陳寧 黃權(quán)華 蘇軍權(quán) 張苗青,2 張靖溥

(1 深圳華潤(rùn)九新藥業(yè)有限公司，深圳 518049；2 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)抗生素生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，抗感染藥物研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050)

阿奇霉素(azithromycin)是一種由紅霉素結(jié)構(gòu)修飾得到的第二代大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，在臨床上廣泛應(yīng)用于呼吸道感染或皮膚和軟組織感染等[1-2]。張斗勝等對(duì)不同鹽形式的國(guó)產(chǎn)注射用阿奇霉素中雜質(zhì)譜進(jìn)行考察，發(fā)現(xiàn)酸降解物3'-去克拉定糖阿奇霉素(雜質(zhì)J)為主要降解產(chǎn)物[3-4]。由于阿奇霉素的C9位羰基被修飾，不能發(fā)生縮酮化反應(yīng)，因此與紅霉素相比，對(duì)酸更穩(wěn)定[5]。但口服阿奇霉素片劑在胃液中釋放后能被迅速水解成雜質(zhì)J，而阿奇霉素腸溶膠囊可較好地解決阿奇霉素在體內(nèi)產(chǎn)生雜質(zhì)J這一問題[6-7]。為揭示雜質(zhì)J可能誘發(fā)的毒副作用及其機(jī)制，為臨床更好地應(yīng)用阿奇霉素制劑提供選擇依據(jù)，本文利用模式動(dòng)物斑馬魚通過(guò)轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，探討阿奇霉素及雜質(zhì)J的可能毒性作用及差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

斑馬魚(Danio rerio)野生型AB系，飼養(yǎng)方法和受精卵收集參照文獻(xiàn)[8]。本研究中選用發(fā)育正常的3 dpf(3 day post fertilization)斑馬魚幼魚用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)程序符合中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理規(guī)則，并獲得所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理委員會(huì)的準(zhǔn)許。

1.1.2 試劑

阿奇霉素(批號(hào)130352-201808)和阿奇霉素雜質(zhì)J(批號(hào)130650-200901)標(biāo)準(zhǔn)品由中國(guó)食品藥品檢定研究院饋贈(zèng)，純度為95%。Trizol試劑和二甲亞砜(DMSO)自Invitrogen公司購(gòu)買。

1.2 方法

1.2.1 LD5和LD50測(cè)定

參照文獻(xiàn)[8-9]的方法，發(fā)育正常的3 dpf斑馬魚幼魚分別給與不同濃度的阿奇霉素和雜質(zhì)J(0.5、1、2、3、4和5 mmol/L)，每組各30條。給藥3 d后，統(tǒng)計(jì)不同濃度的兩種化合物導(dǎo)致的斑馬魚幼魚死亡數(shù)，計(jì)算死亡率(%)，繪制“致死率-濃度”效應(yīng)曲線，并計(jì)算阿奇霉素和雜質(zhì)J對(duì)斑馬魚幼魚整體毒性的LD5和LD50值。

1.2.2 轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析

參照文獻(xiàn)[10]的方法，3 dpf野生型斑馬魚幼魚置于相同濃度的阿奇霉素和雜質(zhì)J (2 mmol/L)藥液中，每組各20條，培養(yǎng)3 d后，Trizol法提取總 RNA，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序及原始數(shù)據(jù)分析由北京博奧生物科技有限公司完成。將P＜0.05顯著差異的轉(zhuǎn)錄本進(jìn)行GO富集分析。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

參照文獻(xiàn)[8-9]的方法，斑馬魚幼魚(3 dpf)分別給與不同濃度的阿奇霉素和雜質(zhì)J (0.5、1和2 mmol/L)，每組各20條，給藥3 d后，Trizol法提取組織總RNA，利用LightCycler 480熒光實(shí)時(shí)定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，以β-actin為內(nèi)參基因，基因相對(duì)mRNA表達(dá)量用2-ΔΔCt方法計(jì)算。所用引物序列如表1所示。

表1 qRT-PCR引物Tab.1 Primers used in the qRT-PCR analysis

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

除RNA-seq分析外，所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，所有數(shù)據(jù)均以(x_±s)表示，GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析并制圖。t檢驗(yàn)分析組間差異，P＜0.05認(rèn)為差異具有顯著性。

2 結(jié)果

2.1 阿奇霉素和雜質(zhì)J對(duì)斑馬魚幼魚的整體毒性

3 dpf斑馬魚幼魚分別置于不同濃度的阿奇霉素和雜質(zhì)J溶液(0.5、1、2、3、4和5 mmol/L)中培養(yǎng)，3 d后，統(tǒng)計(jì)每組斑馬魚幼魚死亡率，繪制兩種化合物的致死率-濃度曲線(圖1)，計(jì)算出阿奇霉素對(duì)斑馬魚幼魚的LD5和LD50，分別為0.71 mmol/L和3.10 mmol/L，雜質(zhì)J的LD5和LD50分別為0.68 mmol/L和3.16 mmol/L，結(jié)果表明阿奇霉素和雜質(zhì)J對(duì)斑馬魚幼魚整體毒性沒有顯著差異。

2.2 差異基因表達(dá)分析

利用轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析(RNA-seq)進(jìn)一步揭示阿奇霉素和雜質(zhì)J對(duì)斑馬魚的毒性反應(yīng)機(jī)制，結(jié)果表明，兩種化合物在轉(zhuǎn)錄水平均可導(dǎo)致幼魚的基因表達(dá)譜發(fā)生明顯改變，且二者導(dǎo)致發(fā)生顯著性變化的基因個(gè)數(shù)不同，與對(duì)照組相比，阿奇霉素導(dǎo)致了1257個(gè)基因發(fā)生顯著性變化，其中上調(diào)基因有797個(gè)，下調(diào)基因有460個(gè)，雜質(zhì)J導(dǎo)致了1190個(gè)DEGs，其中上調(diào)基因有688個(gè)，下調(diào)基因有502個(gè)(圖2A)。去除未知基因后，阿奇霉素與雜質(zhì)J共同調(diào)節(jié)的差異基因個(gè)數(shù)為49個(gè)，阿奇霉素單獨(dú)調(diào)節(jié)26個(gè)DEGs，雜質(zhì)J單獨(dú)調(diào)節(jié)21個(gè)DEGs(圖2B)。提示二者可能通過(guò)影響體內(nèi)不同的生理過(guò)程導(dǎo)致毒性反應(yīng)的發(fā)生。

2.3 差異基因GO歸類分析

進(jìn)一步對(duì)兩種化合物調(diào)節(jié)的DEGs通過(guò)基因本體(GO)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行功能歸類分析(圖3)。阿奇霉素調(diào)節(jié)的DEGs歸類到GO生物過(guò)程(變化倍數(shù)＞3，P＜0.05)分別為碳水化合物代謝過(guò)程(carbohydrate metabolic process)、海藻糖代謝過(guò)程(fucose metabolic process)、碳水化合物衍生物分解代謝過(guò)程(carbohydrate derivative catabolic process)、糖脂分解代謝過(guò)程(glycolipid catabolic process)和TOR信號(hào)通路的正調(diào)控(positive regulation of TOR signaling)等。雜質(zhì)J調(diào)節(jié)的DEGs歸類到GO生物過(guò)程分別為碳水化合物代謝過(guò)程(carbohydrate metabolic process)、免疫反應(yīng)(immune response)、碳水化合物衍生物分解代謝過(guò)程(carbohydrate derivative catabolic process)、小分子代謝過(guò)程(small molecule metabolic process)和氨基糖代謝過(guò)程(amino sugar metabolic process)等。上述阿奇霉素單獨(dú)調(diào)節(jié)的26個(gè)DEGs中有4個(gè)基因歸屬于顯著差異性GO生物過(guò)程(變化倍數(shù)＞3，P＜0.05)，其中ctsc、gnpda和gck基因歸屬于碳水化合物及碳水化合物衍生物等代謝過(guò)程，tmem127基因歸屬于TOR信號(hào)相關(guān)生物過(guò)程，與細(xì)胞生長(zhǎng)密切相關(guān)。雜質(zhì)J單獨(dú)調(diào)節(jié)的21個(gè)DEGs中只有1個(gè)基因(cxcl8b.1基因)歸屬于顯著差異性GO生物過(guò)程(變化倍數(shù)＞3，P＜0.05)，屬于免疫反應(yīng)相關(guān)生物過(guò)程。阿奇霉素單獨(dú)調(diào)節(jié)的4種DEGs中ctsc和gnpda基因顯著上調(diào)，而gck和tmem127基因顯著下調(diào)；雜質(zhì)J單獨(dú)調(diào)節(jié)的cxcl8b.1基因顯著上調(diào)。上述結(jié)果提示阿奇霉素和雜質(zhì)J均可能影響機(jī)體的代謝過(guò)程，而雜質(zhì)J還可能會(huì)影響機(jī)體的免疫反應(yīng)過(guò)程。

2.4 qRT- PCR分析

為驗(yàn)證上述RNA-seq檢測(cè)結(jié)果，利用qRT-PCR對(duì)阿奇霉素和雜質(zhì)J可單獨(dú)調(diào)節(jié)的差異基因進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明阿奇霉素可單獨(dú)調(diào)節(jié)的ctsc、gnpda、gck和tmem127基因以及雜質(zhì)J可單獨(dú)調(diào)節(jié)的cxcl8b.1基因表達(dá)變化與RNA-seq測(cè)序結(jié)果相似，并呈濃度依賴性(圖4)。

3 討論

阿奇霉素的主要酸降解產(chǎn)物是雜質(zhì)J，本研究利用模式動(dòng)物斑馬魚分析阿奇霉素及其雜質(zhì)J在體內(nèi)毒性反應(yīng)的異同。兩種化合物對(duì)斑馬魚幼魚的急性毒性反應(yīng)沒有顯著性差異；但轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，阿奇霉素可單獨(dú)調(diào)節(jié)ctsc、gnpda、gck和tmem127基因，它們與體內(nèi)的生物代謝與細(xì)胞生長(zhǎng)(TOR信號(hào)相關(guān)的生物過(guò)程)過(guò)程有關(guān)；而雜質(zhì)J可單獨(dú)調(diào)節(jié)cxcl8b.1基因，與體內(nèi)免疫反應(yīng)過(guò)程相關(guān)；提示二者在體內(nèi)導(dǎo)致的生理反應(yīng)并不完全相同。

cxcl8b.1基因編碼的interleukin-8b.1蛋白是促炎癥因子，該基因高表達(dá)可使機(jī)體炎癥途經(jīng)被激活，進(jìn)而可能誘導(dǎo)炎癥特征性體征，例如腫脹、發(fā)熱、疼痛、發(fā)紅和功能喪失等[11-12]。目前兒童使用注射用阿奇霉素時(shí)會(huì)有輸注部位疼痛和急性嚴(yán)重過(guò)敏反應(yīng)等不良反應(yīng)[13]，而國(guó)產(chǎn)阿奇霉素片劑在使用過(guò)程中更易發(fā)生胃腸道反應(yīng)等不良反應(yīng)(未發(fā)表資料)，這些不良反應(yīng)的產(chǎn)生是否與雜質(zhì)J有關(guān)仍需進(jìn)一步的研究。

本文明確了阿奇霉素與雜質(zhì)J對(duì)機(jī)體生理過(guò)程的影響具有明顯差異，為深入探討阿奇霉素不同劑型-雜質(zhì)-不良反應(yīng)的關(guān)系提供了研究方向，對(duì)阿奇霉素產(chǎn)品的質(zhì)量控制和制劑的臨床應(yīng)用均具有重要意義。