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        基于網(wǎng)絡藥理學探討桂枝茯苓丸治療冠心病的作用機制

        2022-04-20 11:32:38代澤陽
        河南中醫(yī) 2022年1期
        關鍵詞:茯苓桂枝靶點

        代澤陽

        成都市龍泉驛區(qū)中醫(yī)醫(yī)院,四川 成都 610100

        冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(簡稱冠心病),該病的發(fā)生進展涉及多種危險因素,因此需聯(lián)合運用抗血小板、穩(wěn)定斑塊、拮抗心肌重構、調節(jié)心肌能量代謝等藥物策略進行防治[1-2]。中醫(yī)學將冠心病歸屬于“胸痹心痛”范疇,本虛標實貫穿疾病的始終,本虛以氣虛、陰虛為主;標實以血瘀、痰濁、氣滯多見[3]。

        中醫(yī)經(jīng)典名方桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍等組成,載于張仲景的《金匱要略》,《金匱要略·婦人雜病脈證并治》曰:“婦人宿有癥病,經(jīng)斷未及三月……當下其癥,桂枝茯苓丸主之。”方中桂枝溫經(jīng)通脈,茯苓健脾祛痰,牡丹皮涼血活血,桃仁活血祛瘀,赤芍散瘀止痛。諸藥合用,共奏溫經(jīng)、通絡、活血、化瘀、消癥之功,臨床多用于治療子宮肌瘤、卵巢囊腫、子宮內膜異位癥、盆腔炎、痛經(jīng)、前列腺增生等疾病[4]。

        基于中醫(yī)異病同治、治病求本理論,有文獻報道桂枝茯苓丸能改善心肌微循環(huán),治療冠心病療效確切[5-7]。但桂枝茯苓丸治療冠心病的機制研究較少,本文運用網(wǎng)絡藥理學方法探討桂枝茯苓丸治療冠心病的作用機制,為后續(xù)深入研究提供參考和依據(jù)。

        1 方法

        1.1 收集桂枝茯苓丸有效成分及靶點基因通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫與分析平臺(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform,TCMSP)(https://tcmspw.com/index.php)收集桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍已知成分。在檢索結果中以口服利用度[8](oral bioavailability,OB)≥30%、類藥性[9](drug-likeness,DL)≥0.18為條件,篩選出桂枝茯苓丸的有效成分。在TCMSP中對上述結果進行搜索匹配,得到有效成分的靶點蛋白,將靶點蛋白輸入Uniprot(https://www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫,并將種屬選為“Homo sapiens”,檢索得到桂枝茯苓丸的標準靶點基因。

        1.2 桂枝茯苓丸治療冠心病潛在靶點的篩選以關鍵詞“coronary heart disease”在GeneCards(https://www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫中進行檢索,獲取冠心病相關靶點并加以整理。將桂枝茯苓丸靶點和冠心病靶點導入Draw Venny Diagram在線程序(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集獲得藥物與疾病共同靶點,此集合為桂枝茯苓丸治療冠心病的潛在靶點。

        1.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖繪制將桂枝茯苓丸有效成分、潛在靶點導入Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物-成分-靶點網(wǎng)絡圖。其中節(jié)點(node)代表藥物、有效成分、潛在靶點;邊(edge)連接藥物、有效成分與靶點,展現(xiàn)相互作用關系。

        1.4 核心網(wǎng)絡分析運用Cytoscape 3.7.2軟件中Bisogenet、CytoNCA插件對潛在靶點構建蛋白相互作用(protein protein interaction,PPI)網(wǎng)絡分析、拓撲分析,構建核心網(wǎng)絡,經(jīng)篩選得到核心靶點,以分析桂枝茯苓丸有效成分治療冠心病的作用靶點。

        1.5 GO功能和KEGG富集分析將核心靶點導入Hiplot在線作圖工具(https://hiplot.com.cn/advance/clusterprofiler-go-kegg),以P<0.05為條件進行GO功能、KEGG通路富集分析,其中GO功能分析包括生物進程(biological process,BP)、細胞組分(cell component,CC)和分子功能(molecular functions,MF)。用氣泡圖形式展示分析結果,以探究桂枝茯苓丸治療冠心病可能的作用機制。

        2 結果

        2.1 桂枝茯苓丸的有效成分、靶點基因收集和整理在TCMSP中檢索桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍的有效成分,根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18為條件進行篩選,去重后得到包含作用靶點的有效成分43個,見表1。將有效成分對應靶點蛋白通過Uniprot數(shù)據(jù)庫轉換為人類基因名,經(jīng)去重后共獲得210個標準靶點基因。

        2.2 桂枝茯苓丸治療冠心病潛在靶點篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索關鍵詞“coronary heart diseases”,共得到7 100個相關基因。使用Draw Venny Diagram在線程序將冠心病相關且關聯(lián)分數(shù)≥19.71共889個基因,與桂枝茯苓丸210個靶點基因取交集,最終獲得89個潛在靶點,見圖1。

        2.3 藥物-成分-靶點網(wǎng)絡構建使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制桂枝茯苓丸治療冠心病“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡圖,其中包含284條邊、126個節(jié)點,見圖2。度值越大,節(jié)點形狀越大、作用越關鍵,該圖直觀反映了桂枝茯苓丸是通過多成分、多靶點治療冠心病。本研究結果發(fā)現(xiàn),43個有效成分通過89個靶點對冠心病起到直接調控作用,其中25個成分單獨或共同作用于PTGS2、PTGS1、PRKACA、NR3C2、ESR1、CASP3、BCL2、ADRB2、PDE3A、CN5A、PPARG等靶點。圖2中度值排名靠前的活性成分依次為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-兒茶素、黃芩素,這些認為是桂枝茯苓丸治療冠心病的核心成分。由此可見,中藥治療疾病具有多成分、多靶點的特點。

        表1 桂枝茯苓丸43個有效成分收集結果

        圖1 桂枝茯苓丸-冠心病韋恩圖

        注:黃色圓形表示藥物;藍色六邊形表示成分;綠色菱形表示潛在靶點;邊表示它們之間的相互作用圖2 桂枝茯苓丸治療冠心病的“藥物-成分-靶點”網(wǎng)絡

        2.4 PPI網(wǎng)絡分析、核心靶點篩選以潛在靶點為基礎利用Cytoscape中Bisogenet插件構建PPI網(wǎng)絡;采用CytoNCA插件進行拓撲分析和核心網(wǎng)絡構建,一級子網(wǎng)絡篩選條件:Degree≥29,二級子網(wǎng)絡(核心網(wǎng)絡)篩選條件:Degree≥221、局部平均連通度(local average connectivity,LAC)≥26.469、Betweenness≥12 319.327、Closeness Centrality≥0.463,共獲得70個核心靶點基因,見圖3。依照Degree值由大到小排序,展示排名前10位的靶點,見表2。

        圖3 桂枝茯苓丸治療冠心病的PPI 網(wǎng)絡核心靶點篩選示意圖

        表2 排名前10位的核心靶點

        2.5 GO功能和KEGG富集分析將70個核心靶點基因導入Hiplot在線作圖工具,以P<0.05進行GO功能、KEGG通路富集分析。選取GO功能分析中前10條通路繪制氣泡圖,見圖4。結果顯示:BP主要涉及細胞代謝、生長、分化、凋亡等;MF主要涉及泛素蛋白連接酶結合、泛素樣蛋白連接酶結合、轉錄共調節(jié)因子激活、鈣黏蛋白結合、組蛋白脫乙?;附Y合、蛋白磷酸酶結合、受損DNA結合、無序域特異性結合、RNA聚合酶II轉錄因子結合、MHCⅡ蛋白復合物結合;CC主要涉及黏著斑、細胞基質結合、囊腔等。

        選取KEGG通路富集分析中前20條通路,見圖4,發(fā)現(xiàn)核心基因主要富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介導的蛋白水解、Notch、癌癥中的microRNA、甲狀腺激素、內質網(wǎng)中的蛋白質加工等信號通路。

        圖4 桂枝茯苓丸治療冠心病的GO功能和KEGG富集分析氣泡圖

        3 討論

        本研究篩選出桂枝茯苓丸共43個有效成分,210個藥物靶基因與889個疾病靶基因相映射,得到包括功能酶、信號分子、轉錄因子等89個潛在靶點。由此可見,桂枝茯苓丸主要通過調控89個潛在靶點干預機體多種生物進程、多條信號通路來治療冠心病,并抑制其進展為急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome,ACS)。對冠心病有調控作用的主要有效成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-兒茶素、黃芩素等。研究顯示,槲皮素通過影響血管細胞增殖、抑制炎癥反應途徑拮抗動脈粥樣硬化[10],也能減輕心肌缺血再灌注損傷。β-谷甾醇具有調節(jié)血脂、抗動脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等作用[11]。山柰酚具有抗氧化應激活性,可降低血管炎癥反應、防止動脈粥樣硬化發(fā)生、抑制心肌細胞凋亡[12]。兒茶素能抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、CRP、白細胞介素-6(interleukin-6,IL-6)等炎癥介質、下調核轉錄因子(nuclear factor kappa beta,NF-κB)表達,對冠心病模型大鼠有保護作用[13]。黃芩素對發(fā)生缺血、缺氧損傷的心肌具有保護作用[14]。

        通過KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn),核心基因主要顯著富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介導的蛋白水解、Notch、癌癥中的microRNA、甲狀腺激素、內質網(wǎng)中的蛋白質加工等信號通路。以PI3K-Akt信號通路最為重要,該通路被激活,關鍵蛋白Akt將從細胞膜轉移到細胞質和細胞核,通過磷酸化抑制或增強靶蛋白活性,進而調節(jié)下游信號通路,參與調節(jié)細胞代謝、增殖、存活及血管生成等。例如,冠心病患者重要危險因素和治療目標是血脂中低密度脂蛋白(low-density lipoprotein,LDL)水平[15]。血管內皮下的LDL能被修飾成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein,Ox-LDL)。Ox-LDL可抑制PI3K/Akt/eNOS信號通路中Akt和eNOS磷酸化,導致血管內皮損傷、血小板聚集、單核細胞浸潤、泡沫細胞形成,構成動脈粥樣硬化斑塊的脂質核心、促進動脈粥樣硬化斑塊形成[16]。而Akt能激活eNOS促進一氧化氮生成,產(chǎn)生抗炎、抗動脈粥樣硬化、抗纖維化、抑制血小板活性、擴張冠狀動脈等生物學效應[17];Akt能激活mTOR抑制細胞自噬進程,抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路,誘導巨噬細胞自噬,減少巨噬細胞對斑塊的浸潤,穩(wěn)定動脈粥樣硬化易損斑塊[18],預防ACS發(fā)生。Akt還能夠磷酸化IKK調節(jié)NF-κB信號轉導、抑制促凋亡蛋白Bad調控細胞存活、抑制CDK影響細胞增殖。PI3K-Akt信號通路也是FoxO轉錄因子的主要上游通路,F(xiàn)oxO轉錄的基因能夠調控細胞周期、誘導細胞凋亡、抵抗氧化應激、促進DNA修復等[19]。研究表明,F(xiàn)oxO信號通路參與拮抗心肌纖維化、減輕心臟缺血再灌注損傷[20]。此外,泛素介導的蛋白水解通路能抗氧化、抗炎、降解細胞周期相關蛋白質、抑制血管內膜增生、誘導血管平滑肌細胞凋亡、防止動脈粥樣硬化進展[21]。Notch信號通路參與細胞增殖、分化、凋亡,能通過拮抗心肌纖維化、抑制炎性反應抗動脈粥樣硬化,還能抑制平滑肌細胞過度增殖、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊[22]。癌癥中的microRNA通路關聯(lián)動脈粥樣硬化病理過程[23]。甲狀腺激素信號通路涉及拮抗心肌重構、調節(jié)促動脈粥樣硬化和抗動脈粥樣硬化過程[24]。內質網(wǎng)中的蛋白質加工通路調控內質網(wǎng)應激,干預動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展,調控血管內皮細胞、平滑肌細胞及巨噬細胞活性、凋亡[25]。因此,桂枝茯苓丸通過介導細胞增殖凋亡、細胞分解、氧化應激、炎癥反應等治療冠心病、防止其進展為ACS。

        冠心病是由環(huán)境、基因共同作用的復雜疾病,需要采取多種措施進行防治。桂枝茯苓丸能由拮抗動脈粥樣硬化、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊、改善心肌缺血缺氧、抑制心肌纖維化等方面治療冠心病、防止其進展為ACS,這與冠心病病理生理過程和中醫(yī)異病同治、治病求本思想相符。綜上所述,本研究采用網(wǎng)絡藥理學的方法論證了桂枝茯苓丸是通過多成分、多靶點、多通路治療冠心病,為桂枝茯苓丸治療冠心病進一步研究奠定基礎,也為擴展中醫(yī)經(jīng)典方劑臨床運用提供參考。由于檢索數(shù)據(jù)庫有限、分析不全面等主客觀因素的存在,使該研究存在一定局限性,仍需進行深入研究。

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