張 旭，譚可欣，李 嘉，薛崇祥，魯星妤，董慧靜，俞儀萱，胡紫馨，崔慧娟

（1.北京中醫(yī)藥大學 北京 100029；2.中日友好醫(yī)院，中西醫(yī)結(jié)合腫瘤內(nèi)科 北京 100029）

表皮生長因子受體抑制劑（epidermal growth factor receptor inhibitors；EGFRIs）已成為EGFR基因突變陽性的晚期肺癌、KRAS基因野生型的晚期結(jié)直腸癌等多種惡性腫瘤的一線標準治療方案，然而隨著其廣泛應(yīng)用，該藥物不良反應(yīng)的發(fā)生頻率越來越高。在EGFRIs 相關(guān)的不良反應(yīng)中，最常見的不良反應(yīng)為皮膚毒性，發(fā)生率最高可達100%［1］，其中又以皮疹最為常見［2］，已經(jīng)成為影響晚期腫瘤患者生活質(zhì)量的最主要因素［3］。

目前認為EGFRIs 相關(guān)皮疹的發(fā)生與角質(zhì)形成細胞的炎癥反應(yīng)等有較為明確的關(guān)系［4，5］，主要機制包括促炎因子和趨化因子的分泌異常［3，6］、角質(zhì)形成細胞的增殖和分化異常［7］等。在治療方面，國內(nèi)、外臨床指南均以他克莫司、多西環(huán)素、米諾環(huán)素等抗生素或激素外用或口服作為推薦的治療方案［8-12］，但臨床使用效果不盡人意，并未得到廣泛推廣。

既往文獻及研究發(fā)現(xiàn)［13，14］，中醫(yī)藥治療靶向藥相關(guān)皮疹具有較好的療效，且安全性較高，目前已被國內(nèi)的指南推薦應(yīng)用［12］。中醫(yī)認為，靶向藥所導(dǎo)致的皮疹等不良反應(yīng)可歸屬于中醫(yī)學“痤瘡”、“藥毒疹”、“肺風粉刺”等范疇。其病因、病機不外乎內(nèi)因和外因兩方面，內(nèi)因主要與稟賦不足有關(guān)，外因主要與藥毒及“風、濕、熱、毒、瘀”等壅塞于皮膚腠理等有關(guān)，內(nèi)外合邪，發(fā)為藥疹［12］。

有研究認為，EGFRIs 相關(guān)皮疹的病位雖然在皮膚，但因“皮毛為肺臟所主”，故究其根本，為肺經(jīng)之病變［15］。風熱襲肺，則可見皮疹、瘙癢、膿皰等癥。病程日久，導(dǎo)致氣陰兩傷，則可見皮膚干燥、脫屑等癥。故在皮疹治療上強調(diào)當以“清熱解毒、燥濕消腫、祛風止癢”為基本法則，使“熱可消、濕可去、風可?！?，則病可愈?；谪S富的臨床經(jīng)驗，崔教授創(chuàng)制了純中藥外用制劑止癢平膚液。

止癢平膚液主要由黃芩、苦參、白鮮皮、馬齒莧等藥物組成。其中黃芩為方中君藥，其性味苦寒，歸肺經(jīng)、大腸經(jīng)等，發(fā)揮清熱燥濕，瀉火解毒之效。苦參、馬齒莧二者共為臣藥，輔助君藥加強其清熱解毒之力。白鮮皮為佐使之藥，協(xié)助君臣增強清解熱毒之效，同時又可發(fā)揮其祛風止癢的療效。全方配伍嚴謹精妙，共奏清熱解毒、燥濕消腫、祛風止癢之功。

止癢平膚液作為臨床經(jīng)驗方，應(yīng)用于臨床已達10 年余，其對EGFRIs 相關(guān)皮疹的療效明確［16-18］，有效率在90%以上，目前已被納入專家共識［12］。本課題組基于既往臨床研究的基礎(chǔ)，進行了以下基礎(chǔ)實驗，旨在驗證其療效，為進一步的臨床應(yīng)用及研究提供更充足的證據(jù)，并為進一步的機制探討打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BN 大鼠，雌性，體重100～120 g，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。飼養(yǎng)環(huán)境為中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所醫(yī)學實驗動物平臺SPF 動物房［SYXK（京）2016-0043］。

1.2 實驗藥品和試劑

吉非替尼片：商品名易瑞沙，購于阿斯利康。止癢平膚液：主要成分為黃芩20 g、苦參20 g、白鮮皮30 g、馬齒莧30 g，由中日友好醫(yī)院藥學部制劑室提供。大鼠腫瘤壞死因子（TNF-α）ELISA 試劑盒和大鼠白介素-6（IL-6）ELISA 試劑盒均購置于Raybio 公司。

1.3 動物模型的構(gòu)建

BN 大鼠隨機分為空白組（Control group）和吉非替尼組（Gefitinib group），數(shù)量分別為6 只和21只?？瞻捉M不做任何干預(yù)；吉非替尼組大鼠予吉非替尼灌胃給藥。吉非替尼的給藥劑量為37.5 mg/kg q.d.，共給藥21 d。

1.4 分組處理

實驗第22 天，吉非替尼組大鼠再次進行分組，隨機分為模型組（Model group）6 只、吉非替尼+外用止癢平膚液組（Gefitinib+ZY）9 只、吉非替尼+外用生理鹽水組（Gefitinib+NS）6 只，并剃除大鼠背部毛發(fā)。各實驗組大鼠繼續(xù)予吉非替尼灌胃，用藥劑量同前。同時，Geftininb+ZY 組開始外用中藥止癢平膚液，Gefitinib+NS 組予以等劑量的生理鹽水外用。各實驗組中外用藥物劑量均為1.4 mL/只，每日1 次，給藥30 min 后用清水擦去皮膚上殘留藥物，連續(xù)給藥7 d。

1.5 監(jiān)測指標

1.5.1 皮疹嚴重程度分級 每日觀察大鼠皮膚表現(xiàn)并拍照記錄。在外用藥物干預(yù)前以及干預(yù)7 d 后對大鼠背部剃毛部位的皮疹進行詳細記錄并嚴格按標準進行分級［19］。見表1。

表1 MASCC 皮疹分級標準Tab 1 MASCC grading standards

1.5.2 皮膚炎癥狀態(tài)評分 在外用藥物干預(yù)前以及7 d 后對大鼠背部皮膚的炎癥狀態(tài)進行詳細記錄并按照評分標準進行嚴格評分［20］，即根據(jù)紅疹、脫屑、滲出、皮膚增厚等方面進行綜合評分。見表2。

表2 皮膚炎癥狀態(tài)評分Tab 2 Inflammation status score of skin

1.5.3 大鼠皮膚形態(tài)學變化 在實驗過程中用數(shù)碼相機對大鼠背部皮膚進行拍照記錄，動態(tài)觀察實驗過程中大鼠的皮膚形態(tài)學變化。

1.5.4 大鼠皮膚病理變化 皮膚取材后用10%福爾馬林溶液進行固定，經(jīng)石蠟包埋固定后進行切片。切片后進行標準的脫蠟、不同濃度梯度的乙醇脫水等標準處理，并進行蘇木素-伊紅（HE）染色，于光學顯微鏡100、200、400 倍視野下觀察皮膚病理變化。

1.5.5 大鼠血清中炎癥因子 ELISA 法測定大鼠血清中炎性因子腫瘤TNF-α、IL-6 含量。將BN 大鼠麻醉，取心尖部血液5 mL，靜置1～2 h，用離心機進行離心，離心后用移液槍吸取上清液約1 mL，保存在2 mL 的EP 管中，并儲存于?80 ℃冰箱中待測。按照試劑盒說明書進行實驗操作，最終測出樣本血清中目標炎癥因子的濃度并做好記錄。

1.6 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 20 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計分析，數(shù)據(jù)中計量資料以均數(shù)±標準差表示?？傮w資料服從正態(tài)分布或近似正態(tài)分布，運用t檢驗進行分析；若數(shù)據(jù)不符合正態(tài)分布，則運用非參數(shù)檢驗。多樣本均數(shù)的比較采用方差分析。藥物有效率比較時運用Fisher 確切概率法。檢驗標準α=0.05。

1.7 倫理批準

該研究經(jīng)中日友好醫(yī)院臨床醫(yī)學研究所醫(yī)學實驗動物平臺倫理委員會批準（編號：190114）。

2 結(jié)果

2.1 止癢平膚液可降低皮疹的分級

本實驗重點關(guān)注大鼠背部及耳后皮疹的情況。除空白組大鼠外，各組大鼠頸背部、耳后等均產(chǎn)生了不同程度的皮疹。通過對實驗結(jié)果進行分析發(fā)現(xiàn)，Model 組大鼠背部皮疹隨用藥時間延長而逐漸加重；在用中藥3 d 后Gefitinib+ZY 組大鼠皮疹開始減輕，用藥7 d 后共有8 只大鼠皮疹較用藥前明顯減輕甚至消失；Gefitinib+NS 組僅有1 只大鼠皮疹較用藥前好轉(zhuǎn)。在有效率方面，止癢平膚液有效率（88.89%）較生理鹽水有效率（16.67%）有顯著提高（P=0.001）。見表3。

2.2 止癢平膚液能降低皮膚炎癥評分，減輕炎癥反應(yīng)

在外用藥物干預(yù)前后對大鼠背部皮膚進行炎癥評分并記錄。通過統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)用中藥后，Gefitinib+ZY 組 炎 癥 評 分 較Model 組 和Gefi?tinib+NS 組均有明顯下降（P=0.001）；Gefitinib+ZY 組炎癥評分較用藥前也明顯下降（P=0.004）。見表4。

表4 皮膚炎癥狀態(tài)評分（±s）Tab 4 Skin inflammation status score（±s）

表4 皮膚炎癥狀態(tài)評分（±s）Tab 4 Skin inflammation status score（±s）

組別Control Model Gefitinib+NS Gefitinib+ZY n 6 6 9 6干預(yù)前0±0 4.667±1.328 5.833±1.472 5.889±1.900干預(yù)后0±0 7.500±2.345 7.667±2.503 3.111±1.054

2.3 皮膚形態(tài)學變化

2.3.1 動物模型構(gòu)建階段 從圖1 中可以得知，空白組在實驗前后皮膚表現(xiàn)未見明顯改變，而吉非替尼組大鼠在吉非替尼灌胃21 d 后，皮膚上出現(xiàn)了典型的紅色丘疹、滲出、結(jié)痂等皮膚炎癥表現(xiàn)，與臨床和文獻報道表現(xiàn)一致。

圖1 應(yīng)用吉非替尼前后各組大鼠皮膚表現(xiàn)Fig 1 Skin change before and after 21d of administration of gefitinib

2.3.2 外用藥物干預(yù)前后 從圖2 中看出，空白組前后皮膚表現(xiàn)無明顯改變；Model 組和Gefitinib+NS 組大鼠皮膚表現(xiàn)較7 d 前明顯加重，尤其大鼠耳后皮膚，可以看到明顯的紅色丘疹、結(jié)痂及滲出等炎性表現(xiàn)；而Gefitinib+ZY 組大鼠在應(yīng)用“止癢平膚液”7 d 后，大鼠背部皮疹明顯消退。

圖2 應(yīng)用不同藥物干預(yù)前后皮膚表現(xiàn)Fig 2 Skin change before and after topical drug intervention

2.4 皮膚病理

與空白組相比，Model 組和Gefitinib+NS 組均有大量炎癥細胞浸潤、表皮增厚、棘層松解、角化不全等皮膚炎癥的表現(xiàn)；而Gefitinib+ZY 組大鼠表現(xiàn)較空白組并無明顯差異，炎癥表現(xiàn)不明顯。見圖3。

圖3 大鼠皮膚病理表現(xiàn)Fig 3 Pathological changes of rats in different groups

2.5 大鼠血清中相關(guān)炎癥因子

2.5.1 TNF-α Model 組TNF-α 濃 度 較 空 白 組 顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。Gefi?tinib+ZY 組TNF-α 濃度組較Model 組明顯下降，差異有統(tǒng)計學意義（P=0.002），與空白組相比未見明顯差異（P=0.279）。Gefitinib+NS 組TNF-α 濃度與空白組相比顯著升高（P=0.002），較Model 組未見明顯下降（P=0.210），見表5。

2.5.2 IL-6 Model 組IL-6 濃度較空白組有顯著升高，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.001）。Gefitinib+ZY 組IL-6 的濃度較Model 組明顯下降（P=0.002），相比空白組無明顯變化（P=0.165）。Gefi?tinib+NS 組IL-6 濃 度 明 顯 低 于Model 組（P=0.029），且與空白組相比無明顯變化（P=0.064），見表5。

表5 各組TNF-α 和IL-6 濃度比較（±s，pg/mL）Tab 5 Concentration of TNF-α and IL-6（±s，pg/mL）

表5 各組TNF-α 和IL-6 濃度比較（±s，pg/mL）Tab 5 Concentration of TNF-α and IL-6（±s，pg/mL）

注：因所測得的TNF-α 數(shù)值較小，故用OD 值代替。

組別Control 組Model 組Gefitinib+NS 組Gefitinib+ZY 組IL-6 0.998±0.501 2.548±0.553 1.610±0.350 1.442±0.105 n 6 6 9 6 TNF-α (OD 值)0.058±0.029 0.069±0.041 0.066±0.046 0.061±0.026

3 討論

根據(jù)既往研究基礎(chǔ)［21］，應(yīng)用吉非替尼21 d 后，EGFRIs 相關(guān)皮疹模型可成功建立，動物皮膚會有明顯的紅色丘疹、結(jié)痂、滲出等表現(xiàn)，皮膚病理可看到明顯的炎癥表現(xiàn)，且血清中TNF-α、IL-6 等炎癥因子的濃度相比正常會有顯著升高。本研究中吉非替尼組大鼠在應(yīng)用吉非替尼后也出現(xiàn)了相同的表現(xiàn)，而且血液指標較空白組有明顯提高，和既往研究基礎(chǔ)及文獻報道類似［22-25］，據(jù)此可驗證皮疹動物模型的成功建立。

自實驗第22 天開始，除空白組和Model 組外，各研究組在口服吉非替尼的基礎(chǔ)上開始外用不同的藥物。研究中發(fā)現(xiàn)，就皮膚大體表型而言，Model組大鼠的紅色丘疹、結(jié)痂表現(xiàn)則隨著吉非替尼用藥時間的延長則逐漸加重，在實驗結(jié)束時，大鼠紅色丘疹、結(jié)痂、滲出等表現(xiàn)為各組中最嚴重，炎癥評分較高；Gefitinib+NS 組大鼠在外用生理鹽水后，大鼠紅色丘疹、結(jié)痂、滲出表現(xiàn)較前并未明顯減輕，甚至逐漸加重；而Gefitinib+ZY 組大鼠在應(yīng)用止癢平膚液3 d 后，大鼠的紅色丘疹、結(jié)痂、滲出等表現(xiàn)開始逐漸減輕；在應(yīng)用中藥7 d 后，紅色丘疹、結(jié)痂、滲出等炎癥表現(xiàn)較用藥前及Model 組等明顯減輕，某些大鼠體表結(jié)痂滲出等甚至完全消失，炎癥評分為各實驗組中最低。

而從皮膚病理觀察，Model 組和Gefitinib+NS組大鼠皮膚HE 染色可以看到明顯的表皮增厚、中性粒細胞浸潤等炎癥表現(xiàn)，與既往文獻報道類似［22，26，27］；而Gefitinib+ZY 組大鼠的皮膚HE 染色表現(xiàn)與空白組相比未見明顯差別，在表皮厚度、中性粒細胞等的浸潤等方面無明顯差異。故單純從皮膚表現(xiàn)而言，止癢平膚液治療靶向藥相關(guān)皮疹效果顯著，該研究結(jié)果與既往臨床研究相符。

就血液學指標而言，TNF-α、IL-6 等炎癥因子濃度的高低與炎癥的程度有密切相關(guān)，為常見的炎癥反應(yīng)標記物，可以作為判斷機體炎癥嚴重程度的參考指標［28，29］。從機制來看，TNF-α 可激活角質(zhì)形成細胞的EGFR 信號通路，并可促進EGFR 的磷酸化過程，但若過量表達，則促進角質(zhì)形成細胞中炎癥介質(zhì)的表達，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生［30］；而IL-6 作為引起炎癥的核心介質(zhì)［31］，具有催化和放大免疫炎癥的 作 用［29，32，33］。在 靶 向 藥 相 關(guān) 皮 疹 患 者 血 液 中，TNF-α、IL-6 等細胞因子的表達會顯著增高［3］，這或許是導(dǎo)致EGFRIs 相關(guān)皮疹的重要因素［6］。同樣，本 研究中，Model 組大鼠 血清中TNF-α 和IL-6 濃度比正常大鼠血清中炎癥因子的濃度顯著升高，與既往文獻等保持一致，這或許也是吉非替尼組大鼠出現(xiàn)了較為明顯的紅色丘疹、皮膚結(jié)痂等炎癥反應(yīng)的重要原因。

研究證實，若應(yīng)用TNF-α、IL-1 等的拮抗劑進行治療，其皮疹等不良反應(yīng)會有較明顯的減輕［23，24］。本研究中，Gefitinib+ZY 組大鼠在應(yīng)用止癢平膚液后，血清中炎癥因子TNF-α 和IL-6 濃度比Model 明顯降低，且與空白組無明顯差異；而Gefitinib+NS組大鼠在外用生理鹽水后，其炎癥因子TNF-α 濃度并與Model 組相比無明顯異常，較空白組仍明顯升高。故從血清學指標而言，止癢平膚液可降低TNF-α、IL-6 等炎癥因子的水平，減輕大鼠皮膚皮疹等反應(yīng)，有效性得到進一步證實。

另外，現(xiàn)代藥理學研究發(fā)現(xiàn)，止癢平膚液的主要藥物 組成中，苦參［34，35］、黃 芩［36］、白鮮皮［37］、馬齒莧［38，39］等可下調(diào)外周血中TNF-α、IL-6 等細胞因子的表達，發(fā)揮抗炎作用。故綜合以上研究結(jié)果，我們可證實止癢平膚液可下調(diào)血液中TNF-α、IL-6 等炎癥因子的水平，明顯減輕EGFRIs 引起的皮損。

作者貢獻說明：

張旭進行文章的構(gòu)思、寫作與修改、實驗設(shè)計與操作；崔慧娟進行實驗設(shè)計、文章構(gòu)思、文稿修改與校對；譚可欣進行文章修改及數(shù)據(jù)分析；李嘉、薛崇祥進行實驗操作及圖片信息采集；魯星妤、董慧靜、俞儀萱、胡紫馨進行文章內(nèi)容校對及數(shù)據(jù)收集與核對。