李淑楠 ，金慧 ，倪開(kāi)嶺 ，于洋 ，李正 ，王娜

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617；2.牡丹江友搏藥業(yè)有限責(zé)任公司，牡丹江 157000）

地龍和水蛭中因含有抗凝活性的化學(xué)物質(zhì)而廣泛用于預(yù)防高危性心血管疾病和治療多種栓塞及血栓[1-2]。在相關(guān)中成藥的生產(chǎn)過(guò)程中，往往是通過(guò)溶劑提取法、酶解法等技術(shù)對(duì)地龍和水蛭的活性物質(zhì)進(jìn)行提取[3]，再加工成不同劑型。這些方法普遍存在提取率低的問(wèn)題[4]，使得地龍和水蛭的藥渣中尚含有未被充分提取的活性物質(zhì)、大量粗蛋白、少量粗多糖等營(yíng)養(yǎng)成分，以及多種氨基酸和微量元素等[5]。在實(shí)際生產(chǎn)過(guò)程中，對(duì)地龍和水蛭藥渣的處理主要采取直接填埋或堆肥的方法。這不僅會(huì)造成資源浪費(fèi)，還會(huì)因動(dòng)物藥渣的腐敗而影響環(huán)境[6]。采用適當(dāng)方法，對(duì)地龍和水蛭藥渣進(jìn)行再次開(kāi)發(fā)，不僅可以實(shí)現(xiàn)資源的充分利用，還能降低藥渣對(duì)環(huán)境的影響，提高藥廠的經(jīng)濟(jì)效益，具有重要的研究?jī)r(jià)值。

1 儀器與材料

1.1 儀器 CP1003電子天平、AB135-S電子天平、AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；FE20實(shí)驗(yàn)室pH計(jì)（梅特勒-托利多儀器有限公司）；ZWF-200恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）；CL-2型恒溫加熱磁力攪拌器、DF-101S集熱式恒溫磁力攪拌器（鞏義予華儀器有限責(zé)任公司）；DK-98-II電熱恒溫水浴鍋（天津市泰斯特儀器有限公司）；ZRD-7080全自動(dòng)新型鼓風(fēng)干燥箱（上海智城分析儀器制造有限公司）；LD-4臺(tái)式離心機(jī)（常州天瑞儀器有限公司）；移液槍（德國(guó)艾本德股份有限公司）；DZF-6021真空干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 材料 經(jīng)粉碎的水蛭地龍混合藥渣（某中藥廠提供）；0.9%氯化鈉溶液（河北應(yīng)天成藥業(yè)股份有限公司）；酸性蛋白酶（泰安信得利生物工程有限公司）；風(fēng)味酶、中性蛋白酶購(gòu)于襄陽(yáng)新葉生物科技有限公司；堿性蛋白酶（24萬(wàn)U/g 50 g）、木瓜蛋白酶（60萬(wàn)U/g 20 g）、復(fù)配蛋白酶購(gòu)于南寧東恒華道生物科技有限責(zé)任公司；胃蛋白酶（1∶3000）、胰蛋白酶（1∶250）、凝血酶（1 000 units/0.85 mg solid）購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司；纖維蛋白原、凝血酶購(gòu)于索萊寶生物科技有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液、瓊脂粉購(gòu)于天津索羅門(mén)生物科技有限公司）；其他試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 酶解水蛭地龍混合藥渣 本實(shí)驗(yàn)采用胃蛋白酶、酸性蛋白酶、風(fēng)味酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、復(fù)配蛋白酶、胰蛋白酶、堿性蛋白酶解水蛭地龍混合藥渣，分別在廠家給出的最佳工藝條件下進(jìn)行。

2.1.1 樣品制備方法 稱取5 g藥渣，加入不同種類蛋白酶，于70 mL生理鹽水中混合均勻，在恒溫振蕩培養(yǎng)器中進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)條件見(jiàn)表1。其中，酶底比為反應(yīng)過(guò)程中酶的質(zhì)量用量與藥渣的質(zhì)量之比。待反應(yīng)結(jié)束，離心，取上清液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 酶種類篩選實(shí)驗(yàn)條件Tab.1 Experimental conditions for screening enzyme species

對(duì)每種酶設(shè)置藥渣對(duì)照組（藥渣+生理鹽水）及酶對(duì)照組（酶+生理鹽水），反應(yīng)條件分別與樣品組保持一致。設(shè)置藥渣對(duì)照組以消除藥渣自身含有的抗凝活性成分對(duì)酶解效果的影響，設(shè)置蛋白酶對(duì)照組以消除蛋白酶對(duì)抗凝活性測(cè)試的影響。

2.2 水解產(chǎn)物體外抗凝活性對(duì)比

2.2.1 凝血酶滴定法 0.5%纖維蛋白原溶液的配制：精密稱取0.015 g纖維蛋白原，加入3 mL PBS緩沖液，37℃水浴溶解?，F(xiàn)用現(xiàn)配。

凝血酶溶液的配制：以PBS緩沖液為溶劑，將1 000 U/0.85 mg凝血酶溶解并定容至100 mL，配制成濃度為10 U/mL凝血酶溶液。4℃冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

參照 2015版《中國(guó)藥典》操作方法[7]，取 100 μL 2.1.1項(xiàng)下制備的各溶液，加入200 μL 0.5%纖維蛋白原溶液，37℃溫育2 min。每隔4 min滴加2 μL 10 U/mL凝血酶溶液，直至凝固，以倒立時(shí)無(wú)液滴流下為標(biāo)準(zhǔn)。記錄滴加次數(shù)。滴加次數(shù)越多，說(shuō)明使溶液凝固所需的凝血酶越多，即溶液的抗凝效果越好。

2.2.2 纖維蛋白原平板溶圈法 2.5%瓊脂溶液的配制：稱取0.825 g瓊脂粉，加入33 mL PBS緩沖液，電熱套加熱至溶液澄清透明，即為溶解。

將纖維蛋白原平板法[8]稍加改進(jìn)，采用雙層板結(jié)構(gòu)。取經(jīng)消毒的φ15 cm培養(yǎng)皿，趁熱加入33 mL 2.5%瓊脂溶液作為下層板，靜置10 min，待其凝固。配制36 mL 0.5%纖維蛋白原溶液（方法參照2.2.1項(xiàng)下），取10 U/ml凝血酶溶液4 mL，溫育至37℃，隨后加入到纖維蛋白原溶液中，快速混勻，倒入培養(yǎng)皿中作為上層板，靜置30 min，待其凝固成板。將0.9%氯化鈉溶液、各酶酶解液及其平行對(duì)照溶液取5 μL進(jìn)行點(diǎn)樣，間距大于2 cm，放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃溫育6 h，記錄直徑大小并計(jì)算纖溶面積。其中，△S表示每個(gè)樣品組的面積減去對(duì)應(yīng)酶對(duì)照組和藥渣對(duì)照組的面積。纖溶面積越大，說(shuō)明溶解的纖維蛋白原越多，即溶液的抗凝效果越好。見(jiàn)表2。

表2 不同酶水解水蛭地龍混合藥渣產(chǎn)物抗凝活性對(duì)比Tab.2 Comparison of anticoagulant activity of hirudo and pheretima residue hydrolyzed by different enzymes

2.3 結(jié)果 通過(guò)表中數(shù)據(jù)可以發(fā)現(xiàn)，0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行8次凝血酶滴定后產(chǎn)生凝固現(xiàn)象，而溶圈法中沒(méi)有溶圈出現(xiàn)，在結(jié)果分析過(guò)程中需要將兩種抗凝實(shí)驗(yàn)的結(jié)果綜合進(jìn)行分析。同時(shí)，以0.9%氯化鈉溶液的實(shí)驗(yàn)結(jié)果為參照，采用凝血酶滴定法8次以內(nèi)出現(xiàn)凝固現(xiàn)象的視為無(wú)抗凝活性。

在弱酸性環(huán)境中，采用酸性蛋白酶、風(fēng)味酶和中性蛋白酶對(duì)混合藥渣進(jìn)行酶解后，凝血酶滴定法顯示兩種酶解液均未發(fā)生凝固，而藥渣對(duì)照組和酶對(duì)照組分別在12次左右和8次后發(fā)生凝固。結(jié)合溶圈法的△S值分析，可以發(fā)現(xiàn)，纖溶面積由小到大依次為：酸性蛋白酶<風(fēng)味酶<中性蛋白酶，即進(jìn)行酶解后混合藥渣溶液中含有抗凝活性成分，且中性蛋白酶的酶解效果更好。

在堿性環(huán)境中，采用木瓜蛋白酶、復(fù)配蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶對(duì)混合藥渣進(jìn)行酶解。結(jié)合凝血酶滴定法和溶圈法分析可發(fā)現(xiàn)，木瓜蛋白酶和胰蛋白酶酶解后，溶液的抗凝活性沒(méi)有明顯提高，酶解效果較差。復(fù)配蛋白酶和堿性蛋白酶的滴定次數(shù)和纖溶面積都遠(yuǎn)大于藥渣對(duì)照組和蛋白酶對(duì)照組，這說(shuō)明酶解液比藥渣和酶對(duì)照組表現(xiàn)出更強(qiáng)的抗凝活性。

綜合以上數(shù)據(jù)分析，將△S值進(jìn)行對(duì)比可以發(fā)現(xiàn)堿性蛋白酶酶解的效果最好。在堿性環(huán)境中蛋白酶對(duì)水蛭和地龍混合藥渣的酶解效果遠(yuǎn)好于在酸性環(huán)境中蛋白酶的酶解效果，且堿性越強(qiáng)，酶解液的抗凝活性越強(qiáng)，具體原因尚需要進(jìn)一步研究分析。通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)可以確定堿性蛋白酶為酶解水蛭地龍混合藥渣最佳酶，并進(jìn)一步考察其酶解水蛭地龍混合藥渣的工藝條件。

2.4 堿性蛋白酶酶解水蛭地龍混合藥渣工藝優(yōu)化 考察工藝條件：溶液pH值、酶底比、酶解時(shí)間和酶解溫度，采用纖維蛋白原平板溶圈法評(píng)價(jià)酶解產(chǎn)物的抗凝活性。

2.4.1 樣品制備方法 稱取5 g藥渣，加入一定量堿性蛋白酶，于70 mL生理鹽水中混合均勻，在恒溫振蕩培養(yǎng)器中進(jìn)行反應(yīng)，實(shí)驗(yàn)條件見(jiàn)表3。待反應(yīng)結(jié)束，離心，取上清液，于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

表3 單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)化堿性蛋白酶水解水蛭地龍混合藥渣反應(yīng)條件設(shè)計(jì)表Tab.3 Optimization of reaction conditions for hydrolysis of hirudo and pheretima residue by alkaline protease by single factor experiment

設(shè)置藥渣對(duì)照組（藥渣+生理鹽水）及酶對(duì)照組（酶+生理鹽水），反應(yīng)條件分別與樣品組保持一致。

2.4.2 產(chǎn)物體外抗凝活性對(duì)比 采用纖維蛋白原平板溶圈法對(duì)酶解產(chǎn)物進(jìn)行抗凝活性評(píng)價(jià)，以纖溶面積為評(píng)價(jià)指標(biāo)。纖維蛋白原平板制作方法參照2.2.2。

取5 μL 0.9%氯化鈉溶液、不同梯度條件下的酶解液及其平行對(duì)照溶液進(jìn)行點(diǎn)樣，間距大于2 cm，放入恒溫培養(yǎng)箱中，37℃溫育6 h，記錄直徑大小，計(jì)算纖溶面積。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3.1 溶液pH值 根據(jù)堿性蛋白酶廠家提供的最優(yōu)實(shí)驗(yàn)條件，確定溶液pH值的考察范圍是9.6～12.0，每隔0.6設(shè)置一個(gè)梯度。在酶底比0.75%、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度45℃的條件下，考察pH值對(duì)酶解液抗凝活性的影響，樣品液、酶對(duì)照組和藥渣對(duì)照組的纖溶面積如圖1所示。從圖中可以看出，隨著pH值的增大，樣品組和酶對(duì)照組的纖溶面積呈現(xiàn)先降低后升高的過(guò)程。而藥渣對(duì)照組的纖溶面積隨著pH值的增大而逐步減小。從圖中可以發(fā)現(xiàn)，隨著pH值的升高，△S值出現(xiàn)先升高再降低的趨勢(shì)。當(dāng)pH值為11.4時(shí)，△S值最大為1.60 cm2，即堿性蛋白酶酶解水蛭地龍混合藥渣的最佳pH值為11.4。

圖1 不同pH值下各溶液的纖溶面積Fig.1 The fibrinolysis area of each solution at different pH values

3.2 酶底比 在pH值11.4、酶解時(shí)間4 h、酶解溫度45℃的條件下，考察酶底比對(duì)酶解纖溶面積液抗凝活性的影響。從圖2中可以看出，酶解液和酶對(duì)照組的纖溶面積隨著酶底比的增加呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，當(dāng)酶底比為0.95%時(shí)，纖溶面積達(dá)到最大，即溶液的抗凝活性最強(qiáng)。因此，選擇0.95%最為最佳的酶底比。

圖2 不同酶底比下各溶液的纖溶面積Fig.2 The fibrinolysis area of each solution under different enzyme substrate ratio

3.3 酶解時(shí)間 在pH值11.4、酶底比0.95%、酶解溫度45℃的條件下，考察酶解時(shí)間對(duì)酶解液抗凝活性的影響。結(jié)果見(jiàn)圖3。隨著酶解時(shí)間的延長(zhǎng)，酶對(duì)照組和藥渣對(duì)照組的纖溶面積變化不大；而樣品組的纖溶面積出現(xiàn)了先升高后降低的趨勢(shì)，但變化范圍不大。這說(shuō)明酶解時(shí)間對(duì)反應(yīng)液抗凝活性的影響較小。當(dāng)酶解時(shí)間為4 h時(shí)，酶解液的纖溶面積最大，對(duì)應(yīng)的△S值也最大，如表4所示。因此確定4 h為最佳酶解時(shí)間。

表4 不同酶解時(shí)間下的△S值Tab.4 The△S value under different enzymolysis time

圖3 不同酶解時(shí)間下各溶液的纖溶面積Fig.3 The fibrinolysis area of each solution under different enzymolysis time

3.4 酶解溫度 在pH值11.4、酶底比0.95%、酶解時(shí)間4 h的條件下，考察酶解溫度對(duì)酶解液抗凝活性的影響。從圖4中可以看出，隨著酶解溫度的變化，樣品組的纖溶面積出現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，但整體的變化范圍不大；藥渣對(duì)照組的纖溶面積基本沒(méi)有變化，也就是說(shuō)溫度對(duì)藥渣的影響不大；酶對(duì)照組的纖溶面積出現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì)。各酶解溫度下的△S值列于表5。從表中可以看出，酶解溫度從40℃升高到43℃后，△S值明顯增加；此后，隨著溫度的進(jìn)一步上升，△S值的升高趨于緩和。當(dāng)酶解溫度為45℃時(shí)，△S值達(dá)到最大，即抗凝活性最強(qiáng)。因此確定45℃為最佳酶解溫度。

圖4 不同酶解溫度下各溶液的纖溶面積Fig.4 The fibrinolysis area of each solution at different enzymolysis temperature

表5 不同酶解溫度下的△S值Tab.5 The△S values at different enzymolysis temperatures

4 討論與結(jié)論

4.1 不同種類蛋白酶對(duì)水解液抗凝活性影響的原因分析 采用不同的蛋白酶對(duì)其進(jìn)行酶解，主要的不同之處在于溶液的pH值。隨著溶液pH值的增加，混合藥渣酶解液的抗凝效果逐漸增強(qiáng)。在強(qiáng)酸溶液中進(jìn)行酶解時(shí)，酶解液和藥渣對(duì)照組均出現(xiàn)了白色絮狀沉淀。究其原因，可能是由于水蛭地龍混合藥渣在強(qiáng)酸性環(huán)境中發(fā)生反應(yīng)，生成的物質(zhì)導(dǎo)致纖維蛋白原溶解性降低從而析出，或者生成的物質(zhì)與纖維蛋白原發(fā)生反應(yīng)。具體原因待進(jìn)一步研究和分析。

4.2 堿性蛋白酶酶解混合藥渣工藝條件考察 采用單因素法考察堿性蛋白酶對(duì)混合藥渣酶解的工藝條件，得到抗凝活性最強(qiáng)的工藝條件為：酶底比0.95%、pH 11.4、酶解溫度45℃、酶解時(shí)間4 h。在考察過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，酶解液的抗凝活性隨著溶液pH值和酶底比的改變而有較大的變化，而隨著酶解時(shí)間和酶解溫度的變化改變較小。這說(shuō)明，4個(gè)酶解條件中溶液的pH值和酶底比對(duì)酶解液的抗凝活性影響最大。

4.3 水蛭地龍混合藥渣的再利用展望 水蛭地龍混合藥渣中主要含有大量蛋白質(zhì)、少量多糖和淀粉等營(yíng)養(yǎng)成分，以及多種氨基酸和微量元素等。除了采用酶解的方法得到抗凝活性物質(zhì)外，還可針對(duì)不同的物質(zhì)設(shè)計(jì)不同的再利用方式，提高藥渣廢棄物的再利用效率，提高企業(yè)經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)資源的節(jié)約利用和環(huán)境的保護(hù)。