劉立柱 ，李超藝 ，林詩煒 ，曲野 ，許海軍

（1.海南醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院創(chuàng)傷外科，海口 570311；2.海南醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，?？?571199）

骨折是臨床上患者最常遇到的創(chuàng)傷性損傷[1]。盡管骨骼具有自我更新的能力，但仍有約10%～20%的骨折導(dǎo)致愈合延遲[2]。因此，迫切需要開發(fā)新的治療策略以促進(jìn)骨折后骨組織的再生。骨折愈合是一個(gè)多階段的生物過程，包括初始的炎癥反應(yīng)，隨后形成軟骨痂，然后形成硬骨痂及骨骼組織的最終重塑。骨折愈合再生受生長因子、激素、趨化因子和細(xì)胞因子以及許多其他調(diào)節(jié)劑的精確控制[3-4]。

蟲草素是傳統(tǒng)中草藥冬蟲夏草的主要活性成分之一，是一種腺苷衍生物，具有抗病毒、抗炎、抗氧化及抗腫瘤等多種活性[5-7]。蟲草素可以抑制人關(guān)節(jié)炎軟骨細(xì)胞中白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)表達(dá)[8]。另外，蟲草素可以緩解碘乙酸單鈉和手術(shù)引起的關(guān)節(jié)炎大鼠軟骨損傷[9]。蟲草素促進(jìn)氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的成骨細(xì)胞分化，并促進(jìn)骨形成[10]。蟲草素在閉合性股骨骨折大鼠模型中通過缺氧促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMMSC）的成骨分化并加速骨折愈合。上述均說明蟲草素對(duì)骨損傷具有保護(hù)作用，但蟲草素對(duì)骨折愈合的作用機(jī)制尚未闡明，因此，本研究探究了蟲草素對(duì)骨折愈合的作用及相關(guān)調(diào)節(jié)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物分組與給藥 50只SPF級(jí)SD大鼠（購自海南醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心），體質(zhì)量240～270 g，隨機(jī)分為假手術(shù)組（Sham組）、模型組、蟲草素2.5 mg/kg、蟲草素5 mg/kg、蟲草素10 mg/kg，每組 10只大鼠。根據(jù)之前文獻(xiàn)所述稍作調(diào)整[10]，手術(shù)后腹腔注射給藥不同劑量的蟲草素，Sham組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水，連續(xù)給藥10周，麻醉大鼠，取材。

1.2 骨折模型大鼠制備 本研究參考之前文獻(xiàn)描述[11]，采用標(biāo)準(zhǔn)的大鼠閉合性股骨橫行骨折內(nèi)固定模型，大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉（50 mg/kg）麻醉，將大鼠局部脫毛，碘伏消毒，大鼠膝蓋內(nèi)側(cè)用18號(hào)針頭于切口處打一個(gè)孔，然后將直徑為1.2 mm的AK線插入右股骨髓腔，使用三點(diǎn)彎曲裝置和500 g金屬鈍刀片從35 cm的高度掉落，于縫合切口后在右股骨中軸產(chǎn)生閉合骨折。Sham組的大鼠，將手術(shù)切口縫合回去而不會(huì)造成骨折，連續(xù)4 d肌肉注射抗生素（氨芐青霉素，4×104U/d）。

1.3 材料 骨源性堿性磷酸酶（BAP）試劑盒、核因子-κB受體激活因子（RANKL）試劑盒、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒、丙二醛測(cè)定（MDA）試劑盒、過氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）大鼠酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）試劑盒購自達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。

1.4 放射學(xué)檢測(cè) 采用微型 CT掃描儀（Micro-CT）（SkyScan，Kontich，比利時(shí)）分析大鼠股骨結(jié)構(gòu)，分辨率為18 μm。掃描系統(tǒng)于350 ms內(nèi)以70 kV，851A和1 000個(gè)/180°投影校準(zhǔn)。采用CT Analyzer V 1.11軟件（SkyScan）提取橫截面僅包含松質(zhì)骨的目標(biāo)體積（VOI），用于形態(tài)分析。VOI從生長板的下端1 mm開始，向遠(yuǎn)側(cè)延伸110個(gè)橫截面（高2 mm）。3D分析松質(zhì)骨的每個(gè)VOI骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)，包括骨體積分?jǐn)?shù)（BV/TV），骨小梁厚度（Tb.Th），骨小梁數(shù)（Tb.N）和骨密度（BMD）。

1.5 氧化應(yīng)激和骨代謝分子檢測(cè) 采用商用融合檢測(cè)試劑盒檢測(cè)組織和血清中氧化應(yīng)激和骨代謝分子的水平。收集液氮冷凍的骨組織，組織研磨儀勻漿處理，然后加入磷酸鹽緩沖液（PBS）超聲勻漿，1 000 rpm/min，離心半徑 20 cm，4℃離心 10 min，收集上清，保存于-80℃或根據(jù)試劑盒說明書檢測(cè)氧化應(yīng)激和骨代謝分子的含量。

1.6 組織病理學(xué)檢測(cè) 收集病灶中心附近的股骨組織（見圖1A），置于4%多聚甲醛中固定24 h，隨后置于乙二胺四乙酸（EDTA，15%）脫鈣3周，每3 d換一次，然后石蠟包埋，用石蠟切片機(jī)切成5 μm薄片。根據(jù)制造商說明書分別進(jìn)行蘇木精-伊紅（HE）染色、番紅固綠染色和馬松染色，采用顯微鏡觀察并拍照。

1.7 促炎細(xì)胞因子檢測(cè) 采用ELISA試劑盒檢測(cè)血清促炎細(xì)胞因子的含量。大鼠眼球取血，室溫靜置30 min，1 000 rpm/min，離心半徑 20 cm，離心 10 min，取上清液，根據(jù)制造商說明書檢測(cè)大鼠血清IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 所有數(shù)據(jù)均采用GraphPad Prism 5.0軟件分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組數(shù)據(jù)的比較用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法。P<0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 蟲草素對(duì)骨折大鼠股骨放射學(xué)參數(shù)的影響 采用Micro-CT分析骨折大鼠股骨的愈合情況，并用Tb.Th，BV/TV，BMD，和Tb.N定量分析。股骨圖像表明與Sham組相比，術(shù)后10周模型組骨折大鼠的股骨有明顯的愈傷組織，骨皮質(zhì)厚度和骨量減少，小梁骨微結(jié)構(gòu)明顯受損，給予蟲草素治療組大鼠的骨折部位明顯愈合，骨微結(jié)構(gòu)損傷和骨皮質(zhì)厚度及骨量明顯改善恢復(fù)（見圖1A）。與Sham組比較，模型 組 大鼠Tb.Th，BV/TV，BMD，和Tb.N均明顯降低（P<0.05），蟲草素5 mg/kg和10 mg/kg組 較模型組和蟲草素2.5 mg/kg組大鼠的Tb.Th，BV/TV，BMD，和Tb.N顯著增加（P<0.05），但蟲草素5 mg/kg和10 mg/kg組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見圖1B-E），這些結(jié)果均表明蟲草素能夠促進(jìn)大鼠骨折愈合，并改善骨折大鼠的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化和損傷。

圖1 蟲草素對(duì)骨折大鼠股骨放射學(xué)參數(shù)的影響Fig.1 Effect of cordycepin on radiological parameters of femur in fractured rats

2.2 蟲草素對(duì)骨折大鼠骨代謝分子的影響 骨代謝分子檢測(cè)結(jié)果顯示，與Sham組比，模型組大鼠股骨組織中BAP、RANKL和TRAP含量均顯著增加（P<0.05）。蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組較模型組和2.5 mg/kg組大鼠明顯降低了BAP和TRAP的含量（P<0.05），蟲草素 2.5 mg/kg組 、5 mg/kg組 和10 mg/kg組較模型組大鼠RANKL的含量呈劑量依賴性降低（P<0.05），同時(shí)，蟲草素10 mg/kg組較5 mg/kg組大鼠BAP和TRAP的含量明顯降低（P<0.05），見圖2A，2B和C，上述結(jié)果表明蟲草素可以直接調(diào)節(jié)骨折大鼠骨再生和骨折愈合過程。

圖2 蟲草素對(duì)骨折大鼠骨代謝分子的影響Fig.2 The effect of cordycepin on bone metabolism molecules in fractured rats

2.3 蟲草素對(duì)骨折大鼠股骨病理學(xué)的影響 HE染色結(jié)果顯示，模型組和蟲草素2.5 mg/kg組觀察到排列疏松的大量編織骨，蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組觀察到縱向排列整齊的板層狀骨，且編織骨減少。番紅固綠染色結(jié)果顯示，觀察模型組和蟲草素2.5 mg/kg組大鼠出現(xiàn)大量的軟骨組織（紅色），蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組大鼠觀察到軟骨組織減少，成骨組織（綠色）增加。馬松染色結(jié)果顯示，蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組觀察到大量的成熟骨組織（見圖3）。上述結(jié)果表明蟲草素對(duì)骨折大鼠的股骨的骨折愈合過程具有潛在的促進(jìn)作用。

圖3 蟲草素對(duì)骨折大鼠股骨病理學(xué)的影響Fig.3 The effect of cordycepin on the pathology of femur in fractured rats

2.4 蟲草素對(duì)骨折大鼠炎癥反應(yīng)的影響 與Sham組比，模型組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量顯著增加（P<0.05）。蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組較模型組和2.5 mg/kg組大鼠血清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量明顯降低（P<0.05），蟲草素5 mg/kg組和10 mg/kg組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）（見圖4A，4B和C），上述結(jié)果表明蟲草素對(duì)骨折大鼠的炎癥反應(yīng)具有潛在調(diào)節(jié)作用。

圖4 蟲草素對(duì)骨折大鼠炎癥反應(yīng)的影響Fig.4 The effect of cordycepin on inflammatory response in fractured rats

2.5 蟲草素對(duì)骨折大鼠氧化應(yīng)激的影響 結(jié)果顯示與Sham組比，模型組大鼠血清MDA含量及組織中MDA和CAT的含量顯著增加（P<0.05）。蟲草素2.5 mg/kg組、5 mg/kg組和10 mg/kg組較模型組大鼠血清MDA含量及組織中MDA和CAT的含量呈劑量依賴性降低（P<0.05）。與蟲草素2.5 mg/kg組和5mg/kg組比較，蟲草素10mg/kg組大鼠血清MDA含量及組織中MDA和CAT的含量明顯降低（P<0.05）（見圖5A，5B和5C），結(jié)果表明蟲草素對(duì)骨折大鼠的氧化應(yīng)激具有潛在調(diào)節(jié)作用。

圖5 蟲草素對(duì)骨折大鼠氧化應(yīng)激的影響Fig.5 Effect of cordycepin on oxidative stress in fractured rats

3 討論

蟲草素是一種中藥活性成分，具有抗炎、抗氧化和抗腫瘤等廣泛的生物學(xué)活性，并且可以調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞分化，對(duì)骨組織損傷具有保護(hù)活性。本研究發(fā)現(xiàn)蟲草素加速了大鼠骨折的愈合，改善了骨微結(jié)構(gòu)和骨代謝分子，同時(shí)抑制了炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激，是一種促進(jìn)骨折愈合的潛在先導(dǎo)化合物。

本研究采用標(biāo)準(zhǔn)的大鼠閉合性股骨骨折內(nèi)固定模型評(píng)價(jià)蟲草素對(duì)骨折愈合的作用。此模型用SD大鼠造模，可以更好的模擬臨床人類愈合癥狀，并類似患者疾病模式。骨折愈合過程復(fù)雜，主要包括初期的血腫急性炎癥期、原始骨痂形成期和骨板形成塑形期。血腫形成的半剛性纖維軟骨痂給早期的骨折愈合提供了初始穩(wěn)定性。本研究放射學(xué)檢測(cè)結(jié)果蟲草素治療組大鼠的骨折部位明顯愈合，并且Tb.Th，BV/TV，BMD，和 Tb.N顯著增加。同時(shí)，組 織病理學(xué)結(jié)果表明模型組大鼠觀察到排列疏松的編織骨和大量軟骨組織，蟲草素組大鼠觀察到縱向排列整齊的板層狀骨，這些結(jié)果表明蟲草素能夠促進(jìn)大鼠骨折愈合，并改善骨折大鼠的骨微結(jié)構(gòu)參數(shù)變化和受損，對(duì)骨折愈合具有治療作用。

研究表明蟲草素可以緩解大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)[12]。同樣的，本研究結(jié)果表明蟲草素能夠顯著減少骨折大鼠血清MDA含量及組織中MDA和CAT的含量，抑制大鼠的氧化應(yīng)激反應(yīng)。氧化應(yīng)激級(jí)聯(lián)會(huì)導(dǎo)致骨折部位的骨再生抑制，骨再生對(duì)骨折正常愈合是必需的。破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的平衡對(duì)骨丟失和骨形成至關(guān)重要[13]。TRAP和RANKL是破骨細(xì)胞成熟的標(biāo)志，本研究表明骨折大鼠骨組織中TRAP和RANKL的含量顯著增加，給予蟲草素治療能夠顯著減少大鼠骨組織中TRAP和RANKL的含量。上述研究結(jié)果表明蟲草素對(duì)骨折愈合的促進(jìn)過程與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激有關(guān)。

骨折愈合最早始于炎癥反應(yīng)過程，促炎細(xì)胞因子在組織愈合過程起著至關(guān)重要的作用[14-15]。促炎細(xì)胞因子包括IL-1β、TNF-α和IL-6對(duì)骨折愈合具有重要調(diào)節(jié)作用[16]。骨折愈合不僅僅是破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞之間的平衡作用，也是不同促炎細(xì)胞因子間的相互調(diào)節(jié)過程。研究表明骨折初期血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量顯著增加，后續(xù)逐漸下降[17]。其中TNF-α作為炎癥反應(yīng)初期的主要細(xì)胞因子，其能夠通NF-κB信號(hào)通路和OPG/RANKL/RANK信號(hào)通路介導(dǎo)骨相關(guān)細(xì)胞細(xì)胞的凋亡過程，并且促進(jìn)破骨細(xì)胞增殖和活化。除此之外，IL-1β和IL-6能夠與TNF-α發(fā)生協(xié)同作用，能夠促進(jìn)軟骨細(xì)胞增殖和活化，并介導(dǎo)氧化應(yīng)激反應(yīng)[18]。本研究結(jié)果表明骨折大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量顯著增加，給予蟲草素治療顯著減少骨折大鼠血清中IL-1β、TNF-α和IL-6的含量。結(jié)果表明蟲草素對(duì)骨折愈合的促進(jìn)過程與調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)有關(guān)。

綜上，本研究表明蟲草素能夠促進(jìn)骨折愈合，并且與抑制氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)有關(guān)。但是，蟲草素的具體調(diào)節(jié)信號(hào)通路仍需后續(xù)研究進(jìn)一步探索。