王光宇, 張萌萌, 陳 立

(河北大學生命科學學院, 生命科學與綠色發(fā)展研究院, 河北保定 071002)

白星花金龜Protaetiabrevitarsis屬鞘翅目(Coleoptera)金龜科(Scarabaeidae)花金龜亞科(Cetoniinae)(Lewis, 1879)，國外主要分布于蒙古、韓國、朝鮮、日本、俄羅斯等國家，在我國主要分布于華北、東北、黃淮海及新疆等地區(qū)(劉廣瑞等, 1997)。白星花金龜一年1代，以幼蟲在土壤內越冬，成蟲次年6-7月出土，對糧食、蔬菜、水果等眾多經濟作物危害嚴重，尤其喜食葡萄、蘋果、柑橘、玉米等作物的果實且常為群集為害(陳日曌等, 2006; 龔建等, 2017)。在新疆，該蟲導致的葡萄被害率在20%～40%之間，有時甚至達到60%，嚴重威脅到我國的農業(yè)生產(郭文超等, 2004; 李濤, 2018)。

白星花金龜?shù)姆乐未胧┲饕?種：一是農業(yè)防治，如深耕漫灌；二是化學防治，在有機肥或土壤中撒施農藥以防治白星花金龜?shù)挠紫x、蛹；三是基于白星花金龜成蟲的假死性，采用人工震落并捕捉的機械防治方式(周智穎, 2020)。白星花金龜成蟲常為害成熟果實，為保證產品的安全性，不宜采用化學農藥進行防治，轉而采用糖醋液誘集捕殺的方法(李仲秀等, 1995; 郝雙紅等, 2005)，但效果并不理想。因此，有必要開發(fā)環(huán)境友好、成本低廉的科學防治技術。

麗金龜科(Rutelidae)和花金龜科(Cetoniiae)金龜甲成蟲常取食植物地上部分以獲得補充營養(yǎng)，并在植物上進行求偶活動，其取食和交配等行為必然會受到植物揮發(fā)物的影響。健康植物主要釋放組成型綠葉揮發(fā)物，但當受到昆蟲取食為害時，會釋放大量蟲害誘導產生的植物揮發(fā)物(Hararietal., 1994; Loughrinetal., 1996)。金龜甲也能通過嗅覺感受植物揮發(fā)物及其成分變化(熱孜宛古麗·阿卜杜克熱木等, 2018)，并產生行為反應。健康歐洲山毛櫸釋放的綠葉揮發(fā)物能吸引花園金龜Phylloperthahorticola，雄蟲還能利用取食誘導的植物揮發(fā)物來定位雌性配偶(Ruther, 2004)；日本麗金龜Popillajaponica取食為害誘導海棠葉產生大量萜烯類成分，能引誘日本麗金龜聚集(Loughrinetal., 1995)；被日本麗金龜和綠花金龜Cotinisnitida取食后的葡萄果實揮發(fā)物中醇類與酯類顯著增加，可引誘更多的綠花金龜聚集取食(Hammonsetal., 2009)。

本研究旨在利用氣相色譜-觸角電位聯(lián)用技術(gas chromatography-electroantennogram detection, GC-EAD)與氣相色譜-質譜聯(lián)用技術(gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)鑒定蘋果、葡萄和玉米3種寄主果實在健康和受害兩種狀態(tài)下對白星花金龜雌成蟲觸角有電生理活性的揮發(fā)物成分及其含量，為開發(fā)用于防控白星花金龜?shù)闹参镌凑T劑打下基礎。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

白星花金龜成蟲采集于石河子大學農學院試驗站內，在實驗室內用蘋果喂養(yǎng)，室內溫度28℃，相對濕度60%。實驗前區(qū)分雌、雄成蟲，選擇60日齡左右的健康雌蟲用于受害果實處理及電生理實驗。

1.2 寄主果實揮發(fā)物的采集

新鮮紅富士蘋果和巨峰葡萄從市場購買，幼嫩甜玉米穗采摘于北京市海淀區(qū)上莊鎮(zhèn)玉米田。新鮮蘋果、葡萄和玉米視為健康狀態(tài)，20頭白星花金龜成蟲(雌蟲∶雄蟲=1∶1)取食24 h后的蘋果、葡萄和玉米視為受害狀態(tài)。將約400 g健康或受害果實放入PE保鮮袋[35 cm×45 cm，佳能(中國)有限公司]中。大氣采樣儀(QC-1S，北京市勞保所)的出氣口用四氟乙烯軟管與活性炭棒(20 g, 10～20目)相連接，空氣經碳棒過濾后通入保鮮袋的一端，保鮮袋的開口處用棉繩扎緊。在保鮮袋的另一端插入一根裝有Porapark Q吸附劑(200 mg, 80/100目，Sigma-Aldrich)的吸附管(內徑5 mm)，用食品級硅膠軟管連接吸附管和大氣采樣儀進氣口。大氣采樣儀流速為500 mL/min，采樣時間為2.5 h。將頂空收集完畢的吸附管用1 mL濃度為5 ng/μL的苯甲酸甲酯溶液(溶劑為色譜純二氯甲烷)洗脫獲得0.5 mL樣品，保存至-20℃冰箱中。每個采樣處理重復7次。所獲得的樣品直接用于GC-FID定量分析，然后將來自同一處理的樣品合并、濃縮后進行GC-EAD和GC-MS分析。

1.3 定量分析

使用氣相色譜(GC-2010 Plus, Shimadzu)對所獲樣品進行定量分析，氣相色譜安裝有DB-WAX毛細管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm, Agilent Technologies)。采用無分流進樣模式，進樣量為2 μL，進樣口溫度為230℃，檢測器溫度為250℃，載氣為氮氣，流速為1 mL/min。升溫程序為：初始溫度40℃，保持2 min；以5℃/min的速率升至120℃；以15℃/min升至240℃，保持4 min，整個過程持續(xù)30 min。利用GC-Solution軟件對各成分的相對峰面積進行積分，計算出相對含量，根據(jù)內標(苯甲酸甲酯)的濃度對各成分進行定量，用非參數(shù)檢驗對比同種果實活性成分不同狀態(tài)下的含量差異， 7個重復。

1.4 GC-EAD分析

GC-EAD分析方法參照Chen等(2019)，將氣相色譜與觸角電位儀(Kirchzarten, Syntech)聯(lián)用。觸角電位儀由IDAC-2數(shù)據(jù)采集控制器、CS-55氣流刺激控制裝置和微動操縱器組成。氣相色譜儀(GC-2010 Plus, Shimadzu)的毛細管柱型號與定量分析時相同，毛細管柱的末端連接Y型分流管(Agilent Technologies)，Y型分流管的兩個分支分別連接內徑0.25和0.32 mm的毛細管柱，細毛細管連接FID檢測器，粗毛細管經過加熱套連接到吹向觸角連接的持續(xù)氣流管。兩根毛細管柱的長度比為2∶3，分流比約為1∶2。載氣為氮氣，流速為2 mL/min。同時在Y型分流管前端增加一路補充氣體，流速為20 mL/min。進樣模式、進樣量、進樣口溫度、檢測器溫度與升溫程序均與定量分析時一致。用微型手術刀將雌成蟲觸角切下，基部連接到參比電極，鰓瓣分開后將其中一個連接到記錄電極。凈化和加濕后的持續(xù)氣流以400 mL/min的速率吹向觸角。用GC-EAD軟件記錄觸角的電生理信號和氣相色譜的FID信號，每個樣品重復記錄8～10次。

1.5 化合物的鑒定

色譜柱與定量分析時相同，無分流模式，進樣量為1 μL，載氣為氦氣，流速為1 mL/min，進樣口溫度為230℃，離子源溫度為230℃，電離方式為EI，電離能量為70 eV，質量掃描范圍為 40～500 amu。升溫程序為：初始溫度40℃，保持5 min；以5℃/min的速率升至240℃，保持5 min，整個過程持續(xù)50 min。GC-MS分析結果經與NIST14譜庫對比及標準品驗證，確定化合物的具體成分。

1.6 觸角電生理活性成分的主成分分析及聚類分析

為描述果實種類及受害狀態(tài)對揮發(fā)物的影響，對3種果實、兩種不同受害狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應的成分進行主成分分析(principle component analysis, PCA)。每個處理7個重復，用Origin 2019b對數(shù)據(jù)進行標準化處理并利用相關性矩陣計算數(shù)據(jù)之間的特征向量。聚類分析(cluster analysis, CA)選擇前2個主成分的歐式距離使用瓦爾德法對6個處理的揮發(fā)物進行分組，構建聚類譜系圖，分析軟件為SPSS 23.0。根據(jù)主成分分析結果及聚類譜系圖繪制二維因子載荷圖。

1.7 數(shù)據(jù)分析

利用SPSS 23.0對不同狀態(tài)下果實揮發(fā)物中EAD活性成分含量(平均值±標準誤, n=7)進行數(shù)據(jù)分析，顯著性差異分析克魯斯卡爾-沃利斯成對比較檢驗(Kruskal-Wallis test)(P<0.05)。利用Origin 2018對不同狀態(tài)下的果實揮發(fā)物活性成分進行主成分分析；根據(jù)主成分分析結果，用SPSS 23.0對不同狀態(tài)下的果實揮發(fā)物進行聚類分析。

2 結果

2.1 白星花金龜雌成蟲對蘋果揮發(fā)物的GC-EAD反應

蘋果果實揮發(fā)物中共有23種物質能夠明顯引起白星花金龜雌成蟲的觸角電位反應，其中健康蘋果中有18種，受害蘋果中有21種(圖1)。 兩種狀態(tài)下均能引起觸角電位反應的物質有13種，分別為丁酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、己酸甲酯、2-甲基丁醇、 己酸乙酯、 乙酸己酯、 6-甲基-5-庚烯-2-酮、己醇、壬醛、異戊酸己酯和α-法尼烯。健康狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應的特有揮發(fā)物成分有2種，分別為乙酸丁酯和己酸丙酯；受害狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應的特有揮發(fā)物成分有5種，分別為2-甲基丁酸甲酯、3-甲基丁酸乙酯、戊酸乙酯、3-甲基-3-丁烯-1-醇和辛酸乙酯。根據(jù)定量結果，有3種成分僅在濃度顯著高于另一狀態(tài)時才發(fā)生觸角電位反應，如2-甲基丙醇、乙酸戊酯、丁酸丁酯(圖1; 表1)。

圖1 白星花金龜雌成蟲對蘋果揮發(fā)物的GC-EAD反應

2.2 白星花金龜雌成蟲對葡萄揮發(fā)物的GC-EAD反應

葡萄果實中共有23種揮發(fā)物能引起白星花金龜雌成蟲的觸角電位反應，其中健康葡萄有18種物質，受害葡萄有13種物質(圖2)。健康與受害兩種條件下均能引起觸角電位反應的物質有8種，分別為丁酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、己醇、2-己烯酸乙酯、順-3-己烯醇、壬醛和一種未鑒定物質；健康狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應的特有成分有7種，分別為2-丁烯酸乙酯、庚醛、3-己烯酸乙酯、順-2-己烯醇、丁酮肟、(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯和一種未鑒定物質；受害狀態(tài)下有5種物質為特有成分，包括乙酸異丁酯、乙酸異戊酯、3-蒈烯、3-羥基-2-丁酮和一種未鑒定物質(圖2; 表1)。

圖2 白星花金龜雌成蟲對葡萄揮發(fā)物的GC-EAD反應

2.3 白星花金龜雌成蟲對玉米揮發(fā)物的GC-EAD反應

玉米果實共有25種具有電生理活性的揮發(fā)物，其中健康玉米有9種，受害玉米23種(圖3)。兩種狀態(tài)下均能引起觸角電位反應的物質有7種，分別是1-戊烯-3-醇、順-2-戊烯醇、1,4-戊二烯-3-醇、己醇、順-2-己烯醇、香葉基丙酮和一種未鑒定物質。健康狀態(tài)下能夠引起觸角電位反應的特有成分有2種，分別為α-叩卜任烯和1種未鑒定物質。受害狀態(tài)下特有成分有16種，分別為3-己酮、3-甲基丁酸乙酯、己醛、β-蒎烯、4-庚酮、丙酸丁酯、3-蒈烯、2-庚酮、D-檸檬烯、2-戊基呋喃、戊醇、4-庚醇、順-3-己烯醇、反-2-己烯醇、芳樟醇和γ-己內酯(圖3; 表1)。

圖3 白星花金龜雌成蟲對玉米揮發(fā)物的GC-EAD反應

表1 3種果實兩種狀態(tài)下?lián)]發(fā)物中對白星花金龜雌成蟲有EAD活性的成分

2.4 觸角電生理活性成分的主成分分析(PCA)及聚類分析(CA)

根據(jù)58種成分的主成分分析結果， 4個主成分可解釋的方差百分比能達到72.8%。前兩個PCA成分能夠解釋總變異程度的48.5%，其中第一主成分對總揮發(fā)物的解釋程度為28.3%， 第二主成分為20.2%(圖4)。 根據(jù)主成分1和2的聚類分析結果，可將6個處理的揮發(fā)物大致分成5組(圖5)，分別為來自健康蘋果(G1)、 受害蘋果(G2)、 健康葡萄+受害葡萄(G3)、健康玉米(G4)和受害玉米(G5)。

續(xù)表1 Table 1 continued

圖4 不同狀態(tài)下3種果實揮發(fā)物主成分分析

圖5 基于不同狀態(tài)下3種果實揮發(fā)物主成分1和2的聚類分析譜系圖

根據(jù)各成分在主成分分析中所占權重，蘋果中的釋放量高于其他處理的有14種，將受害蘋果與健康蘋果很好地分離開(圖4)，包括11種酯(2-甲基丁酸甲酯、乙酸丁酯、2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、己酸丙酯、異戊酸己酯和辛酸乙酯)、2種醇(2-甲基丁醇和3-甲基-3-丁烯-1-醇)和1種萜烯(α-法尼烯)。受害后含量顯著下降的成分為7種酯和1種醇，包括2-甲基丁基乙酸酯、 2-甲基丁酸丙酯、 乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、異戊酸己酯和己醇，顯著上升的為1種酯和2種醇，包括己酸乙酯、2-甲基丙醇和2-甲基丁醇(表1)。

葡萄中釋放量高于其他處理的成分有15種，但未能將健康與受害葡萄分離(圖4)。包括9種酯(乙酸異丁酯、丁酸乙酯、乙酸異戊酯、戊酸乙酯、2-丁烯酸乙酯、己酸乙酯、3-己烯酸乙酯、2-己烯酸乙酯和(E,Z)-2,4-癸二烯酸乙酯)，2種醛(庚醛和壬醛)、1種酮(3-羥基-2-丁酮)、1種醇(2-甲基丙醇)、1種萜烯(3-蒈烯)和1種肟(丁酮肟)。受害后含量顯著上升的成分包括1種酯和3種醇，為2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙醇、己醇和順-3-己烯醇(表1)。

玉米中釋放量高于其他處理的成分有21種，較好地將健康與受害玉米分離(圖4)。包括10種醇(1-戊烯-3-醇、戊醇、4-庚醇、順-2-戊烯醇、1,4-戊二烯-3-醇、己醇、順-3-己烯醇、順-2-己烯醇、反-2-己烯醇和芳樟醇)、4種酮(3-己酮、4-庚酮、2-庚酮和香葉基丙酮)、3種酯(3-甲基丁酸乙酯、丙酸丁酯和γ-己內酯)、2種萜烯(D-檸檬烯和α-叩卜任烯)、1種醛(己醛)和1種呋喃(2-戊基呋喃)。根據(jù)統(tǒng)計分析結果發(fā)現(xiàn)，僅順2-己烯醇含量在受害后顯著降低(表1)。

3 討論與結論

蘋果、葡萄和玉米等3種寄主果實受害前、后能夠引起白星花金龜雌成蟲觸角電位反應的揮發(fā)物共有58種(表1)，部分活性物質如己醛、壬醛、己醇、反-2-己烯醇、順-3-己烯醇、2-甲基丁醇、芳樟醇、2-甲基丁基乙酸酯、己酸乙酯、乙酸己酯和3-羥基-2-丁酮等，在前人的研究中已有報道(Chen and Li, 2011; 龔建, 2017; 王瑞笛和王少山, 2018; 王瑞笛, 2019)。有些活性物質對其他金龜甲也具有電生理活性，如己醛、壬醛和芳樟醇等能夠引起高粱花金龜Pachnodainterrupta的觸角電位反應(Bengtssonetal., 2009)；乙酸異戊酯和丁酸乙酯等能引起鰓金龜Holotrichiaserrata的電生理活性(Subaharanetal., 2013)；己醇和反-2-己烯醇能引起歐洲金龜Melolonthamelolontha的電生理反應等(Andreasetal., 2005)。有些物質還能引起白星花金龜和其他金龜?shù)男袨榉磻?，如壬醛、己醛、?2-己烯醛、己醇、反-2-己烯醇、芳樟醇、乙酸丁酯和苯酚等對白星花金龜成蟲具有吸引作用(王清華和張金桐, 2008; 王瑞笛和王少山, 2018; 王瑞笛, 2019)；順-3-己烯醇、芳樟醇、α-法尼烯對日本麗金龜具明顯的吸引作用(Loughrinetal., 1995)；日本麗金龜P.japonica引誘劑(丙酸苯乙酯∶丁香酚∶香葉醇，3∶ 7∶3)對白星花金龜具也有引誘作用(Ladd and McGovern, 1980)；順-3-己烯醇、丁酸丁酯對高粱花金龜具有顯著吸引作用(Wolde-Hawariatetal., 2007; Bengtssonetal., 2009)。這些常見的能夠引起金龜觸角電位及行為反應的活性物質對開發(fā)白星花金龜引誘劑具有重要的參考價值。

金龜甲的取食會導致寄主揮發(fā)物的成分發(fā)生質和量的改變，進而影響金龜?shù)募闹鞫ㄎ?Stensmyretal., 2001)。主成分分析及統(tǒng)計分析結果表明3種果實之間揮發(fā)物差異較大，能夠顯著代表蘋果、葡萄和玉米果實的揮發(fā)性氣味分別有14, 15和21種，這些代表性成分可較好地區(qū)分健康、受害兩種狀態(tài)下的蘋果和玉米，但無法區(qū)分兩種狀態(tài)下的葡萄，這可能與白星花金龜區(qū)分寄主狀態(tài)時的難易程度有關，白星花金龜可能更難以區(qū)分健康和受害狀態(tài)下的葡萄。果實受害前、后釋放的揮發(fā)物中對白星花金龜雌成蟲有電生理活性的成分以酯類和醇類為主。除受害前、后的特有成分外，釋放量顯著減少的酯有7種(2-甲基丁基乙酸酯、2-甲基丁酸丙酯、乙酸戊酯、己酸甲酯、丁酸丁酯、乙酸己酯和異戊酸己酯)；釋放量顯著增加的醇有3種(2-甲基丙醇、2-甲基丁醇和順-3-己烯醇)，說明白星花金龜?shù)娜∈衬軌蛞种?種果實中部分酯的釋放，促進部分醇的釋放。此外，白星花金龜能誘導果實釋放新的醇(3-甲基-3-丁烯-1-醇、戊醇、4-庚醇、芳樟醇和反-2-己烯醇)、酮(3-己酮、4-庚酮、2-庚酮和3-羥基-2-丁酮)和萜烯(3-蒈烯、D-檸檬烯和β-蒎烯)。喜好聚集為害的昆蟲對蟲害誘導的植物揮發(fā)物通常有較強的行為反應。如3-甲基-3-丁烯-1-醇對落葉松八齒小蠹Ipssubelongatus有引誘作用(Zhangetal., 2007)；歐洲鰓金龜Melolonthamelolontha雌蟲取食誘導的己醇、反-2-己烯醇和順-3-己烯醇對雄蟲有顯著的吸引作用(Reineckeetal., 2005)；Y型嗅覺儀行為實驗證明葡萄受害后的特有成分3-羥基-2-丁酮、玉米受害后產生的己醛對白星花金龜成蟲具有引誘作用(王瑞迪, 2019)；乙酸異戊酯對高粱花金龜P.interrupta具有引誘作用(Wolde-Hawariatetal., 2007)；玉米受害后產生的β-蒎烯對花金龜Pachnodamarginata具有引誘作用(Larssonetal., 2003)。因此，研究寄主植物受害前后釋放的揮發(fā)物的變化可能有助于解釋白星花金龜更趨向于受害果實的集群危害習性。

利用嗅覺電生理和室內行為實驗尋找活性物質用于田間測試，是開發(fā)植物源誘劑的常用手段(Dickensetal., 1991; Zhangetal., 2007; Bengtssonetal., 2009)。那些對白星花金龜具有室內行為活性的揮發(fā)物，可直接用于田間誘集試驗，而那些有電生理活性但未測試室內行為反應的揮發(fā)物，可同時開展室內行為測試與田間誘集效果篩選。