孢有促進(jìn)作用（圖2）。

3 討論

惰性載體固體發(fā)酵是在浸漬了少量液體培養(yǎng)基的惰性載體上培養(yǎng)微生物來完成發(fā)酵的過程[26]。惰性載體固體發(fā)酵避免了營養(yǎng)載體固體發(fā)酵板結(jié)和坍塌的缺陷，有利于供氧和維持較好的水動力學(xué)特性[15]。俞云峰等[27]研究表明與標(biāo)準(zhǔn)品麥麩營養(yǎng)載體固體發(fā)酵產(chǎn)生的孢子相比，惰性載體固體發(fā)酵產(chǎn)生的孢子致病力符合商品化孢子的要求。

聚氨酯海綿材料相對穩(wěn)定的孔隙和良好的毛細(xì)作用非常適宜水分的聚集和液膜的形成[28]，因此近年來被一些工業(yè)微生物學(xué)家們所關(guān)注。目前大多數(shù)研究是在聚氨酯海綿載體材料中加入一定量的液體培養(yǎng)基后進(jìn)行發(fā)酵，可為真菌發(fā)酵提供良好的生長和散熱途徑。試驗中通過掃描電子顯微鏡（SEM）觀察發(fā)現(xiàn)，發(fā)酵后聚氨酯海綿的物理結(jié)構(gòu)未發(fā)生明顯變化，載體中的菌體生長良好，表明聚氨酯海綿是生防菌發(fā)酵中非常實用的一種載體。雖然有學(xué)者曾經(jīng)提出，惰性載體吸附液體培養(yǎng)基也有可能在載體內(nèi)部形成微小的液態(tài)環(huán)境，在其內(nèi)部生長的菌體有可能會以液態(tài)發(fā)酵的方式生長，從而產(chǎn)生活力、萌發(fā)能力均不理想的芽生孢子，但俞云峰等[27]通過掃描電鏡直觀地找出相應(yīng)的證據(jù)，證明微小液態(tài)發(fā)酵的可能性不存在。前期研究發(fā)現(xiàn)，棘孢木霉菌在浸有液體培養(yǎng)基的聚氨酯海綿惰性載體上生長良好并能產(chǎn)孢，由于培養(yǎng)基的配比與組成是發(fā)酵工藝中最重要的基礎(chǔ)性工作[29]，人們很重視對發(fā)酵中的碳源、氮源及大量和微量元素的篩選。

在惰性載體固體發(fā)酵的研究中，人們通常使用容易被微生物利用的葡萄糖、蔗糖等碳源。吳娜等[30]研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖和葡萄糖有利于棘孢木霉在平板中的生長與產(chǎn)孢。工業(yè)發(fā)酵中若利用葡萄糖與蔗糖，則碳源的成本約占生防孢子劑總成本的一半[29]。糖蜜是產(chǎn)糖工業(yè)的副產(chǎn)物，含糖量高、價格便宜，可以作為良好的碳源，其主要成分除糖類外，還含有其他微量元素與生長因子[31]。研究發(fā)現(xiàn)，糖蜜是木霉菌株THGY-01聚氨酯海綿載體固體發(fā)酵中產(chǎn)孢較好的碳源，且添加量越多越有利于產(chǎn)孢，但發(fā)酵周期也越長。發(fā)酵第8 d時，30.0%（V/V）處理的產(chǎn)孢量可達(dá)18.86×109孢子/g。

氮源常分為無機氮源和有機氮源[32]。有機氮源含有豐富的氨基酸、維生素及生長因子等營養(yǎng)物質(zhì)，包括蛋白胨、玉米漿和各種有機粉餅等物質(zhì)，倍受人們重視。無機氮源是微生物生長的速效氮源[33]，包括各種銨鹽、硝酸鹽和氨水等[34]。本研究選用酵母粉、蛋白胨、牛肉浸膏、NH4NO3、NH4Cl、尿素為氮源進(jìn)行試驗，篩選出酵母粉為最佳的產(chǎn)孢氮源，最適濃度為0.4%（M/V）。酵母粉與牛肉浸膏是利于菌體吸收、促進(jìn)菌體生長且為較常見的有機氮源，但相比之下，酵母粉的價格更便宜，來源更方便，故選擇酵母粉為菌株THGY-01在聚氨酯海綿上固體發(fā)酵的氮源。

本研究發(fā)現(xiàn)添加質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2%（M/V）的KH2PO4可顯著提高孢子產(chǎn)量。但董海燕等[35]以米糠、麩皮為主要培養(yǎng)基的棘孢木霉固體發(fā)酵中研究表明，鉀離子對棘孢木霉的產(chǎn)孢有明顯的抑制作用。其可能是因為發(fā)酵模式與主要營養(yǎng)物質(zhì)不同時，木霉對大量元素的需求不一樣，具體原因還有待于進(jìn)一步研究。