劉百奇 車德馨 侯慶露 王典 徐東輝

齊齊哈爾市第一醫(yī)院骨外科，黑龍江 齊齊哈爾 161005

骨性關(guān)節(jié)炎(OA) 是一種由多因素相互作用導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨完整性受損，累及軟骨下骨和關(guān)節(jié)邊緣骨贅形成的關(guān)節(jié)疾病[1]。其發(fā)病機制與軟骨細胞中炎性因子過度釋放營造的炎性微環(huán)境和細胞凋亡有關(guān)[2]。目前尚無治愈OA的方法，通過尋找OA相關(guān)的病理調(diào)控基因，探索OA病程中潛在的分子靶目標(biāo)，有助于找到OA的分子治療途徑。

長鏈非編碼RNA (long non-coding RNA, lncRNA)參與多種生物學(xué)過程，如細胞增殖、分化、凋亡、炎癥反應(yīng)等[3-4]。小核仁RNA宿主基因1 (SNHG1)是一種位于染色體11q12.3的新型lncRNA。研究表明，SNHG1的功能障礙與人類疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，如骨肉瘤、骨肉瘤、結(jié)直腸癌、肝癌等[5-6]。在一些疾病中，SNHG1能夠與某些miRNAs結(jié)合調(diào)控基因的表達[7-8]。長鏈非編碼RNA-微小RNA(LncRNA-miRNA)高度參與機體生理病理的分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，LncRNA作為上游主導(dǎo)基因，充當(dāng)miRNA負(fù)調(diào)節(jié)的分子海綿，參與OA等疾病的進展[9-10]。研究表明SNHG1通過激活miR-16-5p介導(dǎo)的p38 MAPK和NF-κB信號通路，能緩解IL-1β-誘導(dǎo)的OA炎癥[11]。這提示SNHG1可能參與OA發(fā)生、發(fā)展的過程。

miR-195-5p在OA患者關(guān)節(jié)軟骨組織和LPS刺激的ATDC5細胞中均顯著上調(diào)，miR-195-5p抑制劑通過調(diào)控Wnt/βcatenin和NF-κB信號通路，抑制軟骨細胞凋亡和炎癥反應(yīng)，對OA具有保護作用[12]。多項研究中miR-195-5p被證明受LncRNA SNHG12或XIST調(diào)控，在骨肉瘤的分子機制中發(fā)揮調(diào)節(jié)作用[13-14]。我們在starbase數(shù)據(jù)庫中發(fā)現(xiàn)SNHG1和miR-195-5p二者存在潛在靶向位點。有報導(dǎo)稱SNHG1和miR-195-5p在肝細胞癌與結(jié)直腸癌中存在靶向調(diào)控關(guān)系[15]。Zhang等[16]報道了SNHG1通過抑制miR-195-5p的表達來抑制肝細胞癌細胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移。目前尚未有文獻報道二者在OA病理機制中作用，我們猜想存在SNHG1-miR-195-5p調(diào)控介導(dǎo)軟骨細胞的凋亡與炎性微環(huán)境，報道如下。

1 材料和方法

1.1 軟骨組織標(biāo)本收集

在2017年10月至2019年10月期間，共收集OA及非OA患者標(biāo)本各52例，OA患者年齡(58.9±5.3)歲，包括30例男性，22例女性。非OA患者年齡(59.3±4.8)歲，包括28例男性，24例女性。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡18～65歲，參照2003年美國風(fēng)濕病學(xué)院(ACR)診斷。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并惡性腫瘤及其他骨關(guān)節(jié)病，存在感染、妊娠及哺乳期，合并嚴(yán)重肢體功能障礙者。本研究通過醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，所有患者均簽署知情同意書。

1.2 軟骨細胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和OA細胞模型的建立

購買人軟骨細胞C-28 / I2(北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院)，培養(yǎng)于含有10 %PBS的DMEM培養(yǎng)基(上?？道噬锟萍加邢薰?中，在37 ℃，5 % CO2的環(huán)境下進行培養(yǎng)。采用Lipofectamine? 2000試劑盒(杭州沃森生物技術(shù)有限公司)對軟骨細胞進行轉(zhuǎn)染，操作步驟嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行。其中，主要轉(zhuǎn)染物有SNHG1過表達質(zhì)粒即促進劑(SNHG1)、空載體質(zhì)粒(pcDNA3.0)、miR-195-5p抑制劑(inhibitor)、miR-195-5p模擬物(miR-195-5p)、miR陰性對照(miR-NC)(廣州復(fù)能基因有限公司)。轉(zhuǎn)染24 h后，通過RT-qPCR驗證轉(zhuǎn)染效率。OA模型建立[17]，是將細胞置于5 μg/mL脂多糖(LPS)(上海恒渡生物科技有限公司)環(huán)境中，37 ℃干預(yù)5 h。未進行LPS干預(yù)的細胞作為對照。

1.3 動物模型的建立

采購SD大鼠[雌性，體重(225±25)g](上海弗爾博生物科技有限公司)，依據(jù)飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)進行飼養(yǎng)，經(jīng)本院動物保護委員會批準(zhǔn)。改良Hulth法建立OA大鼠模型[18]，在全麻下，經(jīng)膝內(nèi)側(cè)切口，打開關(guān)節(jié)腔，切斷前交叉韌帶并切除內(nèi)側(cè)半月板等步驟，通過內(nèi)、外側(cè)應(yīng)力試驗和前抽屜試驗來驗證手術(shù)是否成功。對照組為假手術(shù)組，只打開關(guān)節(jié)腔。術(shù)后強迫大鼠活動，術(shù)后3周對模型組大鼠關(guān)節(jié)內(nèi)分別注射SNHG1促進劑(SNHG1)、miR-195-5p抑制劑(inhibitor)(60 mg / kg體重，持續(xù)3 d)，單純模型組與對照組注射生理鹽水。大鼠分為對照組(n=10)、模型組(n=10)、模型組基礎(chǔ)上SNHG1干預(yù)組(SNHG1，n=10)、模型組基礎(chǔ)上inhibitor干預(yù)組(inhibitor，n=10)。最后一次注射后2周，對大鼠施行安樂死，收集軟骨組織。

1.4 實時定量PCR

Trizol試劑(杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司)提取細胞中的總RNA，以反轉(zhuǎn)錄試劑盒(北京杰輝博高生物技術(shù)有限公司)進行反轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄后對合成的互補DNA進行擴增。引物設(shè)計(無錫懷信生物醫(yī)藥科技有限公司)。mRNA使用β-Actin作內(nèi)參，miRNA使用U6作為內(nèi)參，相對表達量以2-△△Ct進行分析。

1.5 細胞凋亡檢測

收集轉(zhuǎn)染后軟骨細胞，經(jīng)PBS(北京華邁科生物技術(shù)有限責(zé)任公司)洗滌后添加了含F(xiàn)ITC(2 μL)(上海金穗生物科技有限公司)與PI(5 μL)(北京凱瑞基生物科技有限公司)500 μL的結(jié)合緩沖液并放置于陰暗環(huán)境中，1 h后流式細胞儀(北京安麥格貿(mào)易有限公司)測量細胞凋亡率。

1.6 酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)

通過ELISA試劑盒(上海恒斐生物科技有限公司)測定人軟骨細胞、大鼠軟骨組織中IL-1β、IL-6、TNF-α，嚴(yán)格按照操作說明書進行，最后實用酶標(biāo)儀(北京安麥格貿(mào)易有限公司)在450 nm處測量吸光度。

1.7 細胞增殖檢測

以MTT試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司)進行檢測，先接種細胞于96孔板(密度：5×104個細胞/孔)，在不同孵育時間向每孔添加20 μL的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，接著逐個孔混入150 μL的DMSO，震蕩10 min，最后酶標(biāo)儀在450 mm的波長下測量吸光度值。

1.8 蛋白質(zhì)印跡分析

通過RIPA緩沖液(北京欣華綠源科技有限公司)分離細胞組織中的蛋白，經(jīng)10 %SDS-PAGE(南京恩晶生物科技有限公司)電離后轉(zhuǎn)PVDF膜(北京凱瑞基生物科技有限公司)，使用封閉液(上海恒斐生物科技有限公司)封閉1 h。再使一抗與膜在4 ℃溫育過夜，一抗包括IL-1β、IL-6、TNF-α、Caspase-3、Bax、Bcl-2以及β-Actin(北京百奧萊博科技有限公司)。將樣品與HRP偶聯(lián)的二抗(上海伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品有限公司)在37 ℃雜交。最后，通過化學(xué)發(fā)光試劑盒(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司)分析蛋白條帶。

1.9 雙熒光素酶報告檢測

將野生型(Wt)與突變型(Mut)的SNHG1、miR-195-5p片段的互補DNA片段亞克隆到熒光素酶報告載體中熒光素酶基因下游。將上述SNHG1片段與miR-195-5p或miR-NC共轉(zhuǎn)染，48 h后，用雙熒光素酶報告試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)連續(xù)測定細胞裂解物中熒光素酶活性。

1.10 RNA免疫共沉淀

通過EZMagna RIP試劑盒(上海谷研實業(yè)有限公司)進行測定。細胞經(jīng)過裂解，與蛋白A磁珠、一抗孵育 1 h，再在4 ℃免疫沉淀8 h。最后，提純RNA后檢測SNHG1、miR-195-5p表達量。

1.11 RNA下拉實驗

分別用生物素化miR-195-5p-Wt、miR-195-5p-Mut和Bio-NC(陰性對照)，轉(zhuǎn)染于軟骨細胞。48 h后，孵育細胞裂解物與M-280鏈霉菌磁珠，檢測與珠子結(jié)合的RNA復(fù)合物中SNHG1的水平。

1.2 統(tǒng)計學(xué)處理

采用GraphPad Prism 6.0軟件處理數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，所有實驗均進行至少3次。應(yīng)用獨立樣本t檢驗、單因素方差分析、LSD-t檢驗、重復(fù)測量方差分析、Bonferroni檢驗進行分析，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。Pearson相關(guān)系數(shù)檢驗SNHG1、miR-195-5p相關(guān)性。

2 結(jié)果

2.1 SNHG1在OA中下調(diào)，而miR-195-5p在OA中上調(diào)

SNHG1在OA患者軟骨組織中下調(diào)，而miR-195-5p在OA患者軟骨組織中上調(diào)，二者在大鼠OA模型中也具有相似表現(xiàn)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，二者還具有顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.713，P<0.001)。見圖1。

注：A～B：在OA患者軟骨組織中SNHG1水平較低，miR-195-5p水平較高；C：在大鼠OA模型軟骨組織中SNHG1低表達，miR-195-5p高表達；D：在OA患者軟骨組織中，SNHG1與miR-195-5p呈負(fù)相關(guān)。與對照組或兩組比較，**P<0.01，***P<0.001。圖1 SNHG1、miR-195-5p的表達Fig.1 Expression levels of SNHG1 and miR-195-5p

2.2 SNHG1過表達可降低軟骨細胞中LPS誘導(dǎo)下細胞的高凋亡率并改善炎癥微環(huán)境

細胞分析顯示，LPS誘導(dǎo)下，軟骨細胞的凋亡水平以及炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α表達以及蛋白水平顯著上升，細胞增殖能力受到明顯抑制。通過轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒到軟骨細胞中，實現(xiàn)SNHG1的過表達后，以上軟骨細胞的表現(xiàn)得到顯著改善，但是和對照組相比還具有顯著差異。以上結(jié)果均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

注：A：SNHG1轉(zhuǎn)染效率；B：LPS誘導(dǎo)下軟骨細胞的凋亡率顯著提高，而SNHG1可抑制細胞凋亡水平，及其流式細胞圖；C～D：LPS誘導(dǎo)下軟骨細胞的炎癥因子表達與蛋白水平均顯著提高，而SNHG1可改善這種炎性狀態(tài)，及其蛋白圖；E：LPS誘導(dǎo)下軟骨細胞的增殖受到抑制，而SNHG1可解除這種抑制作用。與Control相比，*P<0.05，**P<0.01；與LPS相比，#P<0.05，##P<0.01。圖2 SNHG1對LPS誘導(dǎo)下軟骨細胞的影響Fig.2 Effect of SNHG1 on LPS-induced chondrocytes

2.3 敲低miR-195-5p可降低軟骨細胞中LPS誘導(dǎo)下細胞的高凋亡率并改善炎癥微環(huán)境

細胞功能試驗結(jié)果顯示，LPS干預(yù)下，軟骨細胞表現(xiàn)出了較高凋亡率與高水平炎性因子(包括轉(zhuǎn)錄與蛋白水平)，較低的細胞增殖水平。通過轉(zhuǎn)染miR-195-5p抑制劑至軟骨細胞，實現(xiàn)miR-195-5p表達敲低后，以上結(jié)果均向?qū)φ战M靠近，但離對照組還具有一定程度。以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖3。

2.4 miR-195-5p是SNHG1的直接靶目標(biāo)

我們經(jīng)過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，miR-195-5p與SNHG1存在潛在靶向位點。雙熒光素酶報告分析中，miR-195-5p模擬物僅顯著調(diào)低SNHG1-Wt(而非SNHG1-Mut)。RNA免疫沉淀分析中，含有Ago2的miR-195-5p復(fù)合物中高度募集SNHG1。下拉實驗中，SNHG1僅被生物素標(biāo)記的miR-195-5p-WT拉下。此外，我們還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染SNHG1過表達序列的軟骨細胞中存在較低水平miR-195-5p。以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4。

注：A：miR-195-5p-SNHG1潛在結(jié)合位點；B：雙熒光素酶報告；C：RNA免疫沉淀實驗；D：RNA下拉實驗；E：miR-195-5p-SNHG1關(guān)系。與miR-NC/pcDNA3.0相比，**P<0.01，***P<0.001；與LPS相比，###P<0.001。圖4 SNHG1、miR-195-5p的表達Fig.4 Expression levels of SNHG1 and miR-195-5p

2.5 SNHG1-miR-195-5p調(diào)控軸可在體內(nèi)改善OA大鼠的凋亡相關(guān)因子水平與炎癥微環(huán)境

對OA大鼠模型注射SNHG1促進劑與miR-195-5p抑制劑進行治療，結(jié)果發(fā)現(xiàn)凋亡因子Caspase-3、Bax/Bcl-2的轉(zhuǎn)錄與蛋白水平均顯著低于模型組，但是仍顯著高于對照組。此外，炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α也具有相似結(jié)果。以上結(jié)果差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖5。

3 討論

OA是較常見的骨關(guān)節(jié)慢性疾病，影響世界人口15 %以上，最新研究表明，中國現(xiàn)在的膝骨性關(guān)節(jié)炎患者達1.1億，這給社會帶來了很大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)[19]。目前的研究表明OA與細胞因子、信號通路、基質(zhì)金屬蛋白酶及免疫因素等有關(guān)，但具體的發(fā)病機制仍不清楚[20]。有研究[21]表明，LncRNA-miRNA集成網(wǎng)絡(luò)可調(diào)控OA進展，對其進行動態(tài)監(jiān)測以及人為干預(yù)可能有利于OA病情的逆轉(zhuǎn)。在Lei等[22]的研究中，強化SNHG1表達可通過靶向抑制miR-16-5p并介導(dǎo)p38 MAPK-NF-κB信號通路減輕OA的代謝功能障礙與炎性狀態(tài)，提示SNHG1在OA的進程中可起緩解作用。又有Shu等[17]的報導(dǎo)中，miR-195-5p在OA中高表達，敲低其表達可通過靶向REGγ降低軟骨細胞的凋亡水平與炎性程度，提示開發(fā)miR-195-5p抑制劑有助于遏制OA進程。在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)SNHG1可以改善LPS誘導(dǎo)的軟骨細胞代謝異常并降低促炎細胞因子的表達，抑制了OA的發(fā)展。發(fā)現(xiàn)SNHG1在OA患者軟骨組織中下調(diào)，而miR-195-5p上調(diào)，SNHG1和miR-195-5p的表達呈負(fù)相關(guān)，兩者可能介導(dǎo)了OA的病理過程，這可能成為治療新靶點。

注：A～B：SNHG1-miR-195-5p調(diào)控軸對OA大鼠凋亡相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的影響，及其蛋白圖；C～D：SNHG1-miR-195-5p調(diào)控軸對OA大鼠炎性因子轉(zhuǎn)錄與蛋白水平的影響，及其蛋白圖。與Control相比，*P<0.05，**P<0.01；與Model相比，##P<0.01。圖5 SNHG1-miR-195-5p調(diào)控軸對OA大鼠的影響Fig.5 Effect of SNHG1-miR-195-5p regulatory axis on OA rats

OA治療藥物的抗炎性往往體現(xiàn)于對炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌抑制[23]。我們在軟骨細胞中上調(diào)了SNHG1的表達，發(fā)現(xiàn)高水平SNHG1可顯著降低細胞凋亡率，抑制炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α等的分泌，從而改善軟骨細胞炎性微環(huán)境，還可恢復(fù)細胞的增殖水平。同樣我們通過轉(zhuǎn)染miR-195-5p抑制序列到軟骨細胞，實現(xiàn)miR-195-5p表達的敲低，可降低軟骨細胞中LPS誘導(dǎo)下細胞的高凋亡率并改善炎癥微環(huán)境?？梢婇_發(fā)SNHG1促進劑或miR-195-5p抑制劑有助于通過維護軟骨細胞分子微環(huán)境，包括調(diào)節(jié)凋亡、增殖能力與炎性狀態(tài)等，實現(xiàn)OA病情的改善。我們還發(fā)現(xiàn)SNHG1與miR-195-5p存在結(jié)合位點，miR-195-5p模擬物可顯著調(diào)低SNHG1-Wt，含有Ago2的miR-195-5p復(fù)合物可募集SNHG1，僅生物素標(biāo)記的miR-195-5p-Wt被SNHG1下拉。此外，過表達SNHG1還可敲低miR-195-5p水平。綜合以上結(jié)果，SNHG1作為內(nèi)源性RNA，可充當(dāng)miR-195-5p的分子海綿，實現(xiàn)對其表達的負(fù)向調(diào)控，兩者之間存在確切靶向關(guān)系。SNHG1可靶控miR-195-5p介導(dǎo)OA軟骨細胞的發(fā)展，并且主要從軟骨細胞凋亡、增殖以及炎性微環(huán)境中發(fā)揮調(diào)控作用。

我們還進行了體內(nèi)研究，驗證了SNHG1促進劑與miR-195-5p抑制劑在OA小鼠中的作用。結(jié)果表明，模型組大鼠軟骨組織出現(xiàn)了較高水平的Caspase-3、Bax/Bcl-2(轉(zhuǎn)錄與蛋白水平)以及較高水平的炎性因子IL-1β、IL-6、TNF-α，提示模型組大鼠已表現(xiàn)出了明顯的軟骨凋亡與炎性微環(huán)境等OA進展情況。而當(dāng)我們對模型組大鼠進行SNHG1促進劑或miR-195-5p抑制劑干預(yù)后，以上結(jié)果均出現(xiàn)了明顯改善，提示SNHG1促進劑或miR-195-5p抑制劑可在轉(zhuǎn)錄與蛋白水平上顯著抑制模型組大鼠體內(nèi)的凋亡因子與炎性因子，有助于阻止軟骨凋亡并修復(fù)炎性微環(huán)境。在Hu等[24]的研究中，證實了細胞凋亡因子在OA大鼠體內(nèi)的影響，下調(diào)促凋亡因子Caspase-3、Bax以及上調(diào)抗凋亡因子Bcl-2對于抑制軟骨細胞凋亡從而發(fā)揮保護作用具有重要效力，這也與本研究的結(jié)果相吻合。

綜上所述，存在SNHG1-miR-195-5p調(diào)控網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)軟骨細胞的凋亡與炎性微環(huán)境，開發(fā)SNHG1促進劑或miR-195-5p抑制劑可能有利于OA的治療。