趙 慧陳文文*朱麗萍葛 鴻

(1.青島市中醫(yī)醫(yī)院(市海慈醫(yī)院)內(nèi)分泌科,山東 青島 266033;2.青島市中醫(yī)醫(yī)院(市海慈醫(yī)院)神經(jīng)外科,山東 青島 266033)

自身免疫性甲狀腺疾病(autoimmune thyroid disease,AITD)是病變部位主要發(fā)生在甲狀腺的自身免疫性疾病,主要包括Grave 病(GD)和橋本甲狀腺炎(hashimotos thyroiditis,HT),其發(fā)病機制復雜,涉及遺傳、免疫和環(huán)境等多種因素[1-2]。 目前的研究發(fā)現(xiàn),AITD 與甲狀腺細胞炎癥相關(guān)信號轉(zhuǎn)導異常、炎癥反應有關(guān)[3],而維生素D 在機體多種自身免疫性疾病中起調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)、增強固有免疫系統(tǒng)和抑制抑制適應性免疫系統(tǒng)的作用[4]。 1,25 二羥基維生素D3(1, 25-dihydroxy vitamin D3, 1, 25(OH)2D3)是維生素D 在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物,通過與細胞內(nèi)的特異性維生素D 受體(vitamin D receptor, VDR)結(jié)合在機體骨鈣代謝、細胞生長和分化中發(fā)揮重要作用[5-6]。 大量的研究表明,維生素D 與AITD 相關(guān),缺乏維生素D 可能增加罹患AITD 的風險,但關(guān)于其對AITD 的作用機制及其對機體自身免疫情況的研究還較為缺乏[7-10]。 因此,本研究建立實驗性自身免疫性甲狀腺炎大鼠模型,研究1,25(OH)2D3對自身免疫性甲狀腺炎大鼠免疫指標及以TLR2/NF-κB 信號通路的影響,以期為自身免疫性甲狀腺炎的臨床治療提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF 級SD 雄性健康大鼠120 只,4 ～5 周齡,體重(200±10)g,由青島博隆實驗動物有限公司提供[SCXK(魯)2017-0006]。 所有動物飼養(yǎng)于青島市中醫(yī)醫(yī)院動物中心[SYXK(魯)2018-0026]暫養(yǎng),溫度保持在21℃～25℃,相對濕度為50%～60%,自然光照明,自由進食進水,保持飼養(yǎng)環(huán)境清潔,適應性飼喂1 周后進行實驗分組和造模。 所有實驗動物經(jīng)青島市中醫(yī)醫(yī)院實驗倫理委員會審核并批準(IACUC-2018-0141),實驗過程遵循3R 原則。

1. 2 主要試劑與儀器

1,25(OH)2D3注射劑(江蘇吳中醫(yī)藥集團有限公司,15 mg/mL,批號130232);完全弗氏佐劑(complete Freund’s adjuvant,CFA)、不完全弗氏佐劑(incomplete Freund’s adjuvant,IFA)(美國Sigma公司);大鼠甲狀腺球蛋白(mouse thyroglobulin,mTg)(上海源葉生物科技有限公司);血清游離三碘甲狀腺原氨酸(free triiodothyronine,FT3)、血清游離甲狀腺素(free thyroxine,FT4) 及促甲狀腺激素(thyroid stimulating hormone,TSH)放射免疫分析試劑盒(北京北方生物技術(shù)研究所);白細胞介素-6(interleukin-6, IL-6)、IL-10、IL-12 及腫瘤壞死因子-α(Tumor necrosis factor, TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測試劑盒(上海廣銳生物科技有限公司);甲狀腺球蛋白抗體(thyroglobulin antibody,TGAb)、甲狀腺過氧化酶抗體(thyroid peroxidase antibody, TPOAb)(武漢基因美生物科技有限公司);兔抗大鼠TLR2、NF-κB、MyD88、TRAF-6 抗體,β-actin 蛋白抗體(英國Abcam 公司);DAB 顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司);HRP 標記羊抗兔IgG(上海拜沃生物科技有限公司);TRIzol總RNA 提取試劑(Invitrogen 公司);RNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本TaKaRa 公司);SYBR Greeb PCR Master Mix 試劑盒(美國Bio-Rad 公司);RIPA 裂解液(上海碧云天生物技術(shù)有限公司);超敏化學發(fā)光試劑盒(瑞士Thermo 公司);HE 染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

CX41 型光學顯微鏡購自日本Olympus 公司;ChemiDoc XRS 型凝膠成像儀購自美國Bio-Rad 公司;Centrifuge 5430R 低溫高速離心機購自德國Eppendorf 公司;HM 340E 切片機購自賽默飛世爾(中國)有限公司;UV2100 型紫外分光光度計(日本島津有限公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1 動物造模

按照參考文獻[11]對除對照組外的實驗大鼠進行造模,對造模大鼠給予100 μg 的mTg+CFA 皮下注射,連續(xù)2 周,每周1 次,完成大鼠初次免疫;從第3～6 周,再對造模大鼠給予相同劑量的mTg+CFA皮下注射進行重復免疫,對照組大鼠給予水+CFA皮下注射,注射時間及次數(shù)與模型組一致。 第7 周取造模大鼠眶靜脈血,采用ELISA 法測定血清TPOAb 水平,TPOAb＞60 IU/mL 即為造模成功。 造模過程中死亡3 只大鼠,造模成功率為97%。

1.3.2 分組及給藥

將造模成功大鼠按隨機數(shù)字表法分為模型組和1,25(OH)2D3低、中、高劑量組,每組15 只。 從第7 周開始對治療組大鼠進行藥物干預,低、中、高劑量組每天給予大鼠腹腔注射0.5、1.0、1.5 μg/kg 1,25(OH)2D3注射劑,對照組和模型組注射等量蒸餾水,硒酵母片對照組注射硒酵母混懸液(每天1 次),連續(xù)干預4 周。

1.3.3 HE 染色

末次給藥后麻醉處死大鼠,摘取大鼠甲狀腺組織,采用4%多聚甲醛溶液固定大鼠甲狀腺組織1 周,經(jīng)乙醇脫水、石蠟包埋、蘇木精-伊紅(HE)染色后切片(5 μm),光學顯微鏡下觀察各組大鼠甲狀腺組織病理結(jié)構(gòu)改變,應用Image J 圖像分析軟件統(tǒng)計細胞核數(shù)和甲狀腺濾泡面積。

1.3.4 大鼠血清甲狀腺激素、自身免疫抗體及炎性因子檢測

末次給藥后麻醉大鼠,采集心臟血2 mL,離心20 min(3000 r/min),收集上清液,采用ELISA 試劑盒按操作規(guī)程檢測各組大鼠血清自身免疫抗體(TGAb、TPOAb)水平及炎性因子(IL-6、IL-10、IL-12、TNF-α)水平;采用RIA 法檢測大鼠血清FT3、FT4 及TSH 水平。

1.3.5 RT-PCR

大鼠基因序列從美國國家生物技術(shù)中心相關(guān)數(shù)據(jù)庫查詢獲得,通過Primer Premier 6.0 軟件設(shè)計,引物序列(見表1),由上海生物工程股份有限公司合成。 取大鼠甲狀腺組織并采用超聲粉碎,TRIzol 提取總RNA,紫外分光光度計測定吸光度值,分析總RNA 純度。 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA,PCR 擴增,熒光定量PCR 儀檢測mRNA 表達水平。 反應體系為30 μL(SYBR Greeb PCR Master Mix(2×)15 μL,cDNA 1 μL,Primer A、Primer B 各0.5 μL,無RNA 酶H2O 13 μL)。 定量擴增程序為:95℃預變性10 min,95℃變性15 s,60℃退火50 s,共40 個循環(huán)。 反應均以β-actin 為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt算法計算mRNA 相對表達量。

表1 TLR2/NF-κB 信號通路相關(guān)基因及內(nèi)參引物序列Table 1 TLR2/NF-κB signaling pathway related genes and primer sequences

1.3.6 Western blot

取小鼠甲狀腺組織,置于勻漿器中,加入RIPA細胞裂解液裂解后勻漿,低溫高速離心機離心(12000 r/min,10 min),收集上清液并采用BCA 法測定蛋白濃度。 取30 μL 蛋白進行SDS-PAGE 凝膠電泳,電轉(zhuǎn)至PVDF 膜,浸入含有5%脫脂奶粉的封閉液中孵育1 h,加入適宜濃度一抗室溫下封閉過夜。 次日加入辣根過氧化物酶標記二抗孵育1 h,TBST 沖洗后采用ECL 化學發(fā)光試劑盒進行檢測,凝膠成像系統(tǒng)成像,以GAPDH 為內(nèi)參,分析條帶灰度值,計算小鼠TLR4、NF-κB p65 和I-κBα 蛋白相對表達量。

1.4 統(tǒng)計學方法

數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用SPSS 21.0 軟件,數(shù)據(jù)采用平均數(shù)±標準差(ˉx±s)表示,多組間比較采用單因素方差分析,兩組間比較采用LSD-t檢驗,采用Graphpad 5.0 進行繪圖分析,P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠甲狀腺組織病理改變情況

對照組大鼠甲狀腺濾泡大小適中,腔內(nèi)膠質(zhì)充盈,濾泡上皮細胞完整,呈低立方狀;模型組濾泡變小或被破裂,濾泡上皮細胞呈高柱狀,細胞核數(shù)量明顯增多,膠質(zhì)減少,形狀不規(guī)則,細胞腔內(nèi)及細胞間質(zhì)可見大量炎性細胞浸潤;各給藥組大鼠甲狀腺炎性細胞浸潤減少,濾泡上皮細胞由高柱狀變?yōu)榱⒎街鶢?細胞核數(shù)量減少,濾泡細胞腔內(nèi)膠質(zhì)增多,硒酵母片對照組小灶狀改變,1,25(OH)2D3低劑量組呈小片狀改變,1,25(OH)2D3中劑量組僅見散在淋巴細胞浸潤,1,25(OH)2D3高劑量組呈點片狀改變,見圖1、表2。

注:A:對照組,大鼠甲狀腺濾泡完整,大小適中,腔內(nèi)膠質(zhì)充盈,間質(zhì)未見炎性細胞浸潤;B:自身免疫性甲狀腺炎模型組,大鼠甲狀腺濾泡縮小或被破壞,大小不均,間質(zhì)有大量炎性細胞浸潤,腔內(nèi)膠質(zhì)減少;C:硒酵母片對照組,大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)較完整,間質(zhì)炎性細胞浸潤減少,膠質(zhì)含量略減少;D:1,25(OH)2D3低劑量組,呈點片狀改變,甲狀腺濾泡大小不均,間質(zhì)可見炎性細胞浸潤,腔內(nèi)膠質(zhì)較少;E:1,25(OH)2D3中劑量組,大鼠甲狀腺濾泡增大,間質(zhì)少量炎性細胞浸潤,腔內(nèi)膠質(zhì)增加;F:1,25(OH)2D3高劑量組,呈小片狀改變,大鼠甲狀腺濾泡結(jié)構(gòu)較為完整,間質(zhì)僅見散在炎性細胞浸潤,膠質(zhì)含量增加。

表2 各組大鼠甲狀腺系數(shù)、甲狀腺細胞和核數(shù)及濾泡面積比較(ˉx±s,n=5)Table 2 Comparison of thyroid coefficient, number of thyroid cells and nuclei and follicular area in each group

2.2 各組大鼠甲狀腺抗體和甲狀腺功能比較

與對照組比較,模型組、硒酵母片對照組以及1,25(OH)2D3各劑量組TGAb、TPOAb、FT3、FT4 均增加,TSH 均降低,其中模型組與對照組比較,差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組比較,硒酵母片對照組和1,25(OH)2D3各劑量組TGAb、TPOAb、FT3、FT4 均降低,TSH 均增加,呈現(xiàn)出劑量依賴性,差異均具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖2。

2.3 各組大鼠血清炎性因子水平

與對照組比較,模型組大鼠血清IL-6、IL-12和TNF-α 水平顯著升高(P＜0. 01),IL-10 水平顯著降低(P＜0. 01);與模型組比較,硒酵母片對照組血清IL-6、IL-12 和TNF-α 水平顯 著降低(P＜0. 01),IL-10 水 平 顯 著 增 加(P＜0. 01),1,25(OH)2D3各劑量組IL-6 與模型組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0. 05),中、高劑量1,25(OH)2D3組IL-12、IL-10 及TNF-α 與模型組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0. 05),見圖3。

注:與對照組相比,aP＜0.05,bP＜0.05;與模型組相比,cP＜0.05,dP＜0.05。圖2 各組大鼠甲狀腺抗體和甲狀腺功能比較(xˉ±s,n=5)Note. Compared with the control group,aP＜0.05,bP＜0.05. Compared with the model group,cP＜0.05,dP＜0.05.Figure 2 Comparison of thyroid antibody and thyroid function of rats in each group

注:與對照組相比,aP＜0.05,bP＜0.05;與模型組相比,cP＜0.05,dP＜0.05。

2.4 各組大鼠甲狀腺組織TLR2、MyD88、TRAF-6和NF-κB mRNA 表達

與對照組比較,模型組大鼠甲狀腺組織中TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB mRNA 表達顯著均顯著增加(P＜0.05)。 與模型組比較,硒酵母片對照組及1,25(OH)2D3各劑量組各指標蛋白表達均不同程度降低,硒酵母片對照組各指標蛋白mRNA 表達水平與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);1,25(OH)2D3各劑量組TRAF-6 與模型組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),高劑量組TLR2、中、高劑量組MyD88、NF-κB 與模型組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖4。

2.5 各組大鼠甲狀腺組織TLR2、MyD88、TRAF-6和NF-κB 蛋白表達

與對照組比較,模型組大鼠甲狀腺組織中TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB 蛋白表達顯著均顯著增加(P＜0.05)。 與模型組比較,硒酵母片對照組及1,25(OH)2D3各劑量組各指標蛋白表達均不同程度降低,硒酵母片對照組各指標蛋白表達與模型組比較差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);1,25(OH)2D3各劑量組TRAF-6 蛋白表達與模型組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),高劑量組TLR2、中、高劑量組MyD88、NF-κB 蛋白表達與模型組差異具有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),見圖5。3 討論

注:與對照組相比,aP＜0.05,bP＜0.05;與模型組相比,cP＜0.05,dP＜0.05。圖4 各組大鼠甲狀腺組織TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB mRNA 表達(xˉ±s,n=5)Note. Compared with the control group,aP＜0.05,bP＜0.05. Compared with the model group,cP＜0.05,dP＜0.05.Figure 4 mRNA expression of TLR2, MyD88, TRAF-6 and NF-κB in thyroid tissue of rats in each group

注:與對照組相比,aP＜0.05,bP＜0.05;與模型組相比,cP＜0.05,dP＜0.05。圖5 各組大鼠甲狀腺組織TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB 蛋白表達比較(xˉ±s,n=5)Note. Compared with the control group,aP＜0.05,bP＜0.05. Compared with the model group,cP＜0.05,dP＜0.05.Figure 5 Comparison of TLR2, MyD88, TRAF-6 and NF-κB protein expression in thyroid tissue of rats in each group

甲狀腺能夠調(diào)節(jié)機體能量代謝速度、機體合成蛋白以及調(diào)節(jié)機體對多種激素的敏感性。 為研究1,25(OH)2D3對自身免疫性甲狀腺炎大鼠的影響,本研究采用多次注射mTg+CFA 進行大鼠免疫建立自身免疫性甲狀腺炎模型。 HE 染色結(jié)果顯示,模型大鼠甲狀腺組織被大量炎性細胞浸潤,濾泡腔內(nèi)膠質(zhì)減少,形狀不規(guī)則,提示造模成功。 模型大鼠血清水平FT3、FT4、TSH 及TGAb、TPOAb 水平顯著增加,提示模型大鼠甲狀腺功能減退,而1,25(OH)2D3干預后,大鼠甲狀腺組織炎性細胞浸潤減少,濾泡形狀趨于規(guī)則,腔內(nèi)膠質(zhì)增加,血清水平FT3、FT4、TSH 及TGAb、TPOAb 水平不同程度降低,提示1,25(OH)2D3可有效改善自身免疫性甲狀腺炎大鼠甲狀腺功能。

自身免疫性甲狀腺炎屬于免疫性疾病,其發(fā)病多與免疫細胞、免疫因子及其免疫相關(guān)信號通路相關(guān)[12]。 維生素D 是一種脂溶性維生素,在包括T 細胞、B 細胞和抗原呈遞細胞上均有表達,1,25(OH)2D3是其活性形式,可直接導致免疫狀態(tài)改變[13-14]。 維生素D 對自身免疫性疾病的影響主要體現(xiàn)在CD4+T 細胞的功能由1 類輔助性T 細胞(helper T cell 1, Th1)和2 類輔助性T 細胞(helper T cell 2, Th2)兩條鏈相互拮抗保持平衡[15]。 Th1型細胞可分泌促炎性細胞因子IL-6、IL-10 和TNF-α,從而促進免疫應答[16],Th2 型細胞可分泌抗炎性細胞因子IL-10,從而抑制免疫應答[17]。 IL-6為趨化因子家族成員,具有促進T 淋巴細胞增殖和活化,促進B 細胞增殖和分泌抗體等功能[18]。 IL-12 主要由B 細胞和巨噬細胞產(chǎn)生,具有促進活性T細胞增殖、促進Th0 細胞向Th1 細胞分化、誘導細胞毒性T 淋巴細胞與NK 細胞的毒性并促進其分泌TNF-α、INF-γ 的作用[19]。 IL-10 可抑制活化T 淋巴細胞,減少甲狀腺內(nèi)CD4+和CD8+淋巴細胞數(shù)量,抑制甲狀腺組織中淋巴細胞浸潤[20]。 TNF-α 為促炎因子,參與機體免疫反應和炎癥反應。 本研究顯示,模型組大鼠血清IL-6、IL-12 和TNF-α 水平較正常對照組顯著升高,IL-10 含量則顯著降低,而1,25(OH)2D3干預后可顯著降低大鼠血清IL-6、IL-12 和TNF-α 水平,增加血清IL-10 水平(圖3)。 在維生素D 充足的情況下,1,25(OH)2D3能抑制Th1細胞分泌因子,從而降低血清IL-6、IL-10 和TNF-α水平。 王棟鋼等[21]早期的研究表明,1,25(OH)2D3可下調(diào)INF-γ 水平、上調(diào)IL-10 水平,有利于恢復和維持Th1 和Th2 平衡。

TLR 是一種跨膜受體蛋白,當機體受到外源分子刺激時,TLR 與MyD88 結(jié)合,IL-1 受體相關(guān)激酶4(IRAK-4)磷酸化后與激活腫瘤壞死因子受體相關(guān)基因6(TRAF-6)相互作用,促I-κB 磷酸化降解,激活NF-κB,誘導炎癥因子表達,最終導致炎癥發(fā)生[22-23]。 NF-κB 是一種關(guān)鍵的核轉(zhuǎn)錄因子,可促進炎性細胞因子的表達,在免疫和炎癥反應中具有重要作用[24]。 本研究結(jié)果顯示,與自身免疫性甲狀腺炎模型大鼠比較,1,25(OH)2D3各劑量組TLR2、MyD88、TRAF-6 和NF-κB mRNA 和蛋白表達均降低。 結(jié)合炎癥因子IL-6、IL-10、IL-12 和TNF-α 的變化,表明1,25(OH)2D3能通過TLR2/NF-κB 信號通路抑制炎癥因子IL-6、IL-10、IL-12 和TNF-α 的表達,從而減輕自身免疫性甲狀腺大鼠炎癥反應。

綜上所述,1,25(OH)2D3對自身免疫性甲狀腺炎大鼠的甲狀腺功能有一定的改善作用,并能機體自身免疫抗體水平,其機制可能與1,25(OH)2D3抑制TLR2/NF-κB 信號通路活性,從而調(diào)控IL-6、IL-10、IL-12 和TNF-α 等炎癥因子釋放有關(guān)。