代澤陽(yáng)

成都市龍泉驛區(qū)中醫(yī)醫(yī)院，四川 成都 610100

冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(簡(jiǎn)稱冠心病)，該病的發(fā)生進(jìn)展涉及多種危險(xiǎn)因素，因此需聯(lián)合運(yùn)用抗血小板、穩(wěn)定斑塊、拮抗心肌重構(gòu)、調(diào)節(jié)心肌能量代謝等藥物策略進(jìn)行防治[1-2]。中醫(yī)學(xué)將冠心病歸屬于“胸痹心痛”范疇，本虛標(biāo)實(shí)貫穿疾病的始終，本虛以氣虛、陰虛為主；標(biāo)實(shí)以血瘀、痰濁、氣滯多見(jiàn)[3]。

中醫(yī)經(jīng)典名方桂枝茯苓丸由桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍等組成，載于張仲景的《金匱要略》，《金匱要略·婦人雜病脈證并治》曰：“婦人宿有癥病，經(jīng)斷未及三月……當(dāng)下其癥，桂枝茯苓丸主之?！狈街泄鹬亟?jīng)通脈，茯苓健脾祛痰，牡丹皮涼血活血，桃仁活血祛瘀，赤芍散瘀止痛。諸藥合用，共奏溫經(jīng)、通絡(luò)、活血、化瘀、消癥之功，臨床多用于治療子宮肌瘤、卵巢囊腫、子宮內(nèi)膜異位癥、盆腔炎、痛經(jīng)、前列腺增生等疾病[4]。

基于中醫(yī)異病同治、治病求本理論，有文獻(xiàn)報(bào)道桂枝茯苓丸能改善心肌微循環(huán)，治療冠心病療效確切[5-7]。但桂枝茯苓丸治療冠心病的機(jī)制研究較少，本文運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探討桂枝茯苓丸治療冠心病的作用機(jī)制，為后續(xù)深入研究提供參考和依據(jù)。

1 方法

1.1 收集桂枝茯苓丸有效成分及靶點(diǎn)基因通過(guò)檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)與分析平臺(tái)(traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP)(https：//tcmspw.com/index.php)收集桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍已知成分。在檢索結(jié)果中以口服利用度[8](oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性[9](drug-likeness，DL)≥0.18為條件，篩選出桂枝茯苓丸的有效成分。在TCMSP中對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行搜索匹配，得到有效成分的靶點(diǎn)蛋白，將靶點(diǎn)蛋白輸入U(xiǎn)niprot(https：//www.uniprot.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)，并將種屬選為“Homo sapiens”，檢索得到桂枝茯苓丸的標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)基因。

1.2 桂枝茯苓丸治療冠心病潛在靶點(diǎn)的篩選以關(guān)鍵詞“coronary heart disease”在GeneCards(https：//www.genecards.org/)數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行檢索，獲取冠心病相關(guān)靶點(diǎn)并加以整理。將桂枝茯苓丸靶點(diǎn)和冠心病靶點(diǎn)導(dǎo)入Draw Venny Diagram在線程序(http：// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)取交集獲得藥物與疾病共同靶點(diǎn)，此集合為桂枝茯苓丸治療冠心病的潛在靶點(diǎn)。

1.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖繪制將桂枝茯苓丸有效成分、潛在靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.7.2軟件繪制藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖。其中節(jié)點(diǎn)(node)代表藥物、有效成分、潛在靶點(diǎn)；邊(edge)連接藥物、有效成分與靶點(diǎn)，展現(xiàn)相互作用關(guān)系。

1.4 核心網(wǎng)絡(luò)分析運(yùn)用Cytoscape 3.7.2軟件中Bisogenet、CytoNCA插件對(duì)潛在靶點(diǎn)構(gòu)建蛋白相互作用(protein protein interaction，PPI)網(wǎng)絡(luò)分析、拓?fù)浞治?，?gòu)建核心網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)篩選得到核心靶點(diǎn)，以分析桂枝茯苓丸有效成分治療冠心病的作用靶點(diǎn)。

1.5 GO功能和KEGG富集分析將核心靶點(diǎn)導(dǎo)入Hiplot在線作圖工具(https：//hiplot.com.cn/advance/clusterprofiler-go-kegg)，以P<0.05為條件進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析，其中GO功能分析包括生物進(jìn)程(biological process，BP)、細(xì)胞組分(cell component，CC)和分子功能(molecular functions，MF)。用氣泡圖形式展示分析結(jié)果，以探究桂枝茯苓丸治療冠心病可能的作用機(jī)制。

2 結(jié)果

2.1 桂枝茯苓丸的有效成分、靶點(diǎn)基因收集和整理在TCMSP中檢索桂枝、茯苓、牡丹皮、桃仁、赤芍的有效成分，根據(jù)OB≥30%和DL≥0.18為條件進(jìn)行篩選，去重后得到包含作用靶點(diǎn)的有效成分43個(gè)，見(jiàn)表1。將有效成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)蛋白通過(guò)Uniprot數(shù)據(jù)庫(kù)轉(zhuǎn)換為人類基因名，經(jīng)去重后共獲得210個(gè)標(biāo)準(zhǔn)靶點(diǎn)基因。

2.2 桂枝茯苓丸治療冠心病潛在靶點(diǎn)篩選在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索關(guān)鍵詞“coronary heart diseases”，共得到7 100個(gè)相關(guān)基因。使用Draw Venny Diagram在線程序?qū)⒐谛牟∠嚓P(guān)且關(guān)聯(lián)分?jǐn)?shù)≥19.71共889個(gè)基因，與桂枝茯苓丸210個(gè)靶點(diǎn)基因取交集，最終獲得89個(gè)潛在靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

2.3 藥物-成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建使用Cytoscape 3.7.2軟件繪制桂枝茯苓丸治療冠心病“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，其中包含284條邊、126個(gè)節(jié)點(diǎn)，見(jiàn)圖2。度值越大，節(jié)點(diǎn)形狀越大、作用越關(guān)鍵，該圖直觀反映了桂枝茯苓丸是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)治療冠心病。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，43個(gè)有效成分通過(guò)89個(gè)靶點(diǎn)對(duì)冠心病起到直接調(diào)控作用，其中25個(gè)成分單獨(dú)或共同作用于PTGS2、PTGS1、PRKACA、NR3C2、ESR1、CASP3、BCL2、ADRB2、PDE3A、CN5A、PPARG等靶點(diǎn)。圖2中度值排名靠前的活性成分依次為槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-兒茶素、黃芩素，這些認(rèn)為是桂枝茯苓丸治療冠心病的核心成分。由此可見(jiàn)，中藥治療疾病具有多成分、多靶點(diǎn)的特點(diǎn)。

表1 桂枝茯苓丸43個(gè)有效成分收集結(jié)果

圖1 桂枝茯苓丸-冠心病韋恩圖

注：黃色圓形表示藥物；藍(lán)色六邊形表示成分；綠色菱形表示潛在靶點(diǎn)；邊表示它們之間的相互作用圖2 桂枝茯苓丸治療冠心病的“藥物-成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)分析、核心靶點(diǎn)篩選以潛在靶點(diǎn)為基礎(chǔ)利用Cytoscape中Bisogenet插件構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)；采用CytoNCA插件進(jìn)行拓?fù)浞治龊秃诵木W(wǎng)絡(luò)構(gòu)建，一級(jí)子網(wǎng)絡(luò)篩選條件：Degree≥29，二級(jí)子網(wǎng)絡(luò)(核心網(wǎng)絡(luò))篩選條件：Degree≥221、局部平均連通度(local average connectivity,LAC)≥26.469、Betweenness≥12 319.327、Closeness Centrality≥0.463，共獲得70個(gè)核心靶點(diǎn)基因，見(jiàn)圖3。依照Degree值由大到小排序，展示排名前10位的靶點(diǎn)，見(jiàn)表2。

圖3 桂枝茯苓丸治療冠心病的PPI 網(wǎng)絡(luò)核心靶點(diǎn)篩選示意圖

表2 排名前10位的核心靶點(diǎn)

2.5 GO功能和KEGG富集分析將70個(gè)核心靶點(diǎn)基因?qū)際iplot在線作圖工具，以P<0.05進(jìn)行GO功能、KEGG通路富集分析。選取GO功能分析中前10條通路繪制氣泡圖，見(jiàn)圖4。結(jié)果顯示：BP主要涉及細(xì)胞代謝、生長(zhǎng)、分化、凋亡等；MF主要涉及泛素蛋白連接酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、轉(zhuǎn)錄共調(diào)節(jié)因子激活、鈣黏蛋白結(jié)合、組蛋白脫乙?；附Y(jié)合、蛋白磷酸酶結(jié)合、受損DNA結(jié)合、無(wú)序域特異性結(jié)合、RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、MHCⅡ蛋白復(fù)合物結(jié)合；CC主要涉及黏著斑、細(xì)胞基質(zhì)結(jié)合、囊腔等。

選取KEGG通路富集分析中前20條通路，見(jiàn)圖4，發(fā)現(xiàn)核心基因主要富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、Notch、癌癥中的microRNA、甲狀腺激素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等信號(hào)通路。

圖4 桂枝茯苓丸治療冠心病的GO功能和KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

本研究篩選出桂枝茯苓丸共43個(gè)有效成分，210個(gè)藥物靶基因與889個(gè)疾病靶基因相映射，得到包括功能酶、信號(hào)分子、轉(zhuǎn)錄因子等89個(gè)潛在靶點(diǎn)。由此可見(jiàn)，桂枝茯苓丸主要通過(guò)調(diào)控89個(gè)潛在靶點(diǎn)干預(yù)機(jī)體多種生物進(jìn)程、多條信號(hào)通路來(lái)治療冠心病，并抑制其進(jìn)展為急性冠狀動(dòng)脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)。對(duì)冠心病有調(diào)控作用的主要有效成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山柰酚、(+)-兒茶素、黃芩素等。研究顯示，槲皮素通過(guò)影響血管細(xì)胞增殖、抑制炎癥反應(yīng)途徑拮抗動(dòng)脈粥樣硬化[10]，也能減輕心肌缺血再灌注損傷。β-谷甾醇具有調(diào)節(jié)血脂、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗氧化、抗炎等作用[11]。山柰酚具有抗氧化應(yīng)激活性，可降低血管炎癥反應(yīng)、防止動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)生、抑制心肌細(xì)胞凋亡[12]。兒茶素能抑制腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、CRP、白細(xì)胞介素-6(interleukin-6，IL-6)等炎癥介質(zhì)、下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子(nuclear factor kappa beta,NF-κB)表達(dá)，對(duì)冠心病模型大鼠有保護(hù)作用[13]。黃芩素對(duì)發(fā)生缺血、缺氧損傷的心肌具有保護(hù)作用[14]。

通過(guò)KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，核心基因主要顯著富集于PI3K-Akt、FoxO、泛素介導(dǎo)的蛋白水解、Notch、癌癥中的microRNA、甲狀腺激素、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工等信號(hào)通路。以PI3K-Akt信號(hào)通路最為重要，該通路被激活，關(guān)鍵蛋白Akt將從細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核，通過(guò)磷酸化抑制或增強(qiáng)靶蛋白活性，進(jìn)而調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞代謝、增殖、存活及血管生成等。例如，冠心病患者重要危險(xiǎn)因素和治療目標(biāo)是血脂中低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)水平[15]。血管內(nèi)皮下的LDL能被修飾成氧化型低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL)。Ox-LDL可抑制PI3K/Akt/eNOS信號(hào)通路中Akt和eNOS磷酸化，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷、血小板聚集、單核細(xì)胞浸潤(rùn)、泡沫細(xì)胞形成，構(gòu)成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的脂質(zhì)核心、促進(jìn)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成[16]。而Akt能激活eNOS促進(jìn)一氧化氮生成，產(chǎn)生抗炎、抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗纖維化、抑制血小板活性、擴(kuò)張冠狀動(dòng)脈等生物學(xué)效應(yīng)[17]；Akt能激活mTOR抑制細(xì)胞自噬進(jìn)程，抑制PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路，誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬，減少巨噬細(xì)胞對(duì)斑塊的浸潤(rùn)，穩(wěn)定動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊[18]，預(yù)防ACS發(fā)生。Akt還能夠磷酸化IKK調(diào)節(jié)NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抑制促凋亡蛋白Bad調(diào)控細(xì)胞存活、抑制CDK影響細(xì)胞增殖。PI3K-Akt信號(hào)通路也是FoxO轉(zhuǎn)錄因子的主要上游通路，F(xiàn)oxO轉(zhuǎn)錄的基因能夠調(diào)控細(xì)胞周期、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、抵抗氧化應(yīng)激、促進(jìn)DNA修復(fù)等[19]。研究表明，F(xiàn)oxO信號(hào)通路參與拮抗心肌纖維化、減輕心臟缺血再灌注損傷[20]。此外，泛素介導(dǎo)的蛋白水解通路能抗氧化、抗炎、降解細(xì)胞周期相關(guān)蛋白質(zhì)、抑制血管內(nèi)膜增生、誘導(dǎo)血管平滑肌細(xì)胞凋亡、防止動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展[21]。Notch信號(hào)通路參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡，能通過(guò)拮抗心肌纖維化、抑制炎性反應(yīng)抗動(dòng)脈粥樣硬化，還能抑制平滑肌細(xì)胞過(guò)度增殖、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊[22]。癌癥中的microRNA通路關(guān)聯(lián)動(dòng)脈粥樣硬化病理過(guò)程[23]。甲狀腺激素信號(hào)通路涉及拮抗心肌重構(gòu)、調(diào)節(jié)促動(dòng)脈粥樣硬化和抗動(dòng)脈粥樣硬化過(guò)程[24]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的蛋白質(zhì)加工通路調(diào)控內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，干預(yù)動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展，調(diào)控血管內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞及巨噬細(xì)胞活性、凋亡[25]。因此，桂枝茯苓丸通過(guò)介導(dǎo)細(xì)胞增殖凋亡、細(xì)胞分解、氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等治療冠心病、防止其進(jìn)展為ACS。

冠心病是由環(huán)境、基因共同作用的復(fù)雜疾病，需要采取多種措施進(jìn)行防治。桂枝茯苓丸能由拮抗動(dòng)脈粥樣硬化、穩(wěn)定粥樣硬化斑塊、改善心肌缺血缺氧、抑制心肌纖維化等方面治療冠心病、防止其進(jìn)展為ACS，這與冠心病病理生理過(guò)程和中醫(yī)異病同治、治病求本思想相符。綜上所述，本研究采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法論證了桂枝茯苓丸是通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)、多通路治療冠心病，為桂枝茯苓丸治療冠心病進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)，也為擴(kuò)展中醫(yī)經(jīng)典方劑臨床運(yùn)用提供參考。由于檢索數(shù)據(jù)庫(kù)有限、分析不全面等主客觀因素的存在，使該研究存在一定局限性，仍需進(jìn)行深入研究。