胡昌勤 李進 張夏

(中國食品藥品檢定研究院，北京 102629)

在藥物雜質(zhì)譜(impurity profile)控制中，對β-內(nèi)酰胺抗生素聚合物的控制是當前國內(nèi)外關注的熱點之一[1]。β-內(nèi)酰胺抗生素主要包括青霉素和頭孢菌素兩大類，作者已經(jīng)對青霉素類抗生素聚合物分析的進展進行了綜述[2]。頭孢菌素作為臨床中最重要的一類抗菌藥物，是當前國內(nèi)仿制藥一致性評價的熱點品種。7位側(cè)鏈具

有氨噻肟結(jié)構的頭孢菌素(7-氨噻肟頭孢菌素)，在增強對β-內(nèi)酰胺酶的穩(wěn)定性、改善抗菌譜等方面具有獨特的功能[3]，是第三代頭孢菌素的典型代表，且已逐漸發(fā)展為一大家族(圖1)，根據(jù)其3位側(cè)鏈的特點可分為2組，第1組：主要為口服頭孢菌素，其3位的R2基團不易解離；第2組：為注射用頭孢菌素，其3位的R2基團易被水解。已知7-氨噻肟結(jié)構中的自由氮基通過攻擊另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)可形成聚合物[4-5]；此外，根據(jù)對青霉素聚合反應機理的認知[2]，頭孢菌素還可以通過羧基攻擊另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生聚合反應；而各國藥典中給出的頭孢噻肟二聚物結(jié)構(圖2a)提示，氨噻肟結(jié)構中的氨基還可以與3位側(cè)鏈發(fā)生聚合反應。由于頭孢菌素的3位側(cè)鏈和6元環(huán)結(jié)構較青霉素母核更不穩(wěn)定[6]，聚合物易發(fā)生多種降解反應，使得對頭孢菌素聚合物結(jié)構的分析較青霉素更加困難。伴隨著科學技術的進步，近年來人們對β-內(nèi)酰胺抗生素聚合物的聚合反應機理、結(jié)構等的認知不斷完善，對7-氨噻肟頭孢菌素的聚合物分析也取得了較大的進展[7-12]，但在利用LC-MS進行結(jié)構解析中也遇到一些困惑。本文對近年來的工作進行回顧性總結(jié)，希望形成相對系統(tǒng)地對該類抗生素聚合物分析及利用LC-MS進行結(jié)構解析的策略與方法，進而指導對其他頭孢菌素聚合物的分析。

1 7-氨噻肟頭孢菌素聚合物

頭孢唑肟鈉與頭孢噻肟鈉是氨噻肟頭孢菌素的典型代表結(jié)構(圖1)，前者沒有3位側(cè)鏈，后者的3位側(cè)鏈易被水解。分別采用凝膠色譜-柱切換-質(zhì)譜分析技術[2]分析二者強制聚合溶液中的聚合物雜質(zhì)：在頭孢噻肟鈉的強制聚合溶液中，主要聚合物為氨基與3位側(cè)鏈反應(聚合反應I)形成的二聚體(圖2a)，沒有發(fā)現(xiàn)羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)聚合形成的二聚體[10]；在頭孢唑肟中僅發(fā)現(xiàn)氨基與β-內(nèi)酰胺環(huán)反應(聚合反應Ⅱ)形成的一對二聚體非對映異構體(圖2b)，也沒能發(fā)現(xiàn)羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)的聚合反應產(chǎn)物(圖2c)[13-14]。上述結(jié)果提示，在7-氨噻肟頭孢菌素的聚合反應中，氨基是主要的聚合活性位點，羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)的聚合反應不易發(fā)生。進一步分析頭孢噻肟鈉中的各類聚合物(圖3A)，在按聚合反應I形成的聚合物中，主要聚合產(chǎn)物為二聚體(簡稱二聚體I)，沒能發(fā)現(xiàn)聚合反應Ⅱ形成的二聚體(簡稱二聚體Ⅱ)，但發(fā)現(xiàn)多個二聚體Ⅱ側(cè)鏈水解形成的水解產(chǎn)物。由頭孢菌素的降解反應機理[15-16]可知，理論上二聚體Ⅱ的側(cè)鏈水解可形成4種不同的水解產(chǎn)物，將其分別命名為水解物I-Ⅳ(圖3B)；圖3A的結(jié)果提示，第2組頭孢菌素由于其3位具有易解離基團，形成的二聚體Ⅱ不穩(wěn)定，在強制降解反應中易被進一步水解成不同的水解物。

2 7-氨噻肟頭孢菌素聚合物的特性

第2組氨噻肟頭孢菌素(圖1)中的聚合物主要為聚合反應I的產(chǎn)物。以二聚體I為例，它們具有相似的二級質(zhì)譜圖(圖4A)，共性裂解途徑產(chǎn)生m/z791、m/z636和m/z396的碎片離子，其中b裂解是重要的特征裂解片途徑(圖4B)。由于二聚體I分子呈線性構型(圖5A)，該特性不僅使其易形成高聚合度的多聚體，如在頭孢噻肟鈉中已發(fā)現(xiàn)三聚體、四聚體[10]，且使得多聚體具有與二聚體相似的質(zhì)譜裂解途徑(圖5B)，對二聚體I特征裂解途徑的認知，對三聚體、四聚體的解析具有重要的意義(圖5C)。

分析聚合反應Ⅱ產(chǎn)物的質(zhì)譜裂解特性。以頭孢唑肟二聚體為例(圖6A)，其共性裂解途徑可產(chǎn)生m/z624、m/z481、m/z449和m/z383的特征離子，并易產(chǎn)生脫羥基、羧基等碎片離子，其中a裂解產(chǎn)生的頭孢唑肟[M+H]+峰是重要的特征裂解片途徑(圖6B)，是判斷二聚體Ⅱ水解物的重要依據(jù)；脫羧基反應(d裂解)與脫羥基反應同時存在，是判斷二聚體3位側(cè)鏈是否形成內(nèi)酯結(jié)構的重要依據(jù)。

3 7-氨噻肟頭孢菌素聚合物的衍生物/降解物

3.1 3位側(cè)鏈水解物

第2組頭孢菌素的3位側(cè)鏈易發(fā)生水解反應，如何判斷聚合物中側(cè)鏈的水解位置是推測水解物結(jié)構的關鍵。質(zhì)譜裂解途徑結(jié)合RP-HPLC保留值分析是較好的分析策略。

比較頭孢曲松二聚體Ⅱ不同側(cè)鏈水解物的空間構型(圖7A)，水解物Ⅲ和水解物Ⅳ的空間構型較對應的水解物Ⅰ和水解物Ⅱ更松散，使其保留值較水解物Ⅰ和水解物Ⅱ大；水解物Ⅱ和水解物Ⅳ分別較水解物Ⅰ和水解物Ⅲ的空間構型更緊湊，故水解物Ⅱ/水解物Ⅳ中至少一個異構體的保留值較水解物Ⅰ/水解物Ⅲ更小。即利用RP-HPLC的保留值可幫助判斷聚合物水解物的水解位點。頭孢噻肟聚合物的RPHPLC分析較好地驗證了上述規(guī)律(圖3A)。

以對頭孢噻肟二聚體水解物(MW850)的分析為例說明質(zhì)譜解析二聚體水解物的過程。雖然二聚體Ⅱ側(cè)鏈水解形成的羥基體或內(nèi)酯結(jié)構(圖3)的分子量均可為850 Da，但二級質(zhì)譜圖(圖7B)中僅見脫羧基碎片，未見脫羥基碎片，提示其可能為內(nèi)酯結(jié)構；結(jié)合頭孢噻肟鈉的質(zhì)譜裂解規(guī)律[17]，質(zhì)譜圖中m/z456的碎片峰及可由頭孢噻肟分子裂解產(chǎn)生的m/z396、m/z353、m/z324和m/z227特征離子，提示m/z456的碎片峰為頭孢噻肟的[M+H]+加合離子峰；再結(jié)合保留值推測其為頭孢噻肟二聚體Ⅱ水解物Ⅳ(圖7C)。

3.2 3位丙烯基異構化產(chǎn)物

第1組7-氨噻肟頭孢菌素中3位具有丙烯基結(jié)構的頭孢菌素(圖1)如頭孢丙烯、頭孢克肟，主要通過聚合反應Ⅱ應形成聚合物，R1結(jié)構的差異對聚合反應沒有明顯影響，但聚合過程中β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)易形成γ-內(nèi)酯并發(fā)生異構化，使得聚合物呈多種異構體。如頭孢地尼的3位的丙烯基結(jié)構在酸性及中性條件下異構化，理論上可形成8種異構體(具有3個手性位點)[18-19]，提示頭孢地尼二聚體(二聚體Ⅱ)也可能在聚合中形成多種具有相同分子量的二聚體γ-內(nèi)酯。如在分析頭孢地尼聚合物時[12]，雜質(zhì)Unk-7-10四個雜質(zhì)峰的一級和二級質(zhì)譜圖完全一致，它們的相對分子質(zhì)量均為790 Da；結(jié)合頭孢地尼的質(zhì)譜裂解規(guī)律[17]分析其可能的裂解途徑：二級質(zhì)譜圖中僅發(fā)現(xiàn)m/z744的脫羧基碎片，m/z773的脫羥基碎片不明顯，且發(fā)現(xiàn)m/z158的特征碎片，提示3位側(cè)鏈為內(nèi)酯結(jié)構；而特征的m/z396和m/z242離子碎片，提示形成了頭孢地尼[M+H]+加合離子峰，進而推測出二聚體γ-內(nèi)酯的異構化位點(圖8)。

比較頭孢地尼、頭孢克肟二聚體和其γ-內(nèi)酯在RP-HPLC中的保留值，二者γ-內(nèi)酯的保留值均大于二聚體，該結(jié)果也可用于對聚合物結(jié)構的驗證。

3.3 7位側(cè)鏈衍生物

采用凝膠色譜-柱切換-質(zhì)譜技術分析頭孢他啶中的聚合物[8]，發(fā)現(xiàn)兩個分子量為1159 Da的聚合物雜質(zhì)(HPSEC-2a 和HPSEC-2c)，比頭孢他啶二聚體Ⅰ的分子量多146 Da，命名為頭孢他啶二聚體衍生物I；同時，發(fā)現(xiàn)2個為692 Da的雜質(zhì)(HPSEC-4a和HPSEC-4b)，比頭孢他啶的分子量多146 Da；此外，還發(fā)現(xiàn)兩個分子量為1115 Da的聚合物雜質(zhì)(HPSEC-3c和HPSEC-3f)，比頭孢他啶二聚體衍生物I的分子量少44 Da，命名為頭孢他啶二聚體衍生物Ⅱ；依據(jù)質(zhì)譜分析結(jié)果，推測他們的取代位點均為7位側(cè)鏈。雖然文獻[8]對他們的可能結(jié)構進行了推斷，但無法合理解釋在強制聚合溶液中他們的形成機制。由于HPSEC-2a和HPSEC-2c的二級質(zhì)譜圖基本相同，HPSEC-4a和HPSEC-4b的二級質(zhì)譜圖基本相同，推測他們的產(chǎn)生途徑相似，因此，對分子量為692的雜質(zhì)的結(jié)構解析，將有助于推測頭孢他啶二聚體衍生物Ⅰ的結(jié)構。

由頭孢菌素的降解反應機理可知，伴隨著β-內(nèi)酰胺環(huán)的開環(huán)，可發(fā)生系列重排、降解反應[15-16]。依據(jù)該降解反應機理，頭孢他啶二聚體Ⅰ水解可以形成分子量為692的頭孢他啶降解物，該衍生物為順反異構體(圖9A)，這可以較好地解釋頭孢他啶二聚體衍生物I的來源，即由頭孢他啶7位側(cè)鏈的氨基與該降解物的3位側(cè)鏈聚合產(chǎn)生(圖9B)。而頭孢他啶二聚體衍生物Ⅱ則可能是分子量為692的頭孢他啶降解物進一步脫羧，形成分子量為648的降解物(圖9A)，該降解物與另一分子頭孢他啶按聚合反應Ⅱ途徑聚合，同時3位側(cè)鏈水解形成內(nèi)酯，產(chǎn)生分子量為1115 Da的二聚體衍生物Ⅱ，對其質(zhì)譜裂解途徑的分析(沒有發(fā)現(xiàn)頭孢他啶的分子離子峰，證明其為水解物Ⅲ)支持所推測結(jié)構的正確性(圖9C)。

3.4 氨基與羧基?；磻撍?/h3>

在對頭孢噻肟、頭孢克肟和頭孢他啶的聚合物分析中，分別發(fā)現(xiàn)分子量為832 Da(HPSEC-4)、分子量為888 Da(HPSEC-3h)和分子量為1541 Da(HPSEC-3g, 3h)的聚合物雜質(zhì)，他們均被認為由氨基與羧基的?；磻a(chǎn)生，但HPSEC-4被認為是頭孢噻肟二聚體I的分子內(nèi)脫水產(chǎn)物[10]，HPSEC-3h被認為是頭孢克肟分子間脫水形成的二聚體[11]，HPSEC-3g, 3h被認為是頭孢他啶分子間脫水形成的三聚體[8]。雖然對青霉素分子聚合反應的理論計算表明，藥物分子側(cè)鏈的氨基與另一分子2位羧基的反應較其他聚合反應途徑較難發(fā)生[20]，但上述結(jié)果提示，在強制聚合過程中7-氨噻肟頭孢菌素中的氨基與母核羧基的?；磻_已發(fā)生，但究竟更易發(fā)生分子內(nèi)?；磻€是分子間酰化反應尚不能給出明確的答案。

頭孢噻肟二聚體I整個分子呈線性構型(圖5A)，氨基與羧基在分子的兩端，不利于發(fā)生分子內(nèi)的酰化反應；對頭孢克肟二聚體差向異構體的空間構型分析同樣得出其不利于發(fā)生分子內(nèi)的?；磻慕Y(jié)論(圖10A)；故認為理論上7-氨噻肟頭孢菌素的氨基與羧基的分子間酰化反應更容易發(fā)生。重新推測頭孢噻肟中HPSEC-4雜質(zhì)(MW832)的可能結(jié)構，認為其更可能為頭孢噻肟分子間脫水形成的二聚體水解物，質(zhì)譜裂解途徑分析支持新推測結(jié)構的合理性(圖10B)。同理，頭孢他啶三聚體的空間構型也不利于氨基與羧基發(fā)生分子內(nèi)的?；磻?。重新推測HPSEC-3g,3h(分子量為1541 Da的頭孢他啶三聚體脫水物)的可能結(jié)構：由于二者的二級質(zhì)譜圖相似，提示二者為同分異構體，可能為聚合反應Ⅱ的產(chǎn)物；未發(fā)現(xiàn)特征的m/z547碎片，提示質(zhì)譜分析中未產(chǎn)生特征的頭孢他啶[M+1]+峰；結(jié)合已知的頭孢菌素質(zhì)譜裂解規(guī)律，對其質(zhì)譜圖中的碎片峰進行歸屬，認為其最可能結(jié)構是頭孢他啶二聚體Ⅱ的羧基與另一分子頭孢他啶的氨基發(fā)生的分子間酰化產(chǎn)物的水解物(圖10C)。

3.5 二聚體脫氫物

采用LC-MS法分析頭孢克肟中的雜質(zhì)unk-6和unk-7，二者的分子量均為904 Da，較頭孢克肟二聚體少2 Da，提示發(fā)生了脫氫反應；二者的二級質(zhì)譜圖差異明顯(圖11A)，在RP-HPLC中的保留值相差也較大，提示二者的結(jié)構可能不完全不同。文獻[11]認為二者的結(jié)構相同，且所推測的結(jié)構無法從機理上解釋在強制聚合溶液(偏堿性水溶液)中他們的產(chǎn)生過程。由頭孢地尼的異構化機理[18-19]可知，β-內(nèi)酰胺開環(huán)可導致3位側(cè)鏈的雙鍵轉(zhuǎn)移，使得氫化噻嗪環(huán)中的電子云分布發(fā)生變化，進而發(fā)生雙鍵的重排，形成脫氫反應(圖11B)。分子量為904 Da的頭孢克肟脫氫二聚體，可以先按氨基與β-內(nèi)酰胺環(huán)聚合(聚合反應Ⅱ)途徑形成二聚體，再脫氫形成頭孢克肟脫氫二聚體Ⅰ(圖11C)，也可以先按羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)聚合形成二聚體(不含氨基頭孢菌素的常見聚合反應途徑)，再脫氫形成頭孢克肟脫氫二聚體Ⅱ(圖11D)。從聚合反應機理的角度，脫氫二聚體Ⅰ較脫氫二聚體Ⅱ更易產(chǎn)生；LogP值的計算提示脫氫二聚體Ⅱ的極性更大，在RP-HPLC中的保留值應較小；強制聚合溶液分析顯示，Unk-7的保留值較Unk-6大，其產(chǎn)生量也較Unk-6大，因此推測Unk-7可能為脫氫二聚體I，Unk-6可能為脫氫二聚體Ⅱ。結(jié)合頭孢菌素的質(zhì)譜裂解規(guī)律，分別對二者質(zhì)譜圖中的碎片峰進行歸屬：Unk-7中m/z736和m/z768的特征裂解碎片，提示分子中存在完整的β-內(nèi)酰胺環(huán)結(jié)構，裂解途徑分析支持Unk-7可能為脫氫二聚體I(圖11C)； Unk-6的質(zhì)譜裂解途徑分析支持其可能為脫氫二聚體Ⅱ(圖11D)。

3.6 氫化噻嗪環(huán)降解物

按聚合反應Ⅱ等途徑形成的頭孢菌素聚合物分子中通常含有β-內(nèi)酰胺環(huán)開環(huán)結(jié)構，開環(huán)分子中的氫化噻嗪環(huán)可進一步水解形成巰基，繼而再發(fā)生重排、水解等降解反應[15-16]。如頭孢克肟強制降解溶液中的雜質(zhì)Unk-5(MW828)、HPSEC-3i(MW797)等。

對頭孢克肟雜質(zhì)Unk-5進行解析。雖然分子量為828 Da的降解物可能由氨基與β-內(nèi)酰胺環(huán)形成的二聚體降解產(chǎn)生，也可能由羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)形成的二聚體降解產(chǎn)生，但其質(zhì)譜圖中m/z811、m/z783、m/z739的特征碎片峰提示分子中存在完整的β-酰胺環(huán)，未發(fā)現(xiàn)m/z454的頭孢克肟[M+H]+峰，僅出現(xiàn)特征的m/z545碎片(β-內(nèi)酰胺環(huán)裂解產(chǎn)生)；進而推測其可能為羧基與β-內(nèi)酰胺環(huán)形成的頭孢克肟二聚體的降解產(chǎn)物，對其可能的質(zhì)譜裂解途徑分析見圖12A。而對雜質(zhì)HPSEC-3i(MW797)的解析，提示其是由氨基與β-內(nèi)酰胺環(huán)形成的頭孢克肟二聚體降解產(chǎn)生(圖12B)。

4 總結(jié)

7-氨噻肟頭孢菌素的聚合反應主要與7位側(cè)鏈的氨基有關。對3位不含可解離基團的第1組頭孢菌素，聚合反應主要由氨基攻擊另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)發(fā)生，聚合物為一對差向異構體；對3位具有可解離基團的第2組頭孢菌素，聚合反應既可通過氨基攻擊另一分子的3位側(cè)鏈(聚合反應Ⅰ)發(fā)生，也可以通過氨基攻擊另一分子的β-內(nèi)酰胺環(huán)(聚合反應Ⅱ)發(fā)生。

由頭孢菌素的結(jié)構特點可知，其聚合物結(jié)構具有不穩(wěn)定性，進而導致了聚合物結(jié)構的多樣性。如第1組具有丙烯基結(jié)構的頭孢菌素，其易形成γ-內(nèi)酯并發(fā)生差向異構化，理論上二聚體可以形成8種γ-內(nèi)酯；第2組頭孢菌素，其3位側(cè)鏈易水解形成羥基體、內(nèi)酯結(jié)構，理論上每一種由聚合反應Ⅱ形成的二聚體水解可形成8種異構體。此外，氨噻肟頭孢菌素聚合物中還發(fā)現(xiàn)一些偶見的特殊衍生物/降解物，包括：7位氨基衍生物，如頭孢他啶、頭孢甲肟中發(fā)現(xiàn)較二聚體I多146 Da的二聚體衍生物等；氫化噻嗪環(huán)水降解物，如分子量為828 Da的頭孢克肟二聚體降解物等；3位丙烯基結(jié)構脫氫物，如頭孢克肟脫氫二聚體等。而7-氨噻肟頭孢菌素中的偶見聚合反應途徑，如側(cè)鏈的氨基與另一分子母核羧基的?；磻负说聂然袅硪环肿应?酰胺環(huán)的聚合反應，更使得7-氨噻肟頭孢菌素的聚合物具有高度的復雜性。

針對頭孢菌素聚合物的結(jié)構特點，采用LC-MS技術推測聚合物的結(jié)構時，首先應根據(jù)具體頭孢菌素的結(jié)構確定其最可能的聚合反應途徑；其次根據(jù)LC-MS給出的分子量信息及對頭孢菌素降解反應的認知，推測出各種可能的結(jié)構；第三，基于對頭孢菌素及聚合物質(zhì)譜裂解規(guī)律的認知，對聚合物二級質(zhì)譜中的主要碎片峰進行歸屬，確認最可能的結(jié)構；最后利用RP-HPLC的保留值驗證所確認結(jié)構的正確性。

雖然頭孢菌素聚合物的結(jié)構具有多樣性，然而在對實際樣品的分析時發(fā)現(xiàn)通常存在明顯的指針性聚合物，如第1組頭孢菌素的二聚體，第2組頭孢菌素的二聚體I，他們的含量可基本表征產(chǎn)品中總聚合物的水平，使得利用更專屬的RP-HPLC方法控制產(chǎn)品中的聚合物含量成為可能。