馬漪，謝瓊

（湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院腫瘤科，長沙 410000）

結直腸癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，發(fā)病率居女性第2位，男性第3位[1]。目前，結腸癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，其主要治療方法是手術治療，但對于晚期復發(fā)或轉移的患者，手術治療效果并不理想。研究表明[2]腫瘤轉移是大多數癌癥患者死亡和治療失敗的主要原因，而通過血液途徑轉移到肝臟被認為是結腸癌患者死亡的主要原因。研究證實[3]結腸癌的預后與轉移尤其是肝轉移密切相關，因此抑制肝轉移的發(fā)生是提高結腸癌的治療效果的手段之一。因此，結腸癌肝轉移的治療是目前臨床的迫切需要?？鄥A是從中藥材苦參中提取得到的生物堿類物質，近年來研究證實[4-5]其對于結腸癌的治療表現出顯著效果。本文通過研究苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠的腫瘤抑制作用及對SCAP/SREBP1通路的調節(jié)作用，為苦參堿的藥理作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 細胞株人結腸癌 HCT116細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2 實驗動物 雄性Balb/c裸小鼠，SPF級，6～8周齡，22～24g，購自于長沙市天勤生物技術有限公司[實驗動物許可證號SCXK（湘）2019-0014]，飼養(yǎng)于SPF級實驗動物房。

1.3 藥品及試劑 苦參堿（上海純優(yōu)生物科技有限公司，批號19080911，純度>98%）；卡培他濱（上海羅氏制藥有限公司，批號 20191011）；SCAP、SREBP1兔多克隆抗體（艾博抗上海貿易有限公司，貨號ab190103、ab28481）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG、轉化生長因子β1蛋白（TGF-β1）及白介素（IL）-6酶聯免疫吸附法（ELISA）試劑盒（碧云天生物科技有限公司，貨號A0208、PT878、PI328）；TRIzol試劑、cDNA提取試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，貨號 15596018、K1672）；蘇木精-伊紅（HE）染色試劑盒、高效RIPA裂解液、ECL Plus超敏發(fā)光液、DMEM培養(yǎng)基（北京索萊寶科技有限公司，貨號G1120、R0010、PE0010、11995）。

1.4 設備與儀器 BX51型倒置顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；QuantStudio 3實時PCR系統(tǒng)（賽默飛世爾科技有限公司）；CUT4060石蠟切片機（德國MicroTel公司）；GelDoc Go凝膠成像系統(tǒng)（伯樂生命醫(yī)學有限公司）；Allegra X-15R臺式冷凍離心機（貝克曼庫爾特商貿有限公司）；7000CO2細胞培養(yǎng)箱（美國Napco公司）。

1.5 分組及給藥 取結腸癌HCT116細胞，加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于5%CO2培養(yǎng)箱中，隔天進行傳代培養(yǎng)，當細胞活力達到95%時，使用胰蛋白酶消化細胞，收集細胞并調整細胞密度為2×107個/mL。

72只小鼠隨機分為空白對照組、肝轉移模型組、苦參堿低、中、高劑量組及卡培他濱組，每組 12只，參照文獻方法[6]建立結腸癌肝轉移小鼠模型，小鼠麻醉后稱質量，取仰臥位將小鼠固定于手術臺上，沿腹部正中切開，從脾下極貼近脾包膜向脾內注射0.2mLHCT116細胞懸液，縫合，關腹，空白對照組小鼠只進行假手術，不注射細胞懸液，7 d后小鼠腹部超聲顯示肝臟部位可見直徑為1 cm左右腫瘤生成視為造模成功?？鄥A低、中、高劑量組分別灌胃給予 12.5、25、50 mg/kg[7]的苦參堿，給藥 21 d[8]，卡培他濱組按照267 mg/kg[9]灌胃給予卡培他濱，給藥14 d，停藥7 d，空白對照組及肝轉移模型組灌胃給予生理鹽水。

1.6 小鼠肝臟質量及肝轉移結節(jié)數的測定小鼠處死后分離肝臟，并進行稱質量，檢查各組小鼠肝臟表面肝轉移結節(jié)數。

1.7 肝組織TGF-β1、IL-6測定 取小鼠肝組織樣品在4℃預冷磷酸鹽緩沖液中研磨勻漿，15 000 r/min，離心半徑10 cm，4°C離心15 min，取上清液，用TGF-β1、IL-6 ELISA試劑盒檢測肝組織上清液中TGF-β1、IL-6水平。

1.8 HE染色 小鼠肝組織在4%中性甲醛固定24 h，脫水、透明處理后，石蠟包埋，石蠟切片機進行5 μm切片，經常規(guī)HE染色后，在顯微鏡下采用盲法進行組織病理學檢查。

1.9 腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA測定 小鼠處死后，分離腫瘤組織，使用TRIzol試劑進行總RNA提取，用cDNA逆轉錄酶試劑盒將總RNA逆轉錄成cDNA。各基因引物如表1所示，應用梯度實時定量聚合酶鏈式反應（PCR）擴增系統(tǒng)，PCR檢測SCAP、SREBP1mRNA在腫瘤組織中的表達。結果以GAPDH 為內參，采用 2-ΔΔCT法計算 SCAP、SREBP1 mRNA相對表達水平。

表1 各基因引物序列Tab.1 Primer sequence of genes

1.10 腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白水平測定 小鼠處死后取腫瘤組織，加入裂解液，研磨勻漿并離心后，測定蛋白濃度，各組取含有50 μg蛋白的上清液，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳、分離后將蛋白轉移到聚偏氟乙烯膜上，用5%牛血清白蛋白室溫封閉 1 h，用 SCAP、SREBP1（1∶1 000 稀釋）兔多克隆抗體和辣根過氧化物酶標記山羊抗兔二抗（1∶2 000稀釋）孵育，使用ECL試劑和凝膠成像系統(tǒng)成像，ImageJ14.0軟件定量分析 SCAP、SREBP1蛋白水平。

1.11 數據處理數據 所有統(tǒng)計分析使用SPSS 20.0軟件進行，數據用均數±標準差（±s）表示。計量資料符合正態(tài)分布且方差齊，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠肝臟質量及肝轉移結節(jié)數的影響 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠肝臟重量及肝轉移結節(jié)數的影響如圖1和圖2所示，與空白對照組比較，肝轉移模型組小鼠肝臟質量及肝轉移結節(jié)數顯著增加（P<0.05）；與肝轉移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組肝臟質量及肝轉移結節(jié)數顯著減少（P<0.05），隨著苦參堿劑量的增加，肝臟質量及肝轉移結節(jié)數降低更明顯。

圖1 各組小鼠肝臟質量比較結果Fig.1 Comparison of liver weights of mice in each group

圖2 各組小鼠肝轉移結節(jié)數比較結果Fig.2 Comparison of the number of liver metastasis nodules in each group of mice

2.2 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠肝組織TGF-β1、IL-6的影響 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠肝組織TGF-β1、IL-6的影響如圖3和圖4所示，與空白對照組比較，肝轉移模型組小鼠肝組織TGF-β1、IL-6水平顯著升高（P<0.05）；與肝轉移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組肝組織TGF-β1、IL-6水平顯著降低（P<0.05），隨著苦參堿劑量的增加，肝組織TGF-β1、IL-6水平降低更明顯。

圖3 各組小鼠肝組織TGF-β1水平比較結果Fig.3 Comparison of TGF-β1 levels in liver tissues of mice in each group

圖4 各組小鼠肝組織IL-6水平比較結果Fig.4 Comparison of IL-6 levels in liver tissues of mice in each group

2.3 肝組織HE染色結果 肝組織病理學檢查如圖5所示，空白對照組小鼠肝組織未見明顯病理學變化，與空白對照組比較，肝轉移模型組小鼠肝組織腫瘤細胞聚集，伴肝組織細胞炎癥浸潤及壞死脫落；與肝轉移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組肝組織腫瘤細胞聚集減輕，病理學改善。

圖5 肝組織病理學檢查結果（HE染色，×400）Fig.5 Liver histopathological examination results(HE staining，×400)

2.4 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA的影響 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA的影響如圖6所示，與空白對照組比較，肝轉移模型組小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA水平顯著升高（P<0.05）；與肝轉移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA水平顯著降低（P<0.05），隨著苦參堿劑量的增加，腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA水平降低更明顯。

圖6 小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA水平比較結果Fig.6 Comparison of SCAP and SREBP1 mRNA levels in mouse tumor tissues

2.5 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白表達的影響 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白表達的影響如圖7所示，與空白對照組比較，肝轉移模型組小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白水平顯著升高（P<0.05）；與肝轉移模型組比較，苦參堿各劑量組及卡培他濱組腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白水平顯著降低（P<0.05），隨著苦參堿劑量的增加，腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白水平降低更明顯。

圖7 苦參堿對結腸癌肝轉移小鼠腫瘤組織SCAP、SREBP1蛋白表達的影響Fig.7 The effect of matrine on the expression of SCAP and SREBP1 protein in tumor tissues of mice with liver metastases from colon cancer

3 討論

結腸癌肝轉移是結腸癌進展過程中常見的遠處轉移現象之一，臨床中表現出進行性貧血、低熱、肝腫大、黃疸和腹水等多種癥狀，嚴重影響患者生存質量及預后。研究表明[10]結腸癌肝轉移的發(fā)病率較高，約有50%的結腸癌患者會并發(fā)肝轉移。目前臨床中對于結腸癌肝轉移的治療采用全身化療和局部手術治療，盡管肝切除是目前最有效的局部控制治療，但肝切除后患者5年生存率較低，且手術治療后復發(fā)率高達70%[11]。同時目前結腸癌肝轉移的臨床化療方案中卡培他濱作為一線推薦藥物，但在臨床使用過程中存在耐藥率高、不良反應大等多種缺點，所以目前對于結腸癌肝轉移的治療藥物的開發(fā)仍是臨床的迫切需求。

苦參堿是從豆科植物苦參（Sophora flavescens Alt.）的干燥根、植株、果實中提取得到的生物堿，近年來研究表明[12-13]，苦參堿對酒精性脂肪肝、神經病理性疼痛、萎縮性胃炎、宮頸癌等疾病具有顯著的藥理作用。近年來研究表明苦參堿對于結腸癌具有顯著的治療作用，繆冬映[4]研究表明苦參堿能夠通過調節(jié)Akt通路顯著抑制結腸癌SW480細胞增殖并促進其凋亡；王偉等[5]研究發(fā)現苦參堿能夠抑制P-糖蛋白的表達，進而調控結腸癌對奧沙利鉑的耐藥性；常城等[14]報道了苦參堿能夠誘導結腸癌HT29細胞周期阻滯，抑制HT29細胞增殖并誘導其凋亡。同時，有研究表明苦參堿對于結腸癌HT-29細胞及結腸癌肝轉移均有顯著的抑制作用[15-16]。

肝臟質量及肝轉移結節(jié)數能夠反映結腸癌肝轉移的嚴重程度及肝組織炎癥水平狀態(tài)；TGF-β1及IL-6是肝組織炎癥病變及病理進展的重要指標之一，近年來有學者發(fā)現其在內源性腫瘤肝轉移的發(fā)生過程中起到一定的促進作用，檀誼洪等[17]研究發(fā)現小鼠結腸癌組織會釋放TGF-β1進而促使肝臟Th1/Th2樣細胞因子漂移，誘導結腸癌肝轉移；黃曉明等[18]發(fā)現CT26細胞可誘導肝臟分泌TGF-β1，進而促進小鼠結腸癌肝轉移瘤的形成；任淑萍等[19]研究發(fā)現IL-6腫瘤間質血管中表達升高，進而促進結腸癌肝轉移；黃偉華等[20]報道了肝再生磷酸酶-3通過上調IL-6水平進而誘導結腸癌肝轉移。本實驗研究表明，與肝轉移模型組比較，苦參堿各劑量組肝臟質量、肝轉移結節(jié)數、肝組織TGF-β1及IL-6水平均明顯降低，這提示苦參堿能夠成劑量依賴性的抑制結腸癌肝轉移，緩解肝組織病理進展，并降低結腸癌肝轉移小鼠TGF-β1及IL-6水平，進而抑制結腸癌肝轉移進一步惡化。

SCAP/SREBP1通路是維持體內糖代謝、膽固醇及脂類代謝平衡的重要信號通路。SCAP作為SREBP1蛋白激活的重要調節(jié)蛋白，SCAP在內質網中與SREBP1結合形成新的復合物，并通過囊泡被轉運到高爾基體膜上，經過高爾基體膜上相應蛋白水解后轉運到細胞核中被激活并發(fā)揮相應作用。近年來有學者研究發(fā)現SCAP/SREBP1通路與腫瘤疾病的發(fā)生及腫瘤轉移密切相關。鄧嘉成[21]研究報道了SCAP誘導的SREBP1的激活是腫瘤生長所必需的條件，同時阻斷SREBP1的激活能夠抑制膠質細胞瘤的增殖；Jump等[22]研究發(fā)現在結腸癌等腫瘤細胞中均發(fā)現SCAP/SREBP1過度激活；羅吉等[23]研究發(fā)現抑制SREBP1的表達則能夠通過抑制PIK3R3基因進而誘導肝癌細胞周期阻滯，并誘導其凋亡；李衛(wèi)華等[24]研究發(fā)現SREBP1在正常子宮細胞中低表達，而在子宮內膜癌中高表達，抑制SREBP1的表達則能夠抑制子宮內膜癌的增殖和轉移侵襲能力，由此可見SCAP/SREBP1的過度表達在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起到重要作用。本實驗結果表明，與肝轉移模型組比較，腫瘤組織SCAP、SREBP1 mRNA及蛋白水平顯著降低，提示苦參堿成劑量依賴性的抑制SCAP/SREBP1通路的過度激活，進而抑制結腸癌肝轉移進展。

綜上所述，苦參堿能夠顯著抑制結腸癌肝轉移，緩解肝組織病理學改變，其機制可能與調節(jié)SCAP/SREBP1信號通路有關。