曹麗婷，徐 薇，呂 軍，高 冰，馬寶慧

(1.包頭醫(yī)學(xué)院2019級(jí)研究生，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2.包頭醫(yī)學(xué)院公共衛(wèi)生學(xué)院；3.包頭醫(yī)學(xué)院生理教研室)

氟是人體必需的元素之一，廣泛存在于生物系統(tǒng)和外部環(huán)境中。世界衛(wèi)生組織推薦氟化物的最小日攝入量不超過0.5 mg/L[1]。適量的氟攝入有益于生命體正常活動(dòng)，但過量氟暴露可引起人體各器官組織損傷，如氟中毒致神經(jīng)損傷[2]，燃煤型氟中毒致大鼠肝損傷[3]與腎臟損傷[4]。深入研究氟中毒損傷機(jī)制發(fā)現(xiàn)，氟中毒會(huì)引起細(xì)胞凋亡，如氟中毒會(huì)導(dǎo)致大鼠腎臟、神經(jīng)細(xì)胞等出現(xiàn)細(xì)胞凋亡[5]。研究表明，過量氟暴露可能影響心血管功能，其中從人群流行病學(xué)、動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)等不同角度的研究顯示，高氟暴露對(duì)心臟損傷、血管硬化、高血壓、高血脂等心血管疾病有影響[6]。目前氟中毒致心肌細(xì)胞損傷的具體分子機(jī)制尚不十分明確。現(xiàn)已有研究報(bào)道，在物理、化學(xué)或應(yīng)激刺激下p38MAPK被激活，在氧化應(yīng)激、細(xì)胞凋亡和血管收縮等過程發(fā)揮著重要作用[7]，p38MAPK被磷酸化激活后，誘導(dǎo)Caspase-3、Caspase-9介導(dǎo)的凋亡通路，進(jìn)而引起細(xì)胞凋亡[8]。然而NaF是否通過誘導(dǎo)p38MAPK的表達(dá)，進(jìn)而造成心肌細(xì)胞損傷鮮見報(bào)道。本研究通過體外培養(yǎng)H9c2心肌細(xì)胞，制備48 h氟染毒模型，檢測(cè)不同濃度的氟化鈉(NaF)對(duì)H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)、活力及p38MAPK表達(dá)的影響，旨在觀察氟中毒對(duì)H9c2心肌細(xì)胞產(chǎn)生的作用。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組 實(shí)驗(yàn)選用H9c2細(xì)胞購自北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院的細(xì)胞資源中心國家實(shí)驗(yàn)細(xì)胞資源共享服務(wù)平臺(tái)。凍存于-80 ℃中備用，復(fù)蘇后用含10 %胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)基在37 ℃、5 % CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。設(shè)定NaF染毒劑量分別為10、20、40 mg/L三組，對(duì)照組不加NaF。

1.2儀器及試劑 CO2培養(yǎng)箱(Thermo，美國)，超速低溫(Thermo，美國)，冷凍離心機(jī)(Thermo，美國)，NanoDroP-2000微量核酸蛋白定量?jī)x(Thermo，美國)，ELX-800全自動(dòng)酶標(biāo)儀(Thermo，美國)，PTC-100 PCR儀(Thermo，美國)，7900HT實(shí)時(shí)熒光定量PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems，美國)，TE2000-U倒置相差顯微鏡(Nikon，日本)。NaF(大茂化學(xué)試劑廠，天津市)，Cell Counting Kit-8(博士德，中國)，TUNEL檢測(cè)試劑盒(博士德，中國)，DAB顯色試劑盒(博士德，中國)，反轉(zhuǎn)錄試劑盒(Thermo，美國)，BCA試劑盒(Thermo，美國)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑(Thermo，美國)。

1.3方法

1.3.1CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞活力 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，加入96孔板的對(duì)應(yīng)孔中，并加入培養(yǎng)基，空白孔加入PBS，放于恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)24 h。24 h后棄舊培養(yǎng)基，用PBS清洗。按對(duì)照組和10、20、40 mg/L NaF染毒劑量分為四組，每組5個(gè)復(fù)孔，加入培養(yǎng)基與對(duì)應(yīng)劑量NaF，空白孔加入等體積PBS，加樣好的96孔板放于5 % CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱染毒培養(yǎng)48 h。再加入CCK-8試劑(CCK-8試劑∶處理液=1∶10)，加入CCK-8試劑孵育1 h后酶標(biāo)儀檢測(cè)，設(shè)定酶標(biāo)儀波長(zhǎng)為450 nm，檢測(cè)吸光度值并按細(xì)胞存活率=[(染氟孔-空白孔)/(對(duì)照孔-空白孔)]×100% 統(tǒng)計(jì)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.2TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞形態(tài)及凋亡 收集對(duì)數(shù)期細(xì)胞且細(xì)胞形態(tài)良好，制備細(xì)胞懸液，離心后棄上清，PBS清洗1次。將細(xì)胞接種于24孔板中的細(xì)胞爬片上，培養(yǎng)24 h。加入對(duì)應(yīng)濃度NaF染毒，培養(yǎng)48 h。根據(jù)說明書處理細(xì)胞，顯色。蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。用熒光倒置顯微鏡觀察。

1.3.3實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)p38MAPK表達(dá) 細(xì)胞按分組染毒48 h后，收集細(xì)胞提取總RNA，并測(cè)定RNA濃度。根據(jù)Thermo反轉(zhuǎn)錄試劑盒與2×Real-time PCR Mix說明書對(duì)總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄并擴(kuò)增。按照2-△△Ct計(jì)算基因相對(duì)表達(dá)水平，以β-actin為內(nèi)參，引物序列(目的基因與內(nèi)參基因引物序列)，見表1。

表1 引物序列

2 結(jié)果

2.1氟化鈉對(duì)心肌細(xì)胞活力的影響 與對(duì)照組相比，H9c2細(xì)胞暴露于NaF 48 h后，細(xì)胞活力降低；且隨著NaF濃度的增加，細(xì)胞活力明顯下降(P<0.05)。見圖1。由此可以推斷，長(zhǎng)期暴露于NaF中會(huì)抑制H9c2心肌細(xì)胞的活力，并且抑制程度與染毒劑量密切相關(guān)。

圖1 NaF對(duì)H9c2心肌細(xì)胞活力的影響

2.2氟化鈉對(duì)心肌細(xì)胞形態(tài)與細(xì)胞凋亡的影響 在熒光倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)的變化，對(duì)照組心肌細(xì)胞間隙均勻，細(xì)胞呈長(zhǎng)梭形，完整且明顯，僅有少量凋亡表現(xiàn)；與對(duì)照組相比，隨著NaF處理濃度增加，H9c2心肌細(xì)胞間隙增大，細(xì)胞腫脹變圓，長(zhǎng)梭狀形態(tài)不明顯，呈不規(guī)則樣，細(xì)胞凋亡明顯增加。見圖2。與對(duì)照組相比，染氟組染色陽性細(xì)胞增加(P<0.05)。見表2。

圖2 NaF對(duì)H9c2心肌細(xì)胞形態(tài)的影響

表2 NaF對(duì)H9c2心肌細(xì)胞凋亡的影響

2.3氟化鈉對(duì)心肌細(xì)胞p38MAPK mRNA表達(dá)的影響 H9c2心肌細(xì)胞暴露于NaF 48 h后，與對(duì)照組相比，心肌細(xì)胞中p38MAPK mRNA表達(dá)量增加，且p38MAPK mRNA表達(dá)量隨NaF處理濃度的增加而增加。見圖3。

圖3 NaF對(duì)H9c2細(xì)胞p38MAPK mRNA表達(dá)的影響

3 討論

適量氟可參與人體正常生命活動(dòng)，然而由于快速工業(yè)化、含氟殺蟲劑的使用和含氟城市水的排放，地表水的天然背景氟化物水平不斷增加[9-10]。長(zhǎng)期暴露于氟會(huì)導(dǎo)致機(jī)體多種器官損傷[11]，過量氟會(huì)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的發(fā)生。李新穎等[2]研究證實(shí)高劑量氟可促進(jìn)線粒體的氧化應(yīng)激和自噬，并誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡。細(xì)胞凋亡是細(xì)胞對(duì)生理或病理刺激信號(hào)產(chǎn)生的一種由多基因控制的主動(dòng)的細(xì)胞程序性細(xì)胞死亡(programmed cell death，PCD)。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，氟中毒致機(jī)體損傷的發(fā)病機(jī)制可能與細(xì)胞凋亡有關(guān)[12]。大量研究證實(shí)，氟中毒導(dǎo)致骨相疾病的產(chǎn)生[13-14]。在多項(xiàng)非骨相損傷的研究中發(fā)現(xiàn)，氟易與血液中的微量元素鈣、鎂等相結(jié)合，使鈣磷代謝平衡紊亂，從而引起一系列系統(tǒng)疾病[13]。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)期氟暴露誘導(dǎo)心血管疾病發(fā)生[6]，但目前氟中毒對(duì)心肌細(xì)胞損傷的機(jī)制仍不十分明確。在田曉琳[15]的研究中，過量氟暴露改變大鼠心臟功能及心肌組織病理及超微結(jié)構(gòu)，影響心肌損傷相關(guān)酶活力和產(chǎn)物水平，致心臟毒性損傷。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，染毒H9c2心肌細(xì)胞的細(xì)胞活力降低，與其結(jié)果一致。

H9c2心肌細(xì)胞染毒組加入NaF為10、20和40 mg/L，處理48 h后，通過TUNEL法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，隨著NaF濃度的增加，細(xì)胞凋亡明顯增加。結(jié)果說明細(xì)胞凋亡與染氟劑量相關(guān)。這與楊霞[16]的研究結(jié)果一致，其用不同濃度氟化鈉對(duì)H9c2心肌細(xì)胞進(jìn)行染毒培養(yǎng)，低劑量的氟對(duì)細(xì)胞的增殖沒有明顯影響，隨著NaF濃度的逐漸增大，氟對(duì)細(xì)胞增殖的抑制作用逐漸增強(qiáng)。楊霞[16]通過HE染色法觀察心肌細(xì)胞的形態(tài)變化，實(shí)驗(yàn)結(jié)果為對(duì)照組心肌細(xì)胞整體輪廓清晰，折光性好，細(xì)胞排列均勻，間隙小，形態(tài)自然，細(xì)胞核形態(tài)正常，處于細(xì)胞中間位置；實(shí)驗(yàn)組隨著NaF濃度增大，細(xì)胞外形扭曲，輪廓模糊，折光性降低，細(xì)胞體積變大，間隙變寬，出現(xiàn)多個(gè)細(xì)胞核，細(xì)胞變形數(shù)量增多，并且觀察到H9c2心肌細(xì)胞隨氟劑量的增加細(xì)胞凋亡亦增加。

p38MAPK是MAPK家族中的一員，屬于應(yīng)激激活蛋白激酶，是絲氨酸/蘇氨酸定向激酶，可被多種細(xì)胞外刺激激活，參與調(diào)控多種重要細(xì)胞活動(dòng)，例如細(xì)胞凋亡、分化和細(xì)胞增殖[17]。眾多學(xué)者研究中發(fā)現(xiàn)，激活p38MAPK信號(hào)通路可導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，當(dāng)抑制p38MAPK蛋白活性，可減輕大鼠心肌細(xì)胞凋亡，減輕心肌損傷、心功能障礙和室性心律失常，對(duì)大鼠心肌具保護(hù)作用[18-19]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明，p38MAPK mRNA表達(dá)量隨NaF處理濃度的增加而增加，進(jìn)而提示氟可能通過誘導(dǎo)p38MAPK的激活而引起心肌細(xì)胞凋亡。

綜上所述，過量氟暴露誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞發(fā)生形態(tài)損傷，抑制H9c2細(xì)胞增殖，同時(shí)對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，使其凋亡。在此過程中，p38MAPK mRNA表達(dá)水平隨NaF染毒劑量的增加顯著上調(diào)，提示氟可能通過誘導(dǎo)p38MAPK的激活而引起心肌細(xì)胞凋亡。在今后的研究中還將進(jìn)一步明確氟化鈉誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡與p38MAPK通路的關(guān)系。