冉添福，劉小倩，楊 繪，江 澍

（1.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合研究院，福建 福州 350122；2.福建中醫(yī)藥大學(xué)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)院，福建 福州 350122）

中醫(yī)學(xué)對自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）的研究源遠(yuǎn)流長，從《金匱要略》到《諸病源候論》，再到《景岳全書·婦人規(guī)》等，均對此病有所記載［1］?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，SA的定義是在妊娠28周前，未使用人工方法而發(fā)生的妊娠終止［2］。SA的病因除了生殖道異常、胎兒染色體異常、免疫因素及感染因素外，內(nèi)分泌異常特別是性激素水平的改變也被認(rèn)為是SA的常見病因［3］。正常的妊娠過程不僅需要發(fā)育良好的子宮環(huán)境，也需要各種激素相互協(xié)調(diào)共同促進(jìn)胚胎發(fā)育生長。在妊娠期間，內(nèi)分泌的異常會(huì)導(dǎo)致諸多妊娠相關(guān)疾病，例如黃體功能不全、高泌乳素血癥、多囊卵巢綜合征等［4］。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)泰山磐石散能夠提高孕激素的表達(dá)水平，從而起到抑制免疫和抗炎的作用，達(dá)到降低流產(chǎn)發(fā)生率的目的［5］。本研究在前期研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探討泰山磐石散在治療自然流產(chǎn)時(shí)黃體生成素（luteinizing hormone，LH）、泌乳素（prolactin，PRL）、睪酮（testosterone，T）和卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，F(xiàn)SH）等性激素對妊娠的影響作用。

1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級10周齡雄性SD大鼠15只，9周齡雌性SD大鼠15只，體質(zhì)量（240±20）g，購于福建中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，許可證號：SCXK（浙）2019-0002。飼養(yǎng)于福建中醫(yī)藥大學(xué)SPF級實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，自由飲水?dāng)z食，溫度（24±2）℃，濕度為40%～60%，每天12 h明暗環(huán)境交替。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 溴隱亭（福州博涵生物公司），取2.5 mg溴隱亭溶于75%乙醇，配制成濃度為0.3 mg/mL的溴隱亭混懸液，4℃避光保存，1周以內(nèi)使用。泰山磐石散藥物組成：人參9 g，黃芪9 g，白術(shù)4.5 g，炙甘草4.5 g，當(dāng)歸9 g，川芎7.2 g，白芍7.2 g，熟地黃7.2 g，川續(xù)斷9 g，黃芩9 g，砂仁4.5 g，糯米18 g，購自福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬人民醫(yī)院。將所有藥物混合（除砂仁外），加入適量純水，浸泡1 h，將砂仁研磨成粉末備用，大火煮沸，然后文火再煮25 min，加入砂仁粉末繼續(xù)煎煮5 min，過濾2次得藥液；在藥渣中再加入適量純水，重復(fù)以上操作1次；將2次藥液混合，濃縮至120 mL，制成含生藥量1 g/mL的藥液，4℃保存。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑和儀器 LH、PRL、T、FSH的ELISA試劑盒（江蘇酶免實(shí)業(yè)有限公司）；酶標(biāo)儀（澳大利亞GmbH公司）；電子天平（上海奧豪斯儀器有限公司）；水平離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；恒溫水浴鍋（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；超純水機(jī)（四川優(yōu)普超純科技有限公司）。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 分組 將SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)14 d，期間對雌性SD大鼠進(jìn)行數(shù)次稱重，觀察體質(zhì)量是否達(dá)到配種標(biāo)準(zhǔn)，待雌鼠體質(zhì)量達(dá)到配種要求后，將15只雌鼠和15只雄鼠按1∶1比例合籠過夜配種，并將15只雌鼠隨機(jī)分為正常對照組、模型組、泰山磐石散組各5只，配種后次日開始，每日7時(shí)觀察雌性大鼠排泄物中有無陰道栓脫落。當(dāng)觀察到雌鼠有陰道栓脫落時(shí)視為妊娠第1天，并分別每天記錄孕鼠體質(zhì)量。

2.2 干預(yù) 正常對照組孕鼠從受孕第1天至取材前1天（共12 d）灌服生理鹽水，從受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射75%乙醇溶液，連續(xù)注射3 d；模型組孕鼠從受孕第1天至取材前1天（共12 d）灌服生理鹽水，從受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射溴隱亭，連續(xù)注射3 d；泰山磐石散組孕鼠從受孕第1天至取材前1天（共12 d）按2.49 g/（kg·d）予泰山磐石散藥液灌胃，從受孕第6天起按1 mL/（kg·d）皮下注射溴隱亭，連續(xù)注射3 d。

2.3 取材 于大鼠妊娠的第12天取材（禁食不禁水12 h），進(jìn)行稱重，腹腔注射8%的乳化異氟烷（0.51～0.64 mL/kg）麻醉孕鼠，待孕鼠完全麻醉后，迅速解剖，打開腹腔，觀察妊娠情況，取腹主動(dòng)脈采集外周血，外周血室溫靜置2～3 h，待血液凝固血塊收縮后，4℃下12 000 r/min離心10 min，取上清，分裝，置于-80℃冰箱中保存。

2.4 ELISA法檢測大鼠血清中LH、PRL、T、FSH的表達(dá) 將4℃存放的試劑盒放置室溫平衡30 min，嚴(yán)格按照說明書提示進(jìn)行操作，于15 min內(nèi)按照說明書的要求，在酶標(biāo)儀選擇合適的波長測量各孔的吸光度（OD值）。以標(biāo)準(zhǔn)的濃度作為橫坐標(biāo)，測出的OD值作為縱坐標(biāo)，作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算樣品濃度。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 26.0統(tǒng)計(jì)軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。計(jì)量資料符合正態(tài)分布以（±s）表示，組內(nèi)比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析。方差齊采LSD法分析，方差不齊采用Games-Howell法分析；不符合正態(tài)性檢驗(yàn)者，采用非參數(shù)分析。

3 結(jié)果

3.1 3組大鼠血清中LH、PRL、T、FSH表達(dá)水平比較 與正常對照組比較，模型組孕鼠血清中LH、PRL、T和FSH濃度均明顯升高（P＜0.05）；與模型組比較，泰山磐石散組孕鼠血清中LH、T和FSH濃度明顯降低（P＜0.05），見表1。

表1 3組大鼠血清中LH、PRL、T、FSH濃度比較（±s）

表1 3組大鼠血清中LH、PRL、T、FSH濃度比較（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別正常對照組模型組泰山磐石散組n555 LH/（ng/L）47.86±2.66 56.85±2.631）49.57±3.082）PRL/（pg/mL）167.31±10.01 214.33±8.741）214.15±9.001）T/（nmol/L）84.44±3.77 102.88±5.791）95.33±5.952）FSH/（IU/L）26.58±1.39 30.60±1.001）28.04±1.422）

3.2 3組大鼠胚胎情況比較 與正常對照組比較，模型組大鼠子宮內(nèi)瘀血嚴(yán)重，胚胎顏色呈黑紫色，部分胚胎體積明顯減小，胚胎吸收率明顯增高（P＜0.05）；與模型組比較，泰山磐石散組大鼠子宮內(nèi)狀態(tài)明顯好轉(zhuǎn)，接近于正常對照組大鼠，胚胎呈淡粉色或紅色，胚胎吸收率明顯降低（P＜0.05），見圖1、表2。

表2 3組大鼠胚胎吸收率比較（±s）

表2 3組大鼠胚胎吸收率比較（±s）

注：與正常對照組比較，1）P＜0.05；與模型組比較，2）P＜0.05。

組別正常對照組模型組泰山磐石散組n 555胚胎總數(shù)/個(gè)107 92 98胚胎吸收數(shù)/個(gè)9 31 19吸收率/%8.29±0.03 35.23±0.091）19.31±0.032）

圖1 3組大鼠胚胎妊娠情況

4 討論

自然流產(chǎn)是一個(gè)極其復(fù)雜的疾病，甚至可以稱之為疑難雜癥，對女性及其家庭的傷害是巨大且無可挽回的，其致病原因眾多［6］，且半數(shù)以上的病因仍無法明確。內(nèi)分泌異常是SA的常見病因，內(nèi)分泌特別是性激素水平對胚胎發(fā)育的影響是巨大的，內(nèi)分泌異常最終會(huì)導(dǎo)致妊娠失敗［7］，所以在孕前檢查通常會(huì)檢測性激素水平，可檢測是否存在黃體功能不全、高泌乳素血癥和多囊卵巢綜合征等情況，本實(shí)驗(yàn)通過檢測流產(chǎn)模型孕鼠血清中的部分性激素（LH、PRL、T、FSH），探究泰山磐石散在治療SA過程中對性激素的調(diào)控作用。

LH又稱為促黃體生成素，是由垂體前葉分泌的激素，能夠刺激卵巢分泌雌激素，并對睪酮的分泌有促進(jìn)和刺激作用。一般在女性的月經(jīng)期，體內(nèi)的LH濃度會(huì)呈上升趨勢，在某一點(diǎn)到達(dá)高峰后迅速下降。LH過高會(huì)引起一系列妊娠相關(guān)疾病，例如原發(fā)性性功能減退癥、卵巢功能衰竭等，嚴(yán)重的就會(huì)導(dǎo)致不孕或妊娠失?。?］，但黃體生成素增多導(dǎo)致流產(chǎn)的作用機(jī)制一直未能明確，有相關(guān)報(bào)道稱可能是因?yàn)楦淖兞寺雅莸纳姝h(huán)境從而造成卵母細(xì)胞早熟有關(guān)［9］。本研究發(fā)現(xiàn)用溴隱亭所造大鼠流產(chǎn)模型的LH值升高，使用中藥泰山磐石散可降低孕鼠體內(nèi)LH，最終改善大鼠妊娠狀態(tài)，發(fā)揮良好的安胎作用。

PRL又稱為催乳素，由垂體前葉腺嗜酸性細(xì)胞分泌，有促進(jìn)乳腺發(fā)育生長和泌乳的作用，還可刺激卵泡LH受體生成。有研究表明，小劑量的PRL對卵巢激素與孕激素的合成有促進(jìn)作用，而大劑量的PRL則會(huì)產(chǎn)生抑制作用，從而使受精和胚胎發(fā)育受阻，最終導(dǎo)致不孕和妊娠失?。?0-11］。本實(shí)驗(yàn)證明大鼠流產(chǎn)模型體內(nèi)的PRL含量顯著升高，而泰山磐石散可以降低泌乳素的表達(dá)水平，妊娠結(jié)局良好。

T除了由睪丸分泌還可以由腎上腺皮質(zhì)和卵巢合成，女性釋放在血中的睪酮主要來自于腎上腺皮質(zhì)。正常情況下，女性體內(nèi)的睪酮和雌激素水平是保持平衡的，如果雄激素過多，則容易導(dǎo)致高雄激素血癥，該病主要在卵巢和腎上腺發(fā)生，主要特點(diǎn)是多毛、不孕、多囊卵巢綜合征和卵巢腫瘤等，有研究顯示約1/5的流產(chǎn)患者患有高雄激素血癥［12］，高雄激素作為雌激素的拮抗劑，會(huì)通過作用于卵母細(xì)胞，導(dǎo)致卵泡發(fā)育障礙，最終引發(fā)不孕和流產(chǎn)［13］。女性體內(nèi)過多的雄激素會(huì)抑制下丘腦分泌促性腺激素釋放激素，影響子宮內(nèi)膜的增生，并影響胚胎的著床或發(fā)育［14］。本次實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究證明大鼠流產(chǎn)模型體內(nèi)的睪酮水平明顯升高，使用泰山磐石散可以降低睪酮的表達(dá)水平，更好地維持妊娠，使胚胎能夠正常著床、發(fā)育。

FSH以糖蛋白為主要成分，作用主要為促進(jìn)卵泡成熟，主要由垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌。對于女性而言，LH聯(lián)合FSH對卵泡成熟，生成雌激素、排卵，黃體的產(chǎn)生與維持，孕激素的生成均有促進(jìn)作用［15］。妊娠期間，隨著卵泡的發(fā)育，雌激素分泌增加，加上抑制素的作用，卵泡生長對FSH的依賴性降低，故FSH水平也隨之降低［8］。本實(shí)驗(yàn)研究證明大鼠流產(chǎn)模型體內(nèi)的FSH水平相比正常對照組升高，使用泰山磐石散可以降低FSH的表達(dá)水平，改善流產(chǎn)情況。

綜上所述，泰山磐石散主要通過降低母體血清中LH、T、FSH等性激素的表達(dá)水平，改善了母體的內(nèi)分泌水平，從而保證了胎兒的正常發(fā)育，最終達(dá)到降低流產(chǎn)風(fēng)險(xiǎn)，改善妊娠結(jié)局的作用。但在研究泰山磐石散對流產(chǎn)模型大鼠血清中PRL表達(dá)的影響中發(fā)現(xiàn)：模型組大鼠血清中PRL的表達(dá)與正常組比較明顯升高（P＜0.05），但與泰山磐石散組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。因此本實(shí)驗(yàn)后續(xù)擬增加樣本量，并用其他實(shí)驗(yàn)方法繼續(xù)探討泰山磐石散對流產(chǎn)模型大鼠血清中PRL的影響。