張玉環(huán)， 鞏 騫， 張慎芳， 王永泉， 王 君

(1.新泰市中醫(yī)醫(yī)院，山東 新泰 271200；2.山東省中醫(yī)院， 濟(jì)南 250000；3.東營市人民醫(yī)院，山東 東營 257000)

睡眠剝奪可通過介導(dǎo)腦內(nèi)多種神經(jīng)遞質(zhì)引起感覺、精神活動及認(rèn)知功能的復(fù)雜變化，嚴(yán)重影響患者的身心健康及生活質(zhì)量。我國約80%的疾病與睡眠質(zhì)量障礙有關(guān)[1，2]。目前關(guān)于睡眠剝奪的發(fā)病機(jī)制尚不完全明確，亦缺乏切實有效的治療方法。針刺是一種簡便效廉的綠色療法，研究發(fā)現(xiàn)其可促進(jìn)腦卒中、腦癱等患者大腦發(fā)育，改善其適應(yīng)性行為[3，4]。本研究推測針刺可能對睡眠剝奪后認(rèn)知功能障礙有一定的改善作用。研究報道，認(rèn)知障礙可能與海馬炎癥有關(guān)，但主要發(fā)病機(jī)制尚未闡明。非對稱性二甲基精氨酸(asymmetric dimethylarginine，ADMA)是在人體細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生蛋白質(zhì)修飾過程產(chǎn)生的代謝副產(chǎn)物，主要通過二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)降解，ADMA可競爭性抑制一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)活性，減少一氧化氮(nitric oxide，NO)生成。NO具有廣泛血管擴(kuò)張作用，與動脈粥樣硬化、血管痙攣、睡眠呼吸暫停低通氣綜合征患者認(rèn)知功能障礙等多種生理病理過程密切相關(guān)[5，6]。本研究采用調(diào)神益氣針法對睡眠剝奪大鼠進(jìn)行針刺治療，探究其作用效果及對ADMA/DDAH/NO途徑的影響，為臨床治療提供實驗參考。本研究符合動物3R原則，通過新泰市中醫(yī)醫(yī)院倫理委員會審查(倫審字編號20200079號)。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級SD大鼠48只，雄性，8周齡，體質(zhì)量210～230 g，購自南京君科生物工程有限公司，實驗動物許可證號SCXK(蘇)2018-0012。飼養(yǎng)于新泰市中醫(yī)醫(yī)院實驗動物房，自由飲水、采食，溫度23～25 ℃，12 h/12 h光照，黑暗交替，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.2 主要試劑及儀器

逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(貨號K1928)，杭州主諾生物技術(shù)有限公司；熒光定量PCR試劑盒(貨號RR820A)，日本TaKaRa公司；蛋白提取試劑盒(貨號BB-0723)，上海貝博生物科技有限公司；NO檢測分析試劑盒(貨號BC1475)，北京索萊寶科技有限公司；ADMA檢測試劑盒(貨號ab145399)、一抗兔源anti-DDAH(貨號ab180599)、anti-β-actin抗體(貨號ab179467)、羊抗兔IgG二抗(貨號ab205718)，英國Abcam公司。

Morris水迷宮實驗裝置(型號BZ-XM101)，上海吉量軟件科技有限公司；八臂迷宮實驗視頻分析系統(tǒng)(型號JY-ZH-3000)，北京金洋萬達(dá)科技有限公司；實時熒光定量PCR儀(型號QuantStudio5)，賽默飛世爾科技(中國)有限公司；紫外分光光度計(型號Evolution 220)、酶標(biāo)儀(型號FC)，美國Thermo Fisher公司；電泳儀(型號Mini-PROTEAN Tetra)、濕轉(zhuǎn)槽濕式轉(zhuǎn)膜儀(型號1703930)、凝膠成像系統(tǒng)(型號Gel Doc XR)，美國Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 模型建立及分組 采用改良小平臺水環(huán)境法制備大鼠睡眠剝奪模型[7]。制作30 cm×30 cm×30 cm睡眠剝奪箱，中間放置直徑7 cm、高8 cm圓形平臺，平臺周圍注滿水，水位低于平臺1 cm，大鼠可在平臺上自由飲水、采食，每天更換1次水。平臺上的大鼠進(jìn)入快速動眼睡眠階段時，由于骨骼肌肌張力下降可導(dǎo)致觸水驚醒，達(dá)到睡眠剝奪目的，進(jìn)行72 h連續(xù)睡眠剝奪。成模大鼠隨機(jī)分為模型組、假針刺組、針刺組，另取正常飼養(yǎng)無睡眠剝奪大鼠為對照組，每組12只。

1.3.2 針刺方法 造模結(jié)束后，針刺組進(jìn)行調(diào)神益氣針法針刺治療。參照中國針灸學(xué)會實驗針灸學(xué)會制定的《小動物針灸技法手冊》[8]，取大鼠“人中”“百會”“關(guān)元”“內(nèi)關(guān)”(雙側(cè))穴施針，“人中”穴雀啄瀉法捻針30 s，“內(nèi)關(guān)”穴提插瀉法捻針30 s，“百會”穴捻轉(zhuǎn)補(bǔ)法30 s，“關(guān)元”穴提插瀉法捻針30 s，每天上午9∶00治療1次，連續(xù)7 d。假針刺組選取雙側(cè)肋下各2個固定非穴位點，采用平補(bǔ)平瀉捻轉(zhuǎn)手法各20 s，對照組及模型組僅進(jìn)行相同時間、相同程度的抓撓刺激，4組刺激時間及療程均相同。

1.3.3 Morris水迷宮和八臂迷宮實驗 治療結(jié)束后，采用Morris水迷宮實驗[9]和八臂迷宮實驗[10]評估大鼠學(xué)習(xí)認(rèn)知功能。

(1)Morris水迷宮實驗。大鼠進(jìn)行Morris水迷宮適應(yīng)性訓(xùn)練，水迷宮為直徑1.5 m、高50 cm的黑色水池，池內(nèi)放有直徑10 cm的可移動實心平臺，隱藏于第一象限中間水下2 cm，水溫19～21 ℃。將大鼠分別從各個象限面朝池壁放入水中，每天4次，每次120 s。連續(xù)訓(xùn)練4 d后進(jìn)行定位航行試驗，觀察并記錄120 s內(nèi)大鼠找到平臺的時間(即逃避潛伏期)。若大鼠120 s內(nèi)找到平臺，則記錄其實際逃避潛伏期，若120 s內(nèi)仍未找到平臺，用導(dǎo)向桿將大鼠引導(dǎo)至平臺，時間記為120 s，重復(fù)4次求平均值。

(2)八臂迷宮實驗。實驗前大鼠限制飲食2 d后置于迷宮中自由探索2 d，每天2次，每次10 min。不銹鋼材質(zhì)的八臂迷宮各臂末端裝有自動投食器，八臂中2、4、6、8臂末端放入餌料，訓(xùn)練時使大鼠攝取4臂餌料10 min，實驗時將大鼠置于迷宮區(qū)域，15 s打開各臂門，測試時間10 min，大鼠將4臂餌料吃完或10 min內(nèi)到達(dá)4臂，但餌料沒有吃完實驗均結(jié)束。通過觀察動物視頻軌跡行為學(xué)分析系統(tǒng)，記錄實驗過程中大鼠進(jìn)入有餌料臂并吃掉餌料的次數(shù)，即正確次數(shù)；大鼠重復(fù)進(jìn)入吃過餌料臂的次數(shù)，即工作記憶錯誤次數(shù)；大鼠進(jìn)入不放餌料臂的次數(shù)，即參考記憶錯誤次數(shù)；大鼠八臂迷宮探索完成時間，即完成總時間。

1.3.4 海馬DDAH mRNA表達(dá)水平檢測 完成上述試驗后，腹腔麻醉處死大鼠，斷頭取腦，每組隨機(jī)選取6只大鼠左半海馬組織提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，采用實時熒光定量PCR擴(kuò)增DDAH mRNA片段。反應(yīng)條件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，40個循環(huán)，具體操作嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行。引物由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成。DDAH上游引物序列：CTCTTGTGGCATCGGGT GAA，下游引物序列：GTGATCCAAGGAGACACGGC；內(nèi)參GAPDH上游引物序列：ACCACCATGGAGAAG GCTGG，下游引物序列：CTCAGTGTAGCCCAGGA TGC。采用2-ΔΔCT法計算海馬DDAH mRNA相對表達(dá)水平。

1.3.5 海馬DDAH蛋白表達(dá)量檢測 每組隨機(jī)選取6只大鼠右半海馬組織蛋白提取，BCA法測定濃度，取50 μg蛋白樣品進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，添加anti-DDAH(稀釋比1∶1000)、anti-β-actin(稀釋比1∶1000)抗體，4 ℃孵育過夜，添加羊抗兔IgG二抗(稀釋比1∶5000)室溫避光孵育1 h，增強(qiáng)化學(xué)法顯影、拍照，并采用Image J軟件分析各蛋白條帶相對灰度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果

表1示，與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長(P<0.05)；與模型組比較，假針刺組大鼠逃避潛伏期差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，針刺組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)；與假針刺組比較，針刺組大鼠逃避潛伏期顯著縮短(P<0.05)。

表1 各組大鼠Morris水迷宮實驗結(jié)果比較

2.2 各組大鼠八臂迷宮實驗結(jié)果比較

表2示，與對照組比較，模型組大鼠工作記憶錯誤次數(shù)、參考記憶錯誤次數(shù)顯著增加，正確次數(shù)顯著減少，完成總時間顯著延長(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠工作記憶錯誤次數(shù)、參考記憶錯誤次數(shù)顯著減少，正確次數(shù)顯著增加，完成總時間顯著縮短(P<0.05)；假針刺組與模型組大鼠上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；假針刺組與針刺組大鼠上述指標(biāo)比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

表2 各組大鼠八臂迷宮實驗結(jié)果比較

2.3 各組大鼠海馬DDAH mRNA表達(dá)水平比較

表3示，與對照組比較，模型組大鼠海馬DDAH mRNA表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)；與模型組比較，假針刺組大鼠海馬DDAH mRNA表達(dá)水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，針刺組大鼠海馬DDAH mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與假針刺組比較，針刺組大鼠海馬DDAH mRNA表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。

表3 各組大鼠海馬DDAH mRNA表達(dá)水平比較

2.4 各組大鼠海馬ADMA水平、DDAH蛋白表達(dá)量及NO含量比較

圖1表4示，與對照組比較，模型組大鼠海馬ADMA水平、DDAH蛋白表達(dá)量顯著降低，NO含量顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，針刺組大鼠海馬ADMA水平、DDAH蛋白表達(dá)量顯著增加，NO含量顯著降低(P<0.05)；假針刺組與模型組大鼠上述指標(biāo)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；假針刺組與針刺組大鼠上述指標(biāo)比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。

圖1 各組大鼠海馬二甲基精氨酸二甲胺水解酶(dimethylarginine dimethylaminohydrolase，DDAH)蛋白條帶比較

表4 各組大鼠海馬ADMA水平、DDAH蛋白表達(dá)量及NO含量比較

3 討論

睡眠是機(jī)體維持正常生理功能的必要條件，睡眠障礙會影響機(jī)體多個系統(tǒng)的生理功能[11]。快速眼動睡眠與學(xué)習(xí)和記憶密切相關(guān)，快速眼動睡眠剝奪可損害學(xué)習(xí)和記憶能力[12-14]，但其潛在機(jī)制目前尚不明確。小平臺水環(huán)境法可剝奪大鼠全部快波睡眠，減少慢波睡眠及異相睡眠且簡單可靠，是研究睡眠剝奪的常用方法[15]。本研究亦采用小平臺水環(huán)境法對大鼠進(jìn)行72 h睡眠剝奪，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期、完成八臂迷宮總時間顯著延長，工作記憶錯誤次數(shù)、參考記憶錯誤次數(shù)顯著增加，正確次數(shù)顯著減少，提示模型制備成功，睡眠剝奪大鼠存在認(rèn)知障礙。

所謂調(diào)神益氣針法即以針刺治神益氣，主穴選取人中、百會、關(guān)元及內(nèi)關(guān)，可隨癥加減配穴。人中是調(diào)神之要穴，總督人身之陽，針刺之可調(diào)神益氣。百會又名“三陽五會”是“陽脈之?！?，針刺可益氣通督，升提中氣，益氣健腦。內(nèi)關(guān)穴為八脈交會穴之一，通陰維，具有益心氣、調(diào)神智、活血通絡(luò)之功效。關(guān)元穴可大補(bǔ)元陽，具有壯陽益氣之功效，可治療諸虛百損[16，17]。張玉等[18]研究報道，調(diào)和氣血、補(bǔ)心益智針刺法可有效改善乳腺癌化療相關(guān)認(rèn)知障礙氣血失調(diào)證患者認(rèn)知功能損傷及情緒、失眠、疲乏等癥狀。劉欣等[19]研究報道，調(diào)神益氣針法可有效緩解中風(fēng)后疲勞，改善心境，增強(qiáng)患者積極主動性，改善其生存質(zhì)量。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與模型組比較，調(diào)神益氣針法針刺治療可顯著縮短大鼠逃避潛伏期、完成八臂迷宮總時間，減少工作記憶錯誤次數(shù)、參考記憶錯誤次數(shù)，增加八臂迷宮測試正確次數(shù)，提示調(diào)神益氣針法可有效改善睡眠剝奪大鼠認(rèn)知障礙。

NO是血管活性調(diào)節(jié)物質(zhì)，大腦和脊髓神經(jīng)元在生理和病理條件下都能通過NOS產(chǎn)生NO，維持血管張力、神經(jīng)遞質(zhì)功能和調(diào)節(jié)細(xì)胞防御功能等。但高水平NO是由小膠質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生，具有神經(jīng)毒性，在神經(jīng)退行性變及睡眠障礙中發(fā)揮作用[20，21]。劉行海等[22]研究報道，降低海馬NO水平可顯著改善2型糖尿病大鼠認(rèn)知障礙。Gill等[23]研究報道，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生NO可減輕神經(jīng)炎癥及毒性作用。而ADMA是NOS內(nèi)源性競爭抑制劑，影響NO合成。Xiao等[24]研究報道，抑制氧化應(yīng)激作用能夠減少ADMA表達(dá)，通過上調(diào)DDAH1、DDAH2、NO水平，調(diào)節(jié)ADMA/DDAH/NO途徑治療大鼠失眠。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組比較，模型組大鼠海馬ADMA水平、DDAH mRNA及蛋白表達(dá)水平顯著降低，NO含量顯著增加，而調(diào)神益氣針法針刺可增加睡眠剝奪大鼠海馬ADMA水平、DDAH mRNA及蛋白表達(dá)水平，減少NO含量，與Xiao等[24]結(jié)果不完全一致，可能與NO測量時期及疾病異質(zhì)性、發(fā)展階段不同有關(guān)，提示調(diào)神益氣針法針刺治療減輕睡眠剝奪大鼠認(rèn)知功能障礙，可能與調(diào)節(jié)ADMA/DDAH/NO途徑有關(guān)。

綜上所述，調(diào)神益氣針法可減輕睡眠剝奪大鼠認(rèn)知障礙，可能與調(diào)節(jié)ADMA/DDAH/NO途徑有關(guān)。但關(guān)于其具體作用機(jī)制及是否涉及其他通路共同參與有待進(jìn)一步探究。