楊妮，李逸民，李靜文，滕瑞敏，陳益，王雅慧，莊靜*

外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉綠素合成和熒光特性及關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

楊妮1，李逸民1，李靜文1，滕瑞敏1，陳益1，王雅慧2，莊靜1*

1.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，茶葉科學(xué)研究所，農(nóng)業(yè)部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210095

為探究外源5-氨基乙酰丙酸（5-ALA）在茶樹(shù)幼苗響應(yīng)干旱脅迫時(shí)對(duì)茶樹(shù)葉綠素合成和熒光特性的調(diào)控機(jī)理，以舒茶早為試驗(yàn)材料，PEG-6000模擬干旱脅迫環(huán)境，噴施5-ALA進(jìn)行處理，檢測(cè)茶樹(shù)幼苗葉片的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，進(jìn)一步測(cè)定葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)及關(guān)鍵酶基因的表達(dá)。結(jié)果顯示，外源5-ALA顯著提高干旱脅迫下茶樹(shù)葉片葉綠素a、葉綠素b、總?cè)~綠素的含量，緩解了最大熒光（）、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率[()]、PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（）、PSⅡ潛在活性（）、PSⅡ反應(yīng)中心光合電子傳遞效率（Electron transfer rate，）的下降，同時(shí)導(dǎo)致初始熒光（）、非光化學(xué)猝滅系數(shù)（）升高。外源5-ALA能誘導(dǎo)干旱脅迫下茶樹(shù)編碼葉綠素合成（、、）以及碳同化（、）相關(guān)酶基因的上調(diào)表達(dá)。研究表明，葉面噴施外源5-ALA能有效緩解干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)葉片葉綠素的降解及對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的損傷，維持茶樹(shù)葉片較高的光合活性，提高其光保護(hù)能力。

茶樹(shù)；5-氨基乙酰丙酸；干旱脅迫；葉綠素?zé)晒鈪?shù)；基因表達(dá)

隨著溫室效應(yīng)在全球范圍內(nèi)持續(xù)發(fā)生，水資源短缺、干旱、高溫成為長(zhǎng)期存在的全球性問(wèn)題。干旱造成的作物損失處于非生物脅迫的首位，嚴(yán)重影響農(nóng)業(yè)生產(chǎn)，制約農(nóng)業(yè)發(fā)展[1]。干旱脅迫往往會(huì)導(dǎo)致植物新陳代謝和基因表達(dá)發(fā)生變化，影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育和產(chǎn)量[2]。如何減少干旱對(duì)作物的損害，以及如何有效提高作物用水效率已成為世界各國(guó)共同關(guān)心的問(wèn)題。光合作用是植物最基本的生命活動(dòng)，需要依賴葉綠體進(jìn)行，葉綠素含量在一定程度上能反映植物光合性能的高低，可作為研究植物響應(yīng)干旱脅迫的指標(biāo)。葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)參數(shù)能夠快速準(zhǔn)確的反映植物葉片在光合作用過(guò)程中光合系統(tǒng)對(duì)光能的吸收、傳遞、耗散和分配等方面的情況[3-4]，并且在測(cè)定時(shí)不需要損傷植物器官、組織或細(xì)胞，有效地保證了研究的準(zhǔn)確性和可持續(xù)性。在植物的抗性研究中，葉綠素?zé)晒鈪?shù)能夠反映脅迫對(duì)光合作用的影響，是研究植物光合能力和抗逆性的重要指標(biāo)。

茶樹(shù)[(L.) O.Kuntze]是多年生常綠木本作物，是我國(guó)重要的經(jīng)濟(jì)作物。茶樹(shù)對(duì)生長(zhǎng)環(huán)境要求較高，極端溫度、干旱和高鹽等非生物脅迫在其生長(zhǎng)過(guò)程中頻繁出現(xiàn)，嚴(yán)重影響了茶樹(shù)的生長(zhǎng)發(fā)育，損害茶產(chǎn)業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)當(dāng)中人們使用化肥、農(nóng)藥和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑等來(lái)調(diào)節(jié)作物的生長(zhǎng)發(fā)育，以達(dá)到提高產(chǎn)量、改善品質(zhì)、防控病蟲(chóng)害、提高作物抗逆能力等目的。在選擇外源調(diào)節(jié)物質(zhì)時(shí)，無(wú)害性和安全性是茶樹(shù)首先考慮的因素。5-氨基乙酰丙酸（5-aminolevulinic acid，5-ALA）是四吡咯化合物（如亞鐵血紅素、卟啉、葉綠素和維生素B12）共同的前體物質(zhì)，也是調(diào)節(jié)四吡咯類物質(zhì)生物合成的關(guān)鍵代謝中間物，具有調(diào)節(jié)植物生命活動(dòng)的功能。5-ALA具有易降解、無(wú)殘留且對(duì)人體無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，這種特性對(duì)于茶樹(shù)而言十分重要。近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，5-ALA能夠明顯的提升作物光合效率[5-6]，提高作物產(chǎn)量，通過(guò)調(diào)節(jié)作物的內(nèi)含物質(zhì)來(lái)改善品質(zhì)[7-8]，還能顯著提高作物抗逆能力以抵抗逆境損傷[9-11]，在提高農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大潛力。

目前外源5-ALA對(duì)茶樹(shù)光合作用促進(jìn)機(jī)制以及干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)光合系統(tǒng)的研究較少，在園藝作物領(lǐng)域有關(guān)5-ALA的研究也主要集中在瓜果[12-13]、蔬菜[14-16]等作物上。本研究以茶樹(shù)舒茶早作為試驗(yàn)材料，利用5-ALA處理茶樹(shù)幼苗，同時(shí)用聚乙二醇-6000（PEG-6000，Polyethylene glycol-6000）模擬干旱脅迫，觀測(cè)干旱脅迫下外源5-ALA對(duì)茶樹(shù)幼苗葉片葉綠素含量和葉綠素?zé)晒鈪?shù)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。運(yùn)用熒光定量PCR技術(shù)研究葉綠素和碳同化相關(guān)基因在干旱及外源5-ALA處理下的表達(dá)模式，分析外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)光合能力的調(diào)節(jié)作用，旨在為茶樹(shù)的抗旱栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及試驗(yàn)設(shè)計(jì)

以兩年生的茶樹(shù)舒茶早（cv‘Shuchazao’）扦插幼苗為試驗(yàn)材料，種植于南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室植物生長(zhǎng)室內(nèi)。盆栽基質(zhì)為珍珠巖、蛭石和營(yíng)養(yǎng)土（體積比為1∶2∶3）。生長(zhǎng)室晝夜溫度為25/18℃，光照周期14/10?h·d-1、濕度(70±10)%、光強(qiáng)300?μmol·m-2·s-1。

選取植株健壯、無(wú)病害、無(wú)機(jī)械損傷且長(zhǎng)勢(shì)一致的茶苗進(jìn)行試驗(yàn)。設(shè)置5-ALA濃度為50?mg·L-1，配制100?mg·mL-1PEG-6000（10%PEG）溶液模擬干旱脅迫。將茶苗分為4組處理（表1）。

先對(duì)ALA和ALA+PEG處理組茶苗連續(xù)3?d葉面噴施50?mg·L-1的5-ALA，CK和PEG處理組連續(xù)3?d葉面噴施等量蒸餾水；第4天對(duì)PEG和ALA+PEG組茶苗進(jìn)行澆濕100?mg·mL-1PEG-6000溶液模擬干旱脅迫，另外兩組澆濕等量蒸餾水。于PEG分別處理0、6、24?h時(shí)取健康葉片，48?h后對(duì)所有處理組澆濕等量蒸餾水，做復(fù)水處理，72?h時(shí)再次取健康葉片。所取材料均迅速放入液氮中，然后放入–80℃冰箱保存。3次生物學(xué)重復(fù)。

1.2 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.2.1 葉綠素含量的測(cè)定

采用丙酮、無(wú)水乙醇、水3種液體的混合液浸提法測(cè)定葉綠素含量[17-18]。于0、6、24、72?h取茶苗頂部第2片葉，將其剪碎，取0.10?g放入10?mL混合液（丙酮∶無(wú)水乙醇∶水=4.5∶4.5∶1.0）中，置于暗處浸提至葉片完全變白（24?h）。以混合液為對(duì)照，使用MD iD5酶標(biāo)儀測(cè)定浸提液在645?nm和663?nm處的吸光值，最后計(jì)算葉綠素含量。

1.2.2 葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定

以PEG處理開(kāi)始，于0、6、24、72?h在每組處理中選出長(zhǎng)勢(shì)較為一致的3株茶苗，將茶苗用黑色不透光塑料袋完全罩住進(jìn)行30?min暗處理，然后使用德國(guó)WALZ公司生產(chǎn)的IMAGING-PAM調(diào)制葉綠素?zé)晒獬上裣到y(tǒng)對(duì)茶苗進(jìn)行葉綠素?zé)晒鈪?shù)的測(cè)定，包括基礎(chǔ)熒光（）、最大熒光（）、PSⅡ最大光化學(xué)量子產(chǎn)量（）、PSⅡ的潛在活性（）、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率[]、PSⅡ反應(yīng)中心光合電子傳遞效率（Electron transfer rate，）、光化學(xué)猝滅系數(shù)（）和非光化學(xué)猝滅系數(shù)（）。

1.2.3 總RNA提取和cDNA合成

葉片總RNA的提取按照北京華越洋生物科技有限公司Quick RNA Isolation Kit試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行，并用上海譜元儀器有限公司NanoDrop ND 1000微量紫外檢測(cè)儀測(cè)定其濃度，電泳檢測(cè)其完整性。使用寶生物工程（大連）有限公司Prime Script RT Reagent Kit試劑盒合成cDNA第一鏈。

1.2.4 茶樹(shù)葉綠素、光合作用相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定

表1 茶樹(shù)處理

表2 RT-qPCR引物序列

1.2.5 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

2 結(jié)果與分析

2.1 外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片葉綠素含量的影響

由表3可知，PEG處理0?h時(shí)，與CK相比，ALA處理顯著提高茶樹(shù)的葉綠素a和總?cè)~綠素含量，分別升高了15.18%和13.55%。

干旱脅迫6?h時(shí)，與0?h相比各組葉綠素含量都有不同程度的下降。與CK相比，PEG處理茶樹(shù)葉綠素含量雖有所下降但差異不顯著，ALA和ALA+PEG處理均顯著提高了茶樹(shù)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量。與PEG處理相比，ALA+PEG處理顯著提高茶樹(shù)的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，分別提高了20.20%、24.32%、20.59%。

干旱脅迫24?h時(shí)，與6?h相比各組葉綠素含量都有不同程度的下降。與CK相比，PEG處理顯著降低茶樹(shù)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，分別下降了18.87%、17.50%、18.49%；ALA處理的茶樹(shù)葉綠素a和總?cè)~綠素含量顯著上升；ALA+PEG處理組茶樹(shù)的葉綠素含量有所上升但差異不顯著。與PEG處理相比，ALA+PEG處理顯著提高茶樹(shù)的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，分別提高了25.58%、21.21%、24.37%。

與復(fù)水前相比，72?h時(shí)各組葉綠素含量都有所上升，說(shuō)明及時(shí)復(fù)水有利于茶樹(shù)葉綠素含量的恢復(fù)。與CK相比，PEG處理顯著降低茶樹(shù)的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，分別下降了24.59%、23.08%、24.22%；ALA和ALA+PEG處理組茶樹(shù)葉綠素b含量分別顯著上升了12.82%、10.27%，葉綠素a和總?cè)~綠素含量升高但差異不顯著。與PEG處理相比，ALA+PEG處理顯著提高茶樹(shù)的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，分別提高了38.04%、43.33%、39.34%。

2.2 外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片F(xiàn)o、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo的影響

由表4可知，PEG處理0?h時(shí)，與CK相比，ALA處理組茶樹(shù)的、、和有所上升但差異不顯著。

干旱脅迫6?h時(shí)，與CK相比，PEG處理組茶樹(shù)的顯著升高，、和顯著下降；ALA和ALA+PEG處理的茶樹(shù)葉綠素?zé)晒鈪?shù)與CK相比差異不顯著。與PEG處理相比，ALA+PEG處理組茶樹(shù)的顯著下降了25.00%，、和分別顯著升高了11.11%、10.39%、63.96%。

表3 外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片葉綠素a和葉綠素b以及總?cè)~綠素含量的影響

注：同一列中不同小寫字母表示在0.05水平有顯著差異，下同

Note: Different lowercase letters in the same column group mean significant difference at 0.05 level.The same below

表4 外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片F(xiàn)o、Fm、Fv/Fm和Fv/Fo的影響

干旱脅迫24?h時(shí)，與CK相比，PEG處理組茶樹(shù)的顯著升高了11.11%，、和分別顯著下降了21.67%、8.24%、36.38%；ALA處理組茶樹(shù)的顯著升高了11.33%，其他參數(shù)差異不顯著；ALA+PEG處理組茶樹(shù)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)差異不顯著。與PEG處理相比，ALA+PEG處理組茶樹(shù)的有所上升但差異不顯著，、和分別顯著升高了23.40%、6.41%和73.28%。

干旱脅迫48?h后復(fù)水，72?h時(shí)測(cè)量葉綠素?zé)晒鈪?shù)，研究噴施5-ALA和模擬干旱脅迫后，復(fù)水對(duì)茶樹(shù)光合系統(tǒng)的恢復(fù)效果。與復(fù)水前相比，PEG和ALA+PEG處理的茶樹(shù)有所恢復(fù)；與CK相比，PEG處理茶樹(shù)的上升，、和下降，但差異都不顯著；ALA和ALA+PEG處理茶樹(shù)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)與CK相比差異不顯著。與PEG處理相比，ALA+PEG處理茶樹(shù)的下降，、和上升，差異都不顯著。

2.3 外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉片Y(Ⅱ)、ETR、qP和qN的影響

由表5可知，PEG處理0?h時(shí)，與CK相比，ALA處理茶樹(shù)的、、和有所升高但差異不顯著。

干旱脅迫6?h時(shí)，與CK相比，PEG處理茶樹(shù)的、和分別顯著下降了48.28%、47.54%、30.91%，顯著升高了5.00%；ALA和ALA+PEG處理茶樹(shù)的葉綠素?zé)晒鈪?shù)與CK相比差異不顯著。與PEG處理相比，ALA+PEG處理茶樹(shù)的、和分別顯著升高了80.00%、73.93%、39.47%，有所下降但差異不顯著。

干旱脅迫24?h時(shí)，與CK相比，PEG處理茶樹(shù)的、和分別顯著下降了33.33%、33.45%、12.96%，也有所下降但差異不顯著；ALA處理茶樹(shù)葉綠素?zé)晒鈪?shù)與CK相比差異不顯著。與PEG處理相比，ALA+PEG處理茶樹(shù)的顯著升高了4.76%，其他葉綠素?zé)晒鈪?shù)有所上升但差異不顯著。

干旱脅迫48?h后復(fù)水，72?h時(shí)測(cè)量葉綠素?zé)晒鈪?shù)，研究噴施5-ALA和模擬干旱脅迫后，復(fù)水對(duì)茶樹(shù)光合系統(tǒng)的恢復(fù)效果。與復(fù)水前相比，PEG和ALA+PEG處理的茶樹(shù)有所恢復(fù)，與CK相比，PEG處理的茶樹(shù)葉綠素?zé)晒鈪?shù)仍有所下降但差異不顯著，ALA處理葉綠素?zé)晒鈪?shù)與CK相比差異不顯著，ALA+PEG處理茶樹(shù)顯著升高了6.02%，其他參數(shù)差異不顯著。與PEG處理相比，ALA+PEG處理茶樹(shù)的、下降，和升高，但差異不顯著。

表5 外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)Y（Ⅱ）、ETR、qP和qN的影響

2.4 外源5-ALA對(duì)干旱脅迫下茶樹(shù)葉綠素合成基因表達(dá)量的影響

由圖1可知，PEG處理0?h時(shí)，與CK相比，ALA處理顯著上調(diào)、、、、的表達(dá)，分別上調(diào)了213.59%、8.00%、71.29%、47.00%、18.00%。

干旱脅迫6?h時(shí)，與CK相比，PEG處理顯著下調(diào)、、、的表達(dá)；ALA處理顯著上調(diào)、、、、的表達(dá)；ALA+PEG處理顯著上調(diào)、、的表達(dá)。與PEG處理相比，ALA+PEG處理顯著上調(diào)、、、的表達(dá)，分別上調(diào)了75.00%、184.38%、40.48%、83.64%。

干旱脅迫24?h時(shí)，與CK相比，PEG處理顯著下調(diào)、、、的表達(dá)，分別下調(diào)了35.85%、23.64%、16.00%、15.12%；ALA處理顯著上調(diào)、、、的表達(dá)，的表達(dá)量有所上調(diào)但差異不顯著；ALA+PEG處理顯著上調(diào)、的表達(dá)，顯著下調(diào)、的表達(dá)。與PEG處理相比，ALA+PEG處理顯著上調(diào)、、、、的表達(dá)。

干旱脅迫48?h后復(fù)水，72?h時(shí)，與CK相比，PEG處理顯著下調(diào)、、、、的表達(dá)，分別下調(diào)了43.45%、28.89%、58.02%、20.59%、31.90%；ALA處理顯著上調(diào)、、的表達(dá)，分別上調(diào)了12.59%、138.27%、10.78%，的表達(dá)量差異不顯著；ALA+PEG處理顯著下調(diào)、、的表達(dá)，分別下調(diào)了24.83%、13.33%、22.41%，表達(dá)量有所上調(diào)但差異不顯著，顯著上調(diào)了130.86%。與PEG處理相比，ALA+PEG處理顯著上調(diào)、、、、的表達(dá)，分別上調(diào)了32.93%、42.71%、450.00%、11.11%、13.92%。

注：不同小寫字母表示在0.05水平有顯著差異

3 討論

葉綠素對(duì)植物光合作用過(guò)程中光能的傳遞、分配和轉(zhuǎn)化具有極其重要的作用，光合生物的光合速率和有機(jī)物的積累速率都與光合作用組織中葉綠素含量密切相關(guān)[22]。已有眾多研究表明，外源5-ALA可提高非生物脅迫下植物葉片內(nèi)葉綠素含量[23-27]。本研究中，PEG處理可明顯降低茶樹(shù)幼苗葉片內(nèi)葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，并且隨著干旱時(shí)間的延長(zhǎng)，脅迫程度加深，葉綠素含量逐漸降低，表明PEG處理影響了茶樹(shù)葉綠素合成的同時(shí)加速了已形成葉綠素的降解，這與符姿[28]發(fā)現(xiàn)干旱脅迫顯著降低了茶樹(shù)葉片葉綠素含量的研究結(jié)果相一致，也與Neisiani等[29]的研究結(jié)論相似。外源5-ALA的噴施顯著提高干旱脅迫下茶樹(shù)葉片葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量，表明外源5-ALA可以提高茶樹(shù)的光合能力，這可能是由于5-ALA是葉綠素合成的前體，可激發(fā)葉綠素合成途徑一系列催化酶活性，加快葉綠素的合成，與?？e[6]在草地早熟禾葉片和Song等[30]在羊草上的研究結(jié)果較為一致。復(fù)水后，各處理茶樹(shù)的葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量都有所回升，說(shuō)明輕度的干旱并沒(méi)有使茶樹(shù)葉片光合系統(tǒng)嚴(yán)重?fù)p壞，當(dāng)茶樹(shù)受到干旱脅迫時(shí)，及時(shí)補(bǔ)水可以使樹(shù)體有所恢復(fù)，這對(duì)茶園的旱災(zāi)恢復(fù)具有指導(dǎo)意義。

干旱脅迫會(huì)從多個(gè)方面影響植物的光合能力，主要包括損傷光合系統(tǒng)的各種機(jī)構(gòu)、影響光合作用中電子的傳遞和光合磷酸化，以及對(duì)參與暗反應(yīng)有關(guān)的酶造成影響[31]。近年來(lái)，在植物領(lǐng)域，越來(lái)越多的學(xué)者通過(guò)利用葉綠素?zé)晒鈩?dòng)力學(xué)的方法對(duì)植物進(jìn)行快速、靈敏、無(wú)損傷的探測(cè)，研究干旱脅迫對(duì)植物光合作用的影響[32-33]。葉綠體光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）反應(yīng)中心處于完全開(kāi)放時(shí)的熒光產(chǎn)量通常用o來(lái)表示[34-35]，一般與葉綠素含量有關(guān)，而當(dāng)反應(yīng)中心出現(xiàn)不易逆轉(zhuǎn)的破壞或失活時(shí)，通常會(huì)表現(xiàn)出增加的趨勢(shì)[36]。植物PSⅡ反應(yīng)中心處于完全關(guān)閉時(shí)的熒光產(chǎn)量用最大熒光表示，它能夠反映出通過(guò)PSⅡ的電子傳遞情況[37-38]。和o分別代表PSⅡ原初光能轉(zhuǎn)化效率和PSⅡ的潛在活性[31]；非環(huán)境脅迫條件下葉片的熒光參數(shù)較為穩(wěn)定，這一特性不會(huì)因?yàn)槲锓N和生長(zhǎng)條件而改變[39]。本研究中，與CK相比，PEG處理后茶樹(shù)的明顯升高，明顯下降，說(shuō)明干旱脅迫給茶樹(shù)的光合機(jī)構(gòu)造成了一定程度的破壞，限制了PSⅡ的電子傳遞，抑制了PSⅡ的光化學(xué)活性。同時(shí)，PEG處理后茶樹(shù)的和明顯低于CK，說(shuō)明干旱脅迫由于造成葉綠素的降解導(dǎo)致茶樹(shù)捕獲光能的效率變低，進(jìn)而降低了PSⅡ的原初光能轉(zhuǎn)化效率及潛在活性。經(jīng)5-ALA預(yù)處理的茶樹(shù)與CK相比，也有所增加，可能與5-ALA促進(jìn)了葉綠素合成提高其濃度有關(guān)。經(jīng)5-ALA預(yù)處理的茶樹(shù)在遭受干旱脅迫時(shí)其的增加程度明顯低于未處理茶樹(shù)，并且最大熒光顯著升高，說(shuō)明5-ALA對(duì)茶樹(shù)光系統(tǒng)Ⅱ（PSⅡ）具有保護(hù)作用，能夠緩解干旱對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心活性的降低，提升PSⅡ的光化學(xué)活性，這與鄧哲[40]和康博文等[41]的研究相似。此時(shí)，茶樹(shù)的和也明顯升高，說(shuō)明5-ALA可以有效抵御干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)PSⅡ反應(yīng)中心的傷害，使PSⅡ天線色素吸收的能量更多地流向光化學(xué)部分，減少以熒光形式散失的能量，從而使茶樹(shù)在干旱脅迫條件下保持較高的光化學(xué)效率，有利于光合作用進(jìn)行，5-ALA對(duì)茶樹(shù)光合機(jī)構(gòu)有明顯的保護(hù)作用，這與盧克歡等[13]的研究相似。復(fù)水后，各組茶樹(shù)的和有所上升，這可能與茶樹(shù)葉綠素含量的回升有關(guān)。PEG處理茶樹(shù)的和有所回升，說(shuō)明雖然干旱脅迫導(dǎo)致茶樹(shù)顯著下降，但是這種影響可以通過(guò)復(fù)水來(lái)消除，這可能與細(xì)胞吸水恢復(fù)正常生命活動(dòng)有關(guān)，與李曉梅等[42]的研究結(jié)果一致。

PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)效率[]代表反映機(jī)構(gòu)目前實(shí)際的光能轉(zhuǎn)換效率。植物吸收的光能有3個(gè)去向，分別是進(jìn)行光合作用、熱耗散和熒光。反映了植物光合作用的高低，主要代表的是質(zhì)體醌QA氧化還原狀態(tài)和PSⅡ反應(yīng)中心的開(kāi)放程度，通常情況下，增加主要是由QA電子傳遞能力增加引起的，而當(dāng)植物遭受到干旱脅迫時(shí)，其會(huì)受到脅迫的抑制而降低[43-44]。反映了植物耗散過(guò)剩光能為熱的能力，即光保護(hù)能力。代表PSⅡ反應(yīng)中心電子傳遞效率，與光合速率有較強(qiáng)的線性關(guān)系。本研究結(jié)果表明，與CK相比，干旱脅迫下茶樹(shù)葉片的()、、受到顯著抑制，推測(cè)可能與PSⅡ的光損傷有關(guān)，尤其的降低可能是損害了PSⅡ氧化側(cè)的放氧復(fù)合體的功能，減少了向PSⅡ反應(yīng)中心提供電子的數(shù)目。外源5-ALA在一定程度上緩解干旱脅迫導(dǎo)致的()、、降低，更高的表明外源的5-ALA預(yù)處理可減少干旱脅迫對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的損傷，維持電子供體和受體之間電子傳遞的速率，阻止QA的過(guò)度還原。外源5-ALA使干旱脅迫下茶樹(shù)葉片維持較高的，說(shuō)明5-ALA也能緩解茶樹(shù)光合作用的下降，這可能與外源5-ALA誘導(dǎo)了干旱脅迫下茶樹(shù)葉片內(nèi)編碼與電子傳遞速率相關(guān)基因的上調(diào)表達(dá)有關(guān)。當(dāng)植物遭受到干旱脅迫時(shí)，吸收過(guò)剩的光能必須通過(guò)熱耗散的形式來(lái)阻止光合作用器官的光損傷。干旱脅迫下，茶樹(shù)葉片的顯著高于CK，說(shuō)明干旱導(dǎo)致茶樹(shù)光合器官過(guò)剩光能增加，而為了避免QA的過(guò)度還原，茶樹(shù)會(huì)增加來(lái)進(jìn)行熱耗散，從而提高光保護(hù)能力。外源5-ALA可以提高茶樹(shù)的()，在干旱進(jìn)行到6?h時(shí)達(dá)到最大，而在干旱進(jìn)行到24?h時(shí)也顯著提高，說(shuō)明外源5-ALA能夠提高茶樹(shù)的光保護(hù)能力，但是響應(yīng)速度慢于提升茶樹(shù)光化學(xué)效率，可能是通過(guò)促進(jìn)光化學(xué)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)的，并非促進(jìn)非光化學(xué)猝滅，這與王嘉楠等[5]的研究相似?？偟膩?lái)說(shuō)，5-ALA可以通過(guò)提高光能捕獲與轉(zhuǎn)化效率，促進(jìn)光合作用來(lái)緩解干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)PSⅡ反應(yīng)中心的損傷，從而提高茶樹(shù)對(duì)干旱脅迫的耐受性。復(fù)水后，遭受干旱脅迫的茶樹(shù)各項(xiàng)指標(biāo)都有所回升，說(shuō)明干旱脅迫雖然對(duì)茶樹(shù)葉片PSⅡ反應(yīng)中心造成一定的損傷，抑制PSⅡ反應(yīng)中心的光化學(xué)活性和電子傳遞效率，進(jìn)而破壞了茶樹(shù)光合作用的原初反應(yīng)過(guò)程，但是這種破壞是可以通過(guò)復(fù)水來(lái)彌補(bǔ)的，這與張玉玉等[45]和未曉巍等[46]的研究相似。

高等植物的葉綠素生物合成過(guò)程十分復(fù)雜，由-谷氨酰-tRNA到葉綠素a和葉綠素b共有15個(gè)步驟，涉及15種酶催化反應(yīng)[47]。植物體內(nèi)ALA的合成是四吡咯物質(zhì)合成途徑的限速步驟，決定了葉綠素合成途徑的總流量，它是由谷氨酰-tRNA原酶（GluTR）和谷氨酸酯-1-半醛2,1氨基變位酶（GSA-AM）催化合成，其中由HEMA基因編碼的GluTR對(duì)ALA的合成起關(guān)鍵作用[48]。光合碳同化中的SBPase參與RuBP的再生[49]。TK在植物葉綠體的內(nèi)囊體膜上[50]，參與光合作用中碳的固定，TK在卡爾文循環(huán)當(dāng)中催化可逆反應(yīng)，被稱為“非調(diào)控酶”[51]，研究表明TK的活性通常與光合碳流量密切相關(guān)[52-53]，當(dāng)TK活性降低時(shí)，植物光合速率顯著降低，植物生長(zhǎng)受到抑制[54-55]。本研究中葉綠素合成和碳同化相關(guān)基因的表達(dá)分析表明，PEG處理下調(diào)、、、和基因的表達(dá)，而外源5-ALA能夠顯著上調(diào)這5個(gè)基因的表達(dá)，5-ALA預(yù)處理的茶樹(shù)在干旱脅迫下的基因表達(dá)水平顯著高于未處理茶樹(shù)，說(shuō)明5-ALA可能從轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控茶樹(shù)葉片葉綠素合成和碳同化相關(guān)酶基因表達(dá)，促進(jìn)葉綠素合成，加速光合器官碳同化進(jìn)程，提高干旱脅迫下茶樹(shù)保持光合水平的能力。

綜上所述，干旱脅迫下，外源施用5-ALA能顯著提高茶樹(shù)葉片的葉綠素含量，有效緩解、、、、、的下降以及、的升高，有效提高茶樹(shù)對(duì)干旱脅迫的耐受性，其機(jī)制可能是外源5-ALA能夠通過(guò)緩解干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)幼苗光合機(jī)構(gòu)的破壞和對(duì)電子傳遞的抑制，提高自身對(duì)干旱的耐性，維持光合能量耗散方式的平衡。同時(shí)，外源5-ALA可能通過(guò)調(diào)控茶樹(shù)葉片葉綠素合成和碳同化相關(guān)酶基因的表達(dá)，從轉(zhuǎn)錄水平上緩解干旱脅迫對(duì)茶樹(shù)葉片葉綠素的降解以及對(duì)PSⅡ反應(yīng)中心的損傷，維持茶樹(shù)葉片較高的光合活性，提高茶樹(shù)的光保護(hù)能力，但其在茶樹(shù)生理調(diào)控過(guò)程中具體機(jī)理還待進(jìn)一步探究。

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Effects of Exogenous 5-ALA on the Chlorophyll Synthesis and Fluorescence Characteristics and Gene Expression of Key Enzymes in Tea Plants under Drought Stress

YANG Ni1, LI Yimin1, Li Jingwen1, TENG Ruimin1, CHEN Yi1, WANG Yahui2, ZHUANG Jing1*

1.Ministry of Agriculture Key Laboratory of Biology and Germplasm Enhancement of Horticultural Crops in East China, Tea Research Institute, College of Horticulture, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2.State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China

In order to study the regulation mechanism of exogenous 5-aminolevulinic acid (5-ALA) on the chlorophyll synthesis and fluorescence characteristics of tea plants in response to drought stress, tea cultivar 'Shuchazao' was used as the experimental material in this study.Under PEG-6000 simulated drought stress environment and 5-ALA spraying pretreatment, the contents of chlorophyll a, chlorophyll b and total chlorophyll in tea seedling leaves were detected, and the chlorophyll fluorescence parameters and the expressions of key enzyme genes in tea leaves were further determined.The results show that exogenous 5-ALA significantly increased the contents of chlorophyll a, chlorophyll b and total chlorophyll in tea leaves under drought stress.Exogenous 5-ALA alleviated the decreases of maximum fluorescence (), actual photochemical efficiency of PSⅡ [()], maximum photochemical quantum yield of PSⅡ (), photochemical quenching coefficient (), potential activity of PSⅡ(), photosynthetic electron transfer rate () of PSⅡ reaction center, and the increases of initial fluorescence () and nonphotochemical quenching coefficient ().At the same time, exogenous 5-ALA induced the expressions of chlorophyll synthesis (,,) and carbon assimilation-related enzymes (,) in tea plant under drought stress.The study demonstrates that spraying exogenous 5-ALA can effectively alleviate the degradation of chlorophyll and damage to PSⅡ reaction center of tea leaves under drought stress, maintain the higher photosynthetic activity, and improve the photoprotection ability of tea leaves.

tea plant, 5-aminolevulinic acid, drought stress, chlorophyll fluorescence parameters, gene expression

S571.1

A

1000-369X(2022)02-187-13

2021-11-11

2021-12-23

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX(20)3114）、江蘇高校優(yōu)勢(shì)學(xué)科建設(shè)項(xiàng)目（PAPD）

楊妮，女，博士研究生，主要從事茶樹(shù)分子生物學(xué)研究，2021204040@stu.njau.edu.cn。*通信作者：zhuangjing@njau.edu.cn

（責(zé)任編輯：黃晨）