鞏 濤，孫召華，張志龍，魏傳軍，王有科，雷 高，安明理

（1.河南省科學(xué)院生物研究所有限責(zé)任公司，鄭州 450008；2.河南省地震局，鄭州 450016）

越來越多的研究表明，氣候變化和植被類型在土壤微生物群落結(jié)構(gòu)中起著重要作用，這是由于土壤pH、溫濕度以及有機(jī)質(zhì)的質(zhì)量和數(shù)量等季節(jié)性環(huán)境因素，可能通過根系分泌物和凋落物間接地受到地上植物的影響，從而進(jìn)一步對(duì)微生物類群造成影響［1-4］.

土壤微生物通過促進(jìn)濕地生態(tài)系統(tǒng)的物質(zhì)循環(huán)和能量流動(dòng)，在調(diào)節(jié)濕地生態(tài)系統(tǒng)平衡中發(fā)揮著重要作用，土壤微生物作為濕地生態(tài)系統(tǒng)的重要指示特征，多年來一直受到人們的關(guān)注［5］.以往的研究主要集中在人工濕地在污水處理中的微生物群落變化，很少有研究同時(shí)考慮季節(jié)變化和植被類型對(duì)濕地土壤微生物進(jìn)化的影響，特別是在黃河流域濕地［6-8］.黃河濕地作為水陸過渡帶，受水體氣候和陸地環(huán)境的影響明顯，它可能具有既不同于陸地環(huán)境又不同于水體環(huán)境的獨(dú)特的微生物資源，這種特殊的氣候類型可能導(dǎo)致物種的多樣性和基因資源的稀缺性［9-11］.

蘆葦（Phragmites communis）和野大豆（Glycine soja）是黃河濕地兩種典型的植被類型.然而，它們對(duì)微生物群落組成的影響卻鮮有研究.不同植被類型是否表現(xiàn)出獨(dú)特的土壤微生物群落，是否具有相似的季節(jié)變化類型，也是一個(gè)值得研究的問題.對(duì)這些問題進(jìn)入深入研究有助于促進(jìn)自然保護(hù)區(qū)的管理和保護(hù)，對(duì)指導(dǎo)人工濕地的設(shè)計(jì)具有重要意義.本研究中，我們采用高通量測(cè)序的方法研究了不同季節(jié)及植被條件下黃河濕地土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的變化.

1 材料和方法

1.1 樣品采集

采樣區(qū)位于河南鄭州黃河國(guó)家濕地公園.第一個(gè)采樣點(diǎn)位于東經(jīng)113°38′55″E、34°54′42″N，覆蓋植被為蘆葦；第二個(gè)采樣點(diǎn)位于113°39′3″E、北緯34°54′51″N，覆蓋植被為野生大豆.2017年3月、6月、9月、12月進(jìn)行了取樣，采集地表以下5～15 cm深度的10個(gè)土壤樣品，從每個(gè)地點(diǎn)采集0.5 kg土壤，并將10個(gè)樣品混合為1個(gè)完整的代表性樣品.最后，從河南鄭州黃河國(guó)家濕地公園采集了8種不同季節(jié)、不同植被類型的濕地土壤樣品.

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

土壤濕度采用稱重法計(jì)算，用重鉻酸鉀法測(cè)定總有機(jī)碳（TOC）［12］，采用凱氏定氮法測(cè)定全氮（TN）含量［13］.

1.3 DNA提取、PCR擴(kuò)增和高通量測(cè)序

選擇四季和兩種植被類型（春1，春2，夏1，夏2，秋1，秋2，冬1和冬2，1覆蓋植被為蘆葦，2覆蓋植被為野大豆）進(jìn)行高通量測(cè)序分析.利用E.Z.N.A.TM土壤DNA試劑盒（Omega Bio-Tek，美國(guó)）提取土壤總基因組DNA，使用NanoDrop 2000超顯微分光光度計(jì)（Thermo Scientific，Wilmington，USA）測(cè)定DNA濃度，選擇引物515f/806r，從總基因組DNA中擴(kuò)增16S rDNA的V4高變區(qū)［14］.然后利用Illumina-Miseq平臺(tái)進(jìn)行高通量測(cè)序.序列已存入GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為PRJNA480720.

1.4 生物信息學(xué)與統(tǒng)計(jì)分析

從Illumina Miseq平臺(tái)獲得的序列根據(jù)利用（QIIME）軟件進(jìn)行分析［15］，用DPS 7.05分析不同樣本間的顯著差異，利用SPSS 19.0進(jìn)行相關(guān)性分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 微生物群落結(jié)構(gòu)分析

共檢測(cè)到26個(gè)門72個(gè)綱13個(gè)目244個(gè)科354個(gè)屬的微生物類群.在所有的土壤樣品中，變形菌門（Proteobacteria）是最豐富的微生物類群，平均相對(duì)豐度為30.84%；其次是酸桿菌門（Acidobacteria），平均相對(duì)豐度為22.51%.其他優(yōu)勢(shì)類群有擬桿菌門（Bacteroidetes）10.20%、芽單胞菌門（Gemmatimonadetes）8.59%、放線菌門（Actinobacteria）7.24%、綠彎菌門（Chloroflexi）6.61%、厚壁菌門（Firmicutes）3.89%、疣微菌門（Verrucomicrobia）3.65%、浮霉菌門（Planctomycetes）2.88%和硝化螺旋菌門（Nitrospirae）1.37%（圖1）.

圖1 門水平上不同土壤樣品的細(xì)菌類別Fig.1 Bacterial categories of different soil samples at phylum level

2.2 土壤理化性質(zhì)對(duì)土壤微生物群落組成的影響

各個(gè)樣品土壤理化性質(zhì)的季節(jié)變化見表1.土壤理化性質(zhì)與樣品16s rDNA基因豐度和OTU類型相關(guān)性分析（表2）顯示，植被對(duì)土壤微生物的影響可能受土壤理化性質(zhì)的影響.土壤微生物豐度和多樣性與TOC、TN呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），土壤pH值與微生物16s rDNA基因豐度和OTU類型呈負(fù)相關(guān)，這一結(jié)果與前人的研究結(jié)果一致.例如，Waldrop［16］研究指出，微生物生物量和活性與土壤有機(jī)質(zhì)和養(yǎng)分含量顯著正相關(guān)；吳澤燕等［17］研究發(fā)現(xiàn)，不同植被類型下土壤微生物PLFAs含量與土壤水分、溫度和有機(jī)質(zhì)有關(guān).造成這一現(xiàn)象的原因可能是由于植物通過落葉和根系分泌物提供了維持土壤微生物生長(zhǎng)的大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì).逐漸地，各種土壤理化性質(zhì)，如pH值、營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)和土壤結(jié)構(gòu)都能形成自己的特性，從而間接影響土壤微生物群落［18］.

表1 不同樣品的土壤理化性質(zhì)Tab.1 Soil physicochemical properties in different samples

2.3 微生物群落結(jié)構(gòu)隨季節(jié)變化

優(yōu)勢(shì)微生物季節(jié)動(dòng)態(tài)分析（圖2）顯示，微生物群落在季節(jié)變化期間明顯發(fā)生結(jié)構(gòu)性變化.在門的分類水平上，春季樣品中，酸桿菌（Acidobacteria）比率高于其他群落；夏季樣品中，擬桿菌（Bacteroidetes）和放線菌（Actinobacteria）比率較高；秋季樣品中，綠彎菌（Chloroflexi）和厚壁菌（Firmicutes）含量豐富；浮霉菌（Planctomycetes）、變形桿菌（Proteobacteria）和芽單胞菌（Gemmatimonadetes）的豐度在冬季到來時(shí)達(dá)到最高值.微生物群落結(jié)構(gòu)的變化可能反映出它們對(duì)溫度的偏好和耐受性，因?yàn)樵S多細(xì)菌可以產(chǎn)生休眠結(jié)構(gòu)或抗性孢子.結(jié)果表明，浮霉菌、變形桿菌和芽單胞菌對(duì)低溫的適應(yīng)能力較強(qiáng)，類桿菌和放線菌更容易在高溫下繁殖，而酸桿菌和疣微菌更適宜春季和秋季溫和的環(huán)境.

圖2 優(yōu)勢(shì)微生物群落（top10）季節(jié)變化動(dòng)態(tài)Fig.2 Seasonal dynamics of dominant microbial communities（top10）at phylum level

2.4 微生物群落多樣性和豐度隨季節(jié)變化

Shannon-Wiener指數(shù)（圖3）和16s rDNA基因拷貝數(shù)（圖4）也顯示了黃河濕地土壤細(xì)菌群落多樣性和豐度在季節(jié)變化中的明顯動(dòng)態(tài)變化.先前的研究表明，微生物豐度從冬季開始增加，在夏季達(dá)到最大值［19-20］.與這些發(fā)現(xiàn)略有不同的是，在本研究中，從冬季到次年秋季，細(xì)菌豐度持續(xù)增加，黃河濕地群落多樣性在冬季減少，秋季最高.以下幾個(gè)潛在的原因可以引起這些現(xiàn)象：首先，秋季相對(duì)舒適、穩(wěn)定的環(huán)境可能有利于微生物的生長(zhǎng)繁殖，從而達(dá)到提高群落多樣性；第二，秋季豐富的基質(zhì)有利于微生物的增殖，提高微生物群落的豐富度和多樣性；第三，在秋季向冬季變化過程中，由于土壤水分和養(yǎng)分的限制，微生物可能被直接或間接殺死.結(jié)果，雖然總體微生物豐度和多樣性降低了，但抗逆性強(qiáng)的物種卻存活下來并增加了其優(yōu)勢(shì).

圖3 不同季節(jié)中微生物群落的Shannon-Wiener指數(shù)Fig.3 Shannon-Wiener indexes of soil microbial communities in different seasons

圖4 兩種植被類型下微生物群落豐度Fig.4 Abundances of microbial communities under two vegetation types

2.5 植被類型對(duì)土壤微生物群落組成的影響

比較了黃河國(guó)家濕地公園兩種典型植被類型的微生物群落組成，結(jié)果顯示，植被類型對(duì)微生物群落的影響主要表現(xiàn)為種屬差異.在每個(gè)季節(jié)樣本中，前10的優(yōu)勢(shì)屬至少存在三個(gè)差異，表明植被類型對(duì)土壤微生物群落組成有重要影響（圖5）.這一結(jié)果除了物理和化學(xué)性質(zhì)不同引起的差異外，還可能歸因于特定地上植被的凋落物和根系分泌物的差異［21-22］.腐爛的凋落物為土壤微生物提供了棲息地、養(yǎng)分和能量，地上植被類型也可以通過根系釋放的物質(zhì)直接影響根際微生物，因?yàn)楦捣置谖锏奶囟ùx物對(duì)土壤微生物群也具有重要的生態(tài)影響［23-25］.

圖5 兩種植被類型中優(yōu)勢(shì)菌群分布情況Fig.5 Distributions of dominant genera in all samples of the two vegetation types from four seasons

3 結(jié)論

利用高通量測(cè)序技術(shù)研究了季節(jié)變化和植被類型對(duì)河南沿黃濕地土壤微生物群落的影響.研究結(jié)果證實(shí)了黃河國(guó)家濕地公園土壤微生物群落隨季節(jié)變化的假設(shè)，不同植被類型濕地土壤可能表現(xiàn)出不同的土壤微生物群落組成.結(jié)果表明，沿黃濕地生態(tài)系統(tǒng)中微生物群落的多樣性為秋季＞夏季＞春季＞冬季.此外，季節(jié)變化對(duì)微生物的影響不是獨(dú)立的，它們還與土壤理化性質(zhì)和地上植被類型的季節(jié)性生長(zhǎng)密切相關(guān).

由于下一代測(cè)序儀的序列長(zhǎng)度不足以從物種水平上鑒定微生物，高通量測(cè)序方法盡管有其優(yōu)點(diǎn)，但也存在局限性.還有一些序列被歸屬為未分類物種，以后結(jié)合元基因組學(xué)或更先進(jìn)的技術(shù)，研究結(jié)果可以更加精細(xì)和詳細(xì).

本研究主要針對(duì)濕地生態(tài)系統(tǒng)中一年兩種植被類型進(jìn)行了研究，因此建議后續(xù)研究在多個(gè)植被類型中連續(xù)采集三年以上的樣本，以最好地評(píng)估其對(duì)濕地生態(tài)系統(tǒng)微生物動(dòng)態(tài)的影響.