邢逸，竇一鳴，王敏，徐海楠，楊強(qiáng)，孫遜，趙艷紅△

顳下頜關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎（temporomandibular joint osteoarthritis，TMJ-OA）是臨床中常見的頜面部關(guān)節(jié)疾病，發(fā)病率高。顳下頜關(guān)節(jié)軟骨無血管，無神經(jīng)，骨關(guān)節(jié)炎所致軟骨缺損難以自我修復(fù)［1］，亟需更有效的治療手段來解決這一臨床難題。骨軟骨組織工程技術(shù)的發(fā)展為TMJ-OA提供了新的治療策略。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）已廣泛應(yīng)用于骨軟骨組織工程領(lǐng)域［2］。已有研究證明間充質(zhì)干細(xì)胞（MSCs）的治療作用主要通過旁分泌外泌體（exosomes，Exo）實現(xiàn)［3］。Exo是細(xì)胞分泌到胞外的直徑為40～160 nm的雙層脂質(zhì)囊泡，可將蛋白質(zhì)、微小RNA（miRNA）等運(yùn)輸?shù)桨屑?xì)胞，實現(xiàn)細(xì)胞間通訊［4］。由于Exo較細(xì)胞療法具有更低的免疫原性，已作為細(xì)胞治療的替代療法應(yīng)用在多種疾病的研究中。巨噬細(xì)胞（Mφ）是滑膜組織中參與骨關(guān)節(jié)炎（OA）炎癥和組織損傷修復(fù)過程的主要免疫細(xì)胞［5］，可分為經(jīng)典激活M1 巨噬細(xì)胞（M1Mφ）和交替激活M2 巨噬細(xì)胞（M2Mφ）。M1Mφ釋放炎性因子促進(jìn)炎癥微環(huán)境發(fā)展，M2Mφ 則產(chǎn)生抗炎因子抑制炎癥發(fā)展［6］。M1Mφ/M2Mφ 比例的不同導(dǎo)致了炎癥微環(huán)境中促炎/抗炎的平衡改變［7］。因而，M1Mφ和M2Mφ在TMJ-OA的發(fā)展過程中起到了關(guān)鍵作用，為TMJ-OA的防治提供了新的研究方向。轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β1是一種軟骨形成誘導(dǎo)因子，可調(diào)控軟骨細(xì)胞增殖及軟骨細(xì)胞外基質(zhì)的合成代謝，在OA的發(fā)病機(jī)制中起重要作用。相關(guān)研究已證實，抑制軟骨中的TGF-β1 信號傳導(dǎo)可導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨退化［8］。因此，TGF-β1是維持軟骨完整性的重要靶點。本研究收集BMSCs 來源的Exo（BMSCs-Exo），旨在探討B(tài)MSCs-Exo 在炎癥微環(huán)境中對Mφ極化及促骨修復(fù)的調(diào)控作用，為治療TMJ-OA 提供具有潛在臨床應(yīng)用價值的方向與方法。

1 材料與方法

1.1 主要材料 BMSCs、小鼠單核巨噬細(xì)胞白血病細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞系、原代軟骨細(xì)胞購自武漢普諾賽生物公司；DMEM 培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素雙抗、胎牛血清（FBS）、0.25%胰蛋白酶購自Gibco公司；ALG2相互作用蛋白X（Alix）抗體、腫瘤易感基因101蛋白（TSG101）抗體、一氧化氮合酶（iNOS）抗體、精氨酸酶-1（Arg-1）抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-13抗體購自Abcam公司；β-actin抗體、Ⅱ型膠原（COLⅡ）抗體、TGF-β1 抗體購自 Bioss 公司；白細(xì)胞介素（IL）-1β 購自Preprotech公司，干擾素（IFN）-γ購自R&D公司；RNA提取試劑盒購自福際生物公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自Takara 公司；qPCR SYBR?Green Master 試劑盒購自 Yeasen 公司；CCK-8試劑盒購自Biosharp 公司；GAPDH、iNOS、Arg-1、IL-1β、IL-6、COL2a1、TGF-β1 引物購自北京擎科生物科技有限公司；IL-1β、IL-6 酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）試劑盒購自索萊寶公司。

1.2 研究方法

1.2.1 BMSCs、RAW264.7、原代軟骨細(xì)胞培養(yǎng) 將BMSCs、RAW264.7、原代軟骨細(xì)胞以4.0×104個/mL 的密度接種于培養(yǎng)瓶中，加入適量含有10%FBS和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM 完全培養(yǎng)基，置于5%CO2，飽和濕度的37 ℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。細(xì)胞融合度為80%～90%時，0.25%胰蛋白酶消化2～3 min，使用完全培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min 離心5 min，以 1∶3 的比例傳代。取 P2-P9 的 BMSCs、P2-P5 的原代軟骨細(xì)胞及對數(shù)生長期的RAW264.7用于后續(xù)實驗。

1.2.2 BMSCs-Exo 的提取及觀察 BMSCs 傳代后細(xì)胞培養(yǎng)過夜，更換為不含外泌體血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，置于-80 ℃保存。將收集的上清液通過以下差速離心步驟收集BMSCs-Exo：300 ×g，10 min；2 000 ×g，10 min；10 000 ×g，30 min；120 000 ×g，90 min。超速離心后，棄去上清液，沉淀即主要為BMSCs-Exo，用1 mL PBS 重懸，0.22μm濾膜過濾，-80 ℃保存。將20μL BMSCs-Exo 懸液滴加在銅網(wǎng)上，室溫1 min后滴加20μL磷鎢酸溶液，1 min后吸去磷鎢酸溶液，紅外燈下烘烤10 min，吸去多余液體，透射電鏡（TEM）下觀察Exo結(jié)構(gòu)。

1.2.3 BMSCs-Exo促巨噬細(xì)胞、軟骨細(xì)胞增殖能力檢測 將RAW264.7 以 2×103個/孔的密度接種于 96 孔板中，實驗分為對照組（0 mg/L Exo）、10 mg/L Exo組、50 mg/L Exo組。將軟骨細(xì)胞以2×103個/孔的密度接種于96 孔板中，實驗分為對照組、模型組（10 mg/L IL-1β 組）、治療組（IL-1β+10 mg/L Exo組、IL-1β+50 mg/L Exo 組）。細(xì)胞培養(yǎng)24 h 后分別在各組孔中加入100μL 含不同劑量BMSCs-Exo 的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24、48 h。在相應(yīng)的時間點，每孔加入10μL CCK-8 反應(yīng)液，置于37 ℃培養(yǎng)箱中反應(yīng)2 h后，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm處的光密度（OD）值，每組均重復(fù)4次。

1.2.4 BMSCs-Exo 對巨噬細(xì)胞極化表型的影響及對炎癥的調(diào)控 實驗分組同1.2.3。將RAW264.7 以1×104個/孔的密度接種于6 孔板中，細(xì)胞貼壁后，使用20 μg/L 的IFN-γ 刺激RAW264.7 細(xì)胞24 h，使其極化為M1Mφ 后，棄去培養(yǎng)基，分別更換為含0、10、50 mg/L BMSCs-Exo 的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h 后收集蛋白樣本及總RNA 樣本，以用于后續(xù)實驗。

1.2.5 BMSCs-Exo 對炎癥軟骨細(xì)胞的調(diào)控作用 實驗分組同1.2.3。將原代軟骨細(xì)胞以1×104個/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，使用10μg/L 的IL-1β刺激模型組和治療組24 h；棄去培養(yǎng)基，在對照組和模型組中加入不含BMSCs-Exo的完全培養(yǎng)基，在治療組中分別加入含10 mg/L 和50 mg/L BMSCs-Exo的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集蛋白樣本及總RNA樣本，以用于后續(xù)實驗。

1.2.6 實時熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）檢測巨噬細(xì)胞極化表型、炎性因子表達(dá)及軟骨細(xì)胞表型 使用RNA提取試劑盒提取總RNA，Nanodrop 檢測所提RNA 濃度及純度。按照試劑盒說明加入反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄及合成cDNA，-20 ℃保存。按照2×qPCR SYBR?Green Master的試劑盒說明配制反應(yīng)體系，并上機(jī)檢測。反應(yīng)體系為：qPCR SYBR Green Master Mix 10μL，上、下游引物（10μmol/L）各0.4μL，cDNA 2μL，ddH2O 7.2 μL。反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s，56 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，共50 個循環(huán)；熔解曲線 95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 1 s。每組均重復(fù) 3 次。以GAPDH為內(nèi)參基因，使用2-ΔΔCt法測定mRNA相對表達(dá)水平。相關(guān)基因引物序列見表1。

Tab.1 qRT-PCR primer sequence information表1 qRT-PCR引物序列信息

1.2.7 Western blot 檢測巨噬細(xì)胞極化表型及軟骨細(xì)胞表型 在蛋白樣本中加入含有PMSF 和磷酸酶抑制劑的RIPA裂解液，置于冰上裂解 1 h，4 ℃ 12 000 r/min 離心20 min，取上清液，并用BCA試劑盒進(jìn)行蛋白定量。在上清液中加入適量5×SDS 蛋白上樣緩沖液，95 ℃金屬浴煮沸蛋白10 min。配制PAGE 凝膠，在濃縮膠中上樣蛋白30 μg，80 V 電壓30 min，120 V電壓60 min進(jìn)行蛋白電泳，待溴酚藍(lán)跑出分離膠底部即可停止電泳。將PAGE 凝膠轉(zhuǎn)移到PVDF 膜中，轉(zhuǎn)膜220 mA 90 min。5%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后，按蛋白marker 裁剪 PVDF 膜條帶，在 Alix、TSG101、iNOS、Arg-1、MMP-13、β-actin、COLⅡ、TGF-β1 一抗中 4 ℃孵育過夜。TBST洗膜10 min 3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育1 h，TBST再次洗膜10 min 3次。加入ECL發(fā)光液，于化學(xué)發(fā)光顯影系統(tǒng)中觀察。

1.2.8 ELISA 檢測巨噬細(xì)胞炎性因子蛋白表達(dá)水平 實驗分組同1.2.3。將RAW264.7以1×104個/孔的密度接種于6孔板中，細(xì)胞貼壁后，使用20 μg/L 的IFN-γ 刺激RAW264.7 細(xì)胞24 h，使其極化為M1Mφ后，棄去培養(yǎng)基，分別更換為含0、10、50 mg/L BMSCs-Exo的完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞培養(yǎng)上清液，1 000 r/min 離心 10 min，取上清液，-80 ℃保存。配制蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品分別加入IL-1β及IL-6 抗體預(yù)包被酶標(biāo)板反應(yīng)孔中，37 ℃培養(yǎng)箱中孵育90 min，洗板4 次；加入生物素化抗體工作液至反應(yīng)孔中，孵育60 min后洗板4次；加入酶結(jié)合物工作液至反應(yīng)孔中，孵育30 min后洗板4次；加入顯色液至反應(yīng)孔中，避光孵育30 min后加入終止液，酶標(biāo)儀檢測各孔450 nm 處的OD 值，計算出細(xì)胞上清中的IL-1β 及IL-6 蛋白表達(dá)水平。每組均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0 軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，2組間均數(shù)比較采用獨立樣本t檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），組間多重比較時方差齊行LSD-t法，方差不齊行Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMSCs-Exo 的提取與表征 透射電鏡觀察到BMSCs-Exo 為圓形囊泡，呈杯狀，為雙層膜結(jié)構(gòu)，粒徑大小約為100 nm，與外泌體結(jié)構(gòu)一致（圖1A）。Western blot 結(jié)果示，該囊泡表達(dá)外泌體特征蛋白Alix、TSG101，進(jìn)一步證明收集到的囊泡為BMSCs-Exo（圖1B）。

Fig.1 Identification of BMSCs-Exo圖1 BMSCs-Exo的鑒定

2.2 BMSCs-Exo 對巨噬細(xì)胞及軟骨細(xì)胞增殖的影響 與24 h 相比，巨噬細(xì)胞培養(yǎng)48 h 后細(xì)胞數(shù)目增加，且50 mg/L Exo 組細(xì)胞數(shù)目最多，見表2。模型組中的IL-1β 明顯抑制了軟骨細(xì)胞的增殖，而加入50 mg/L Exo處理后，IL-1β的抑制作用減輕，細(xì)胞增殖較模型組明顯，見表3。以上結(jié)果證明BMSCs-Exo具有良好的生物相容性，能促進(jìn)細(xì)胞增殖。

Tab.2 Comparison of the proliferation promoting effects of BMSC-Exos on macrophages for 24 h and 48 h表2 BMSC-Exos對巨噬細(xì)胞作用24 h和48 h的促增殖效果比較 （n=4，OD值，）

Tab.2 Comparison of the proliferation promoting effects of BMSC-Exos on macrophages for 24 h and 48 h表2 BMSC-Exos對巨噬細(xì)胞作用24 h和48 h的促增殖效果比較 （n=4，OD值，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與 10 mg/L Exo 組比較，P＜0.05。

組別對照組10 mg/L Exo組50 mg/L Exo組F 24 h 1.15±0.13 1.21±0.09 1.58±0.07ab 21.660＊＊1.40±0.06 1.42±0.08 2.77±0.10ab 385.945＊＊48 h t 3.528＊3.684＊19.358＊＊

Tab.3 Comparison of the proliferation promoting effects of BMSC-Exos on chondrocytes for 24 h and 48 h表3 BMSC-Exos對軟骨細(xì)胞作用24 h和48 h的促增殖效果比較 （n=4，OD值，）

Tab.3 Comparison of the proliferation promoting effects of BMSC-Exos on chondrocytes for 24 h and 48 h表3 BMSC-Exos對軟骨細(xì)胞作用24 h和48 h的促增殖效果比較 （n=4，OD值，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與IL-1β+10 mg/L Exo組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組IL-1β+10 mg/L Exo組IL-1β+50 mg/L Exo組F 24 h 1.63±0.07 0.30±0.04a 0.49±0.07ab 1.42±0.06abc 504.518＊＊48 h 3.01±0.12 0.40±0.15a 0.52±0.11a 1.77±0.16abc 324.883＊＊t 20.173＊＊1.306 0.494 3.958＊＊

2.3 BMSCs-Exo 對巨噬細(xì)胞形態(tài)的影響 未對巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)時，細(xì)胞形態(tài)較圓，生長狀態(tài)良好，呈團(tuán)狀聚集（圖2A）。使用20μg/L IFN-γ 刺激24 h后，iNOS 表達(dá)水平升高，Arg-1 表達(dá)水平降低，證明巨噬細(xì)胞細(xì)胞極化為M1Mφ，見表4，且細(xì)胞呈不規(guī)則形態(tài)，可見偽足（圖2B）。Mφ在極化為M1Mφ后，使用不同劑量的BMSCs-Exo 對M1型巨噬細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)。BMSCs-Exo 為10 mg/L 時，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，細(xì)胞變圓，但仍可見部分有偽足細(xì)胞（圖2C）；50 mg/L時，基本無分化細(xì)胞，細(xì)胞形態(tài)較圓，細(xì)胞密集（圖2D）。

Fig.2 Macrophage cell morphology of different treatment groups(Scale bar represents 100μm)圖2 不同處理組巨噬細(xì)胞形態(tài)（標(biāo)尺=100μm）

Tab.4 Comparison of mRNA levels of M1/M2 macrophage-related markers after IFN-γ stimulation表4 IFN-γ刺激后M1/M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的mRNA水平比較 （n=3，）

Tab.4 Comparison of mRNA levels of M1/M2 macrophage-related markers after IFN-γ stimulation表4 IFN-γ刺激后M1/M2巨噬細(xì)胞相關(guān)標(biāo)志物的mRNA水平比較 （n=3，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01。

組別對照組20μg/L IFN-γ組t mRNA水平iNOS 1.02±0.09 2.48±0.74 3.368＊Arg-1 1.00±0.09 0.27±0.05 11.778＊＊

2.4 BMSCs-Exo 對巨噬細(xì)胞表型極化的調(diào)控作用 與對照組相比，10 mg/L 和50 mg/L BMSCs-Exo處理組的M1表型相關(guān)蛋白iNOS的表達(dá)降低；而M2表型相關(guān)蛋白Arg-1 表達(dá)增多，50 mg/L Exo 組的Arg-1表達(dá)量顯著增多，見圖3、表5。mRNA 檢測結(jié)果顯示，與對照組相比，BMSCs-Exo 的處理可降低M1表型相關(guān)基因iNOS的表達(dá)，升高M(jìn)2表型相關(guān)基因Arg-1 的表達(dá)水平，與Western blot 的結(jié)果趨勢一致，見表5。BMSCs-Exo 具有調(diào)控巨噬細(xì)胞表型極化的作用，可促M1向M2表型極化。

Fig.3 Macrophage phenotypic polarization圖3 巨噬細(xì)胞表型極化

Tab.5 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on expression levels of phenotypeassociated markers in M1/M2 macrophages表5 不同劑量BMSCs-Exo對M1/M2巨噬細(xì)胞表型相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平的調(diào)控作用比較（n=3，）

Tab.5 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on expression levels of phenotypeassociated markers in M1/M2 macrophages表5 不同劑量BMSCs-Exo對M1/M2巨噬細(xì)胞表型相關(guān)標(biāo)志物表達(dá)水平的調(diào)控作用比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與10 mg/L Exo組比較，P＜0.05。

組別對照組10 mg/L Exo組50 mg/L Exo組F mRNA水平Arg-1 1.03±0.29 1.24±0.28 3.24±0.35ab 46.755＊＊iNOS 1.00±0.12 0.46±0.02a 0.26±0.03ab 87.323＊＊蛋白水平Arg-1 0.18±0.02 0.30±0.04a 0.88±0.04ab 382.243＊＊iNOS 1.05±0.08 0.54±0.03a 0.47±0.07a 75.789＊＊

2.5 BMSCs-Exo 對炎性因子表達(dá)的調(diào)控 與對照組相比，BMSCs-Exo 處理組的炎性因子IL-1β、IL-6的 mRNA 表達(dá)水平顯著降低（P＜0.05），見表 6。ELISA檢測結(jié)果顯示，對照組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中IL-1β 及 IL-6 的蛋白表達(dá)水平較高，50 mg/L BMSCs-Exo 處理可降低IL-1β及IL-6的蛋白表達(dá)水平（P＜0.05），見表7。

Tab.6 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the mRNA expression levels of inflammatory factors in macrophages表6 不同劑量BMSCs-Exo對巨噬細(xì)胞炎性因子mRNA水平的調(diào)控作用比較 （n=3，）

Tab.6 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the mRNA expression levels of inflammatory factors in macrophages表6 不同劑量BMSCs-Exo對巨噬細(xì)胞炎性因子mRNA水平的調(diào)控作用比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，P＜0.05。

組別對照組10 mg/L Exo組50 mg/L Exo組F IL-1β 1.00±0.07 0.31±0.02a 0.22±0.04a 231.825＊＊IL-6 1.00±0.04 0.45±0.10a 0.35±0.09a 60.248＊＊

Tab.7 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the expression levels of inflammatory factor proteins in macrophages表7 不同劑量BMSCs-Exo對巨噬細(xì)胞炎性因子蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用比較 （n=3，ng/L，）

Tab.7 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the expression levels of inflammatory factor proteins in macrophages表7 不同劑量BMSCs-Exo對巨噬細(xì)胞炎性因子蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用比較 （n=3，ng/L，）

＊P＜0.05，＊＊P＜0.01；a 與對照組比較，b 與 10 mg/L Exo 組比較，P＜0.05。

組別對照組10 mg/L Exo組50 mg/L Exo組F IL-1β 27.81±8.84 26.88±6.80 12.11±3.27ab 5.169＊IL-6 7.25±1.25 2.03±1.05a 3.04±1.40a 14.877＊＊

2.6 BMSCs-Exo 對炎癥軟骨細(xì)胞的調(diào)控 與模型組相比，BMSCs-Exo 處理組的軟骨細(xì)胞成軟骨相關(guān)蛋白COLⅡ及TGF-β1 表達(dá)明顯升高，而MMP-13表達(dá)顯著降低，見圖4、表8。mRNA 水平結(jié)果顯示，IL-1β 刺激抑制了COL2a1、TGF-β1 的mRNA 表達(dá)，并升高M(jìn)MP-13 mRNA 的表達(dá)水平，而50 mg/L BMSCs-Exo 處理組的 COL2a1、TGF-β1 的 mRNA 表達(dá)水平則顯著高于模型組，見表9。

Fig.4 Expression levels of chondrogenesis-related proteins圖4 成軟骨相關(guān)蛋白的表達(dá)水平

Tab.8 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the expression levels of chondrogenic-related proteins in chondrocytes表8 不同劑量BMSCs-Exo對軟骨細(xì)胞成軟骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用比較 （n=3，）

Tab.8 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the expression levels of chondrogenic-related proteins in chondrocytes表8 不同劑量BMSCs-Exo對軟骨細(xì)胞成軟骨相關(guān)蛋白表達(dá)水平的調(diào)控作用比較 （n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與IL-1β+10 mg/L Exo組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組IL-1β+10 mg/L Exo組IL-1β+50 mg/L Exo組F COLⅡ0.54±0.02 0.31±0.01a 0.75±0.02ab 0.90±0.05ab 245.833＊＊TGF-β1 0.97±0.04 0.40±0.02a 0.60±0.03ab 0.76±0.04abc 138.065＊＊MMP-13 0.16±0.01 0.43±0.02a 0.18±0.01b 0.16±0.01b 379.851＊＊

Tab.9 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the mRNA expression levels of chondrogenesis-related genes in chondrocytes表9 不同劑量BMSCs-Exo對軟骨細(xì)胞成軟骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的調(diào)控作用比較（n=3，）

Tab.9 Comparison of the regulatory effects of different doses of BMSCs-Exo on the mRNA expression levels of chondrogenesis-related genes in chondrocytes表9 不同劑量BMSCs-Exo對軟骨細(xì)胞成軟骨相關(guān)基因mRNA表達(dá)水平的調(diào)控作用比較（n=3，）

＊＊P＜0.01；a與對照組比較，b與模型組比較，c與IL-1β+10 mg/L Exo組比較，P＜0.05。

組別對照組模型組IL-1β+10 mg/L Exo組IL-1β+50 mg/L Exo組F COL2a1 1.00±0.11 0.62±0.01 1.40±0.10ab 2.15±0.30ab 45.791＊＊TGF-β1 1.00±0.08 0.25±0.04a 0.53±0.05ab 2.11±0.31bc 74.902＊＊MMP-13 1.00±0.02 8.24±0.15a 6.90±0.46a 3.11±0.24abc 456.037＊＊

3 討論

3.1 治療TMJ-OA 的骨軟骨組織工程策略 TMJOA 病理機(jī)制復(fù)雜，涉及軟骨退變、滑膜炎癥等［9］?，F(xiàn)階段TMJ-OA的治療方法主要分為保守治療與手術(shù)治療，但均存在局限性。保守治療僅能緩解局部癥狀，手術(shù)治療具有免疫排斥等風(fēng)險［10］。因此，開發(fā)新的治療手段是目前TMJ-OA 領(lǐng)域亟需解決的難題。

組織工程是一種以實現(xiàn)受損組織結(jié)構(gòu)和功能再生的新興治療技術(shù)，其中，MSCs 是研究較為深入的組織工程種子細(xì)胞［11］。盡管干細(xì)胞療法在再生醫(yī)學(xué)中具有良好的前景，但目前干細(xì)胞的臨床應(yīng)用仍存有爭議［12］。BMSCs-Exo 具有與 BMSCs 相似的功能特性，與干細(xì)胞療法相比，Exo避免了干細(xì)胞應(yīng)用中的倫理及腫瘤發(fā)生等問題，更易對靶細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控，被認(rèn)為是干細(xì)胞療法的替代［13］。MSCs 衍生的Exo可通過調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、刺激細(xì)胞增殖等發(fā)揮治療作用［14］?；诖耍狙芯刻崛×薆MSCs-Exo，通過體外實驗探索了其對Mφ表型極化的影響及在炎癥微環(huán)境中發(fā)揮的免疫調(diào)控作用；結(jié)果顯示，所收集的囊泡具有雙層膜結(jié)構(gòu)，表達(dá)外泌體特征性表面蛋白，并且BMSCs-Exo 具有良好的生物相容性，可促進(jìn)巨噬細(xì)胞及軟骨細(xì)胞增殖。

3.2 BMSCs-Exo可極化Mφ表型及維持軟骨細(xì)胞表型 Mφ 是骨關(guān)節(jié)滑膜液中主要的免疫細(xì)胞，在TMJ-OA 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的作用［15］。Mφ易受微環(huán)境刺激，M1Mφ 可釋放高水平的促炎因子IL-1β、IL-6等，促進(jìn)炎癥的發(fā)生發(fā)展；M2Mφ可產(chǎn)生抗炎因子IL-1α、Arg-1 等，緩解炎癥反應(yīng)并促進(jìn)組織修復(fù)再生［6］。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)巨噬細(xì)胞極化為M1Mφ，經(jīng)BMSCs-Exo 處理后，M1Mφ 中高表達(dá)的iNOS 表達(dá)水平降低，50 mg/L BMSCs-Exo 與 10 mg/L BMSCs-Exo 相比，可更明顯下調(diào)iNOS 的表達(dá)，并顯著上調(diào)M2Mφ相關(guān)蛋白Arg-1的表達(dá)水平。

M1Mφ 和M2Mφ 之間的平衡與TMJ-OA 的嚴(yán)重程度相關(guān)［7］。在OA 患者的滑膜液中可檢測到高水平促炎因子和大量的M1Mφ。已有研究證明，通過改變 M1Mφ/M2Mφ 比例可有效緩解炎癥反應(yīng)［16］。Kim等［17］發(fā)現(xiàn)，M2Mφ衍生的外泌體可以將M1Mφ重編程為M2Mφ，達(dá)到抗炎及促進(jìn)皮膚傷口愈合的目的。Zheng 等［18］報道了原代軟骨細(xì)胞衍生的外泌體可以增加M2Mφ 的浸潤，減少M1Mφ 的數(shù)量，抑制OA 的發(fā)展。本研究中，50 mg/L BMSCs-Exo 能顯著誘導(dǎo) M1Mφ 高表達(dá)M2Mφ 表型相關(guān)基因，BMSCs-Exo具有調(diào)控M1Mφ向M2Mφ極化的能力，與上述報道一致。

TGF-β1可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖、Ⅱ型膠原聚集和蛋白聚糖的分泌［19］，并導(dǎo)致Smad2磷酸化，進(jìn)而上調(diào)軟骨標(biāo)志物Col2a1、Sox9、Acan表達(dá)水平以促進(jìn)軟骨生成［20］。本研究中也發(fā)現(xiàn)了BMSCs-Exo 在炎癥軟骨細(xì)胞中具有一致的效果，進(jìn)一步證實了BMSCs-Exo 在炎癥微環(huán)境中可促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖，維持軟骨細(xì)胞表型，具有促進(jìn)軟骨修復(fù)的作用。筆者通過觀察BMSCs-Exo 對炎癥軟骨細(xì)胞的調(diào)控發(fā)現(xiàn)，BMSCs-Exo 處理能減少IL-1β 對TGF-β1 的抑制作用，降低MMP-13 表達(dá)，升高COL2a1 表達(dá)水平。本研究證明了在炎癥的免疫調(diào)節(jié)過程中，Mφ極化與炎性因子表達(dá)有關(guān)，BMSCs-Exo處理后的M1Mφ中，極化表型可發(fā)生改變，IL-1β 和 IL-6 的 mRNA 表達(dá)水平下調(diào)，有助于降低炎癥微環(huán)境中的炎性因子水平，同時可促進(jìn)炎癥微環(huán)境中的軟骨修復(fù)。

綜上所述，BMSCs-Exo 可通過調(diào)控Mφ 的表型極化，降低炎性因子表達(dá)水平，同時促進(jìn)炎癥微環(huán)境中的軟骨修復(fù)，為探索BMSCs-Exo 緩解TMJ-OA 和參與組織再生的機(jī)制提供了新的思路與方向。BMSCs-Exo對TMJ-OA的作用及其更深入的機(jī)制還有待于更進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)。