杜漢廷，葛 麒，林松毅，陳 冬

（大連工業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，國(guó)家海洋食品工程技術(shù)研究中心，大連 116034）

0 引 言

松茸（Singer），學(xué)名松口蘑，屬擔(dān)子菌門(mén)擔(dān)子菌綱傘菌目口蘑科口蘑屬，主要分布于亞歐和北美地區(qū)，在中國(guó)的吉林省、云南省以及川藏地區(qū)等都有分布。松茸是一種珍貴的野生藥食用菌，因其味道鮮美、基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)成分全面且其子實(shí)體中含有松茸雙鏈多糖、松茸醇及松茸多肽等珍貴生物活性成分而備受推崇。松茸子實(shí)體中蛋白質(zhì)含量近20%，這些蛋白質(zhì)為人體提供營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的同時(shí)，也具備抗炎、抗癌、抗氧化、增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性。近些年，松茸已成為全球化的天然滋補(bǔ)類(lèi)真菌之一，其所含的蛋白質(zhì)資源作為一種功能性食品組分值得進(jìn)一步研究。

免疫調(diào)節(jié)是機(jī)體免疫系統(tǒng)應(yīng)對(duì)內(nèi)外部有害因素所進(jìn)行的一個(gè)復(fù)雜的生物過(guò)程，在各種人類(lèi)疾病中發(fā)揮重要作用。巨噬細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫系統(tǒng)中免疫細(xì)胞的重要成員之一，其被激活后通過(guò)分泌NO、HO、TNF-、IL-6等免疫活性分子直接殺傷病原微生物，進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)。目前，關(guān)于食用菌免疫活性因子已開(kāi)展了一些研究。有研究表明，云芝中的糖肽具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性，能夠促進(jìn)大鼠IFN-、IL-1、IL-2的產(chǎn)生，增強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)能力；Ditamo等研究發(fā)現(xiàn)雙孢菇中凝集素具有減少先天性和適應(yīng)性反應(yīng)的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)作用。此外，Yu等研究發(fā)現(xiàn)靈芝多糖顯著刺激小鼠腹腔巨噬細(xì)胞吞噬活性，提高NO、TNF-和IL-1的產(chǎn)生，激活MAPKs、PI3K/Akt和NF-κB信號(hào)通路，恢復(fù)Cy誘導(dǎo)小鼠的免疫抑制。Zhao等研究表明金針菇粗多糖可調(diào)節(jié)ICR小鼠腸道微生物群，提高血清免疫球蛋白和細(xì)胞因子的水平，具有潛在的抑制肥胖和免疫調(diào)節(jié)能力。Wu等通過(guò)體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)試驗(yàn)表明，猴頭菇多糖能夠顯著提高免疫器官指數(shù)、脾細(xì)胞增殖能力、NK細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞吞噬作用，對(duì)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的小鼠免疫抑制具有保護(hù)作用。然而，關(guān)于松茸源免疫活性因子的研究鮮有報(bào)道，尤其是蛋白免疫活性因子研究相對(duì)缺乏。

水浸提法是一種傳統(tǒng)的提取方法，在食用菌活性物質(zhì)提取中應(yīng)用廣泛，此法相較于醇提法、微波或超聲輔助提取等提取方法，具有適用范圍廣，安全系數(shù)高，操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，更加適用于工業(yè)化生產(chǎn)需求。一方面，低溫提取更有利于完整保持提取物中的活性成分；另一方面，國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究多集中于中高溫（>40 ℃）水浸提得到的松茸提取物。因此，關(guān)于松茸低溫水浸提物及其免疫活性的研究值得進(jìn)一步的探究。

本研究采用響應(yīng)面法（Response Surface Methodology，RSM），分別以松茸蛋白得率和小鼠巨噬細(xì)胞NO釋放量為考察對(duì)象，優(yōu)化低溫（≤30 ℃）水平下松茸水提免疫活性因子（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor，TMWEIF）的提取工藝。通過(guò)氨基酸分析和光譜學(xué)分析，初步解析TMWEIF的結(jié)構(gòu)及物質(zhì)組成，探討TMWEIF的結(jié)構(gòu)與功能活性的潛在聯(lián)系。本研究旨在優(yōu)化出綜合性能較好的松茸低溫水提工藝參數(shù)，并對(duì)提取物進(jìn)行結(jié)構(gòu)組成的初步解析，為松茸源免疫活性因子的分離純化、免疫調(diào)節(jié)的潛在機(jī)制提供研究基礎(chǔ)，為松茸的蛋白質(zhì)資源開(kāi)發(fā)利用及其保健食品的開(kāi)發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

長(zhǎng)白山野生松茸凍干片，吉林省延吉市順鑫松茸貿(mào)易有限公司；小鼠巨噬細(xì)胞系RAW 264.7細(xì)胞，中科院生物化學(xué)與細(xì)胞生物學(xué)研究所。

牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)品（Bovine Serum Albumin，BSA）、噻唑藍(lán)（Methyl Thiazolyl Tetrazolium，MTT），北京索萊寶科技有限公司；DMEM培養(yǎng)基，美國(guó)Hyclone公司；脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS），美國(guó)Sigma公司；NO檢測(cè)試劑盒，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；所用試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

Infinite M 200多功能酶標(biāo)儀，瑞士Tecan公司；L-8800型氨基酸分析儀，日本日立有限公司；IR Prestige-21傅里葉變換紅外光譜儀，日本島津公司；J-1500圓二色光譜儀，日本Jasco公司。

1.3 方法

取適量?jī)龈伤扇灼酶咚俜鬯闄C(jī)打碎成粉，過(guò)孔徑0.25 mm篩網(wǎng)，密封置于干燥處備用。

準(zhǔn)確稱(chēng)量10 g松茸干粉，按設(shè)定提取條件開(kāi)展試驗(yàn)。提取結(jié)束后，將混合物在4 ℃、6 760×的條件下離心，上清液凍干保存至-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

采用雙縮脲法測(cè)定樣品中蛋白含量，并做適當(dāng)改進(jìn)。以BSA（10 mg/mL）為標(biāo)準(zhǔn)品，按照1∶4比例添加雙縮脲試劑，混勻反應(yīng)15 min后，于540 nm處測(cè)定吸光度，以BSA質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（mg/L），吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。TMWEIF蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：=0.044 8-0.003 8，=0.999 4。蛋白得率的計(jì)算公式

式中為由BSA標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的蛋白濃度，mg/mL；為水提液總體積，mL；為松茸干粉質(zhì)量，g。

選定液料比（10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1 mL/g）、提取時(shí)間（30、60、90、120、150 min）、提取溫度（10、15、20、25和30 ℃）3個(gè)因素進(jìn)行單因素試驗(yàn)，考察各單因素水平對(duì)松茸水提液中蛋白得率的影響，以確定相關(guān)工藝條件。

結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果，分別以TMWEIF蛋白得率（）和巨噬細(xì)胞NO釋放量（）為響應(yīng)值設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，響應(yīng)面試驗(yàn)各因素的水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平 Table 1 Factors and levels of response surface analysis

選取正常傳代的RAW 264.7細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為2×10，接種到96孔板內(nèi)，37 ℃、5% CO細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后棄掉培養(yǎng)液。每孔加入200L不同濃度的（0.015、0.030、0.060、0.125、0.250、0.500、1.000和2.000 mg/mL）TMWEIF溶液，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照組（細(xì)胞培養(yǎng)液）和模型對(duì)照組（10g/mL的LPS溶液）。孵育24 h后，每孔加入20L 1 mg/mL MTT溶液，4 h后棄上清，每孔加入150L 二甲基亞砜，振蕩15 min，測(cè)定570 nm處吸光度值（OD）。每組設(shè)定6個(gè)重復(fù)。

RAW 264.7細(xì)胞的處理方法及分組同1.3.6節(jié)，各試驗(yàn)組樣品處理24 h，收集各孔上清液按照NO檢測(cè)試劑盒要求測(cè)定NO含量。

參照王麗波等的方法，采用KBr壓片法進(jìn)行FT-IR光譜分析，波數(shù)掃描范圍4 000～400 cm，分辨率4 cm。

取0.025 mg/mL待測(cè)樣品水溶液，置于石英比色皿中，以去離子水為參比進(jìn)行紫外全光譜掃描（200～700 nm）。

采用雙縮脲法測(cè)定樣品中蛋白含量，苯酚-硫酸法測(cè)定樣品中多糖含量，TMWEIF蛋白含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：=0.775 9+0.017 8，=0.997 2，TMWEIF多糖含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程：=5.619 5+0.065 2，=0.992 2。計(jì)算公式如下

式中為由BSA（葡萄糖）標(biāo)準(zhǔn)曲線求得的蛋白（多糖）濃度，mg/mL；為T(mén)MWEIF水溶液總體積，mL；為T(mén)MWEIF質(zhì)量，g。

參照陳振家等的方法，將1 mg/mL待測(cè)樣品水溶液于190～240 nm范圍進(jìn)行圓二色光譜掃描，以去離子水為參比。

參照GB 5009.124—2016《食品中氨基酸的測(cè)定》。取適量樣品與6 mol/L HCl置于安瓿瓶中，酒精噴燈灼燒封口，于110 ℃烘箱中水解22 h，取出冷卻至室溫，旋蒸，0.02 mol/L HCl定容至25 mL，0.22m濾膜過(guò)濾，移至進(jìn)樣瓶中待測(cè)，重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用 Origin 2019b、SPSS 25.0和Design-Expert 8.0.6 軟件進(jìn)行處理和分析，結(jié)果用均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，顯著性水平為<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖1 a可知，當(dāng)液料比由10∶1增至40∶1 mL/g時(shí)，TMWEIF中蛋白得率升高，得率在液料比40∶1 mL/g時(shí)較高，為7.62%。這是因?yàn)檩^小的液料比使溶液體系較黏稠，無(wú)法析出更多的有效成分，但隨著液料比的增加，松茸粉充分溶解，使蛋白得率逐步上升。當(dāng)液料比過(guò)大時(shí)，蛋白質(zhì)分子與水之間的擴(kuò)散作用會(huì)影響TMWEIF中蛋白的溶出，導(dǎo)致得率有所下降，因而液料比由40∶1增至50∶1 mL/g時(shí)，TMWEIF中蛋白得率降低。

如圖1 b所示，TMWEIF中蛋白得率隨提取時(shí)間的延長(zhǎng)呈上升趨勢(shì)，當(dāng)提取150 min時(shí)，蛋白得率達(dá)到最大（<0.05）。這是因?yàn)殡S著提取時(shí)間的延長(zhǎng)，松茸顆粒膜逐漸破裂，增加有效成分溶出，蛋白得率上升。

圖1 c所示，在10～30 ℃提取溫度之間，蛋白得率緩慢上升，30 ℃時(shí)，蛋白得率升至最高。這可能是因?yàn)樵谳^低的溫度下，溶液黏度較高，擴(kuò)散系數(shù)較低，溫度升高加速分子運(yùn)動(dòng)，蛋白析出加快。

圖1 液料比、提取時(shí)間和提取溫度對(duì)蛋白得率的影響 Fig.1 Effects of liquid-solid ratio, extraction time and extraction temperature on yield of protein

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化TMWEIF蛋白的提取工藝試驗(yàn)結(jié)果

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別以松茸蛋白得率（）和巨噬細(xì)胞NO釋放量（）為響應(yīng)值，進(jìn)行三因素三水平的響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，對(duì)15個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)的響應(yīng)值進(jìn)行回歸性分析。試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 Table 2 Experimental design and results of response surface analysis

運(yùn)用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行多元回歸擬合，得到的回歸方程如下

式中、和分別為液料比、提取時(shí)間和提取溫度的編碼值。

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果的方差分析顯示，兩個(gè)響應(yīng)值的模型決定系數(shù)分別為0.884 8、0.799 3，校正后分別為0.731 1、0.598 5，表明模型的相關(guān)性良好。和的回歸模型均是顯著的（<0.05）；失擬項(xiàng)均不顯著（>0.05），表明模型方程和試驗(yàn)擬合度良好，能較好解釋響應(yīng)中的變異。此外，兩個(gè)模型的變異系數(shù)均小于5%，說(shuō)明模型對(duì)響應(yīng)值的置信度良好，該模型可以很好地反映試驗(yàn)的真實(shí)性。綜上所述，此回歸模型對(duì)兩個(gè)響應(yīng)值的擬合程度較好，試驗(yàn)誤差較小。

利用響應(yīng)面模型可擬合出2個(gè)響應(yīng)值對(duì)試驗(yàn)因素交互作用的三維空間曲面圖，以直觀表示響應(yīng)值的變化趨勢(shì)及各個(gè)因素對(duì)于響應(yīng)指標(biāo)的影響變化，二維等高線圖則進(jìn)一步展現(xiàn)每個(gè)因素間的交互作用并確定最優(yōu)點(diǎn)。

圖2是三因素交互作用對(duì)的影響的三維圖形。如圖2所示，圖a、b等高線偏向于圓形，曲面平緩，液料比與提取時(shí)間和提取溫度的交互作用均不顯著（>0.05）；圖c等高線近似橢圓，曲面圖c陡峭，提取時(shí)間和溫度的交互作用顯著（<0.05）。根據(jù)值的大小，判定3個(gè)因素對(duì)的影響力是：>>。

圖2 各因素交互作用對(duì)蛋白得率（Y′）影響的響應(yīng)面圖 Fig.2 Response surface map of the interaction of various factors on yield of protein (Y′)

圖3是3個(gè)試驗(yàn)因素交互作用對(duì)RAW 264.7細(xì)胞NO釋放量（）影響的三維圖形。如圖3所示，等高線圖形均趨向于圓形且曲面坡度較平，兩兩因素間交互作用均不顯著（>0.05）。根據(jù)值的大小，判定3個(gè)因素對(duì)的影響力是：>>。

圖3 各因素交互作用對(duì)巨噬細(xì)胞NO釋放量（Y"）影響的響應(yīng)面圖 Fig.3 Response surface map of the interaction of various factors on NO release amount from macrophage (Y")

響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，優(yōu)化工藝參數(shù)為液料比45.11∶1 mL/g、提取時(shí)間142.07 min、提取溫度20 ℃；優(yōu)化工藝參數(shù)為液料比30∶1 mL/g、提取時(shí)間126.57 min、提取溫度20 ℃。結(jié)合實(shí)際操作可行性，對(duì)和的優(yōu)化工藝參數(shù)予以改良并進(jìn)行3次重復(fù)驗(yàn)證試驗(yàn)。優(yōu)化參數(shù)為液料比45∶1 mL/g、提取時(shí)間140 min、提取溫度20 ℃，所得提取物記為T(mén)MWEIF-1；優(yōu)化參數(shù)為液料比30∶1 mL/g、提取時(shí)間120 min、提取溫度20 ℃，所得提取物記為T(mén)MWEIF-2。結(jié)果顯示，、蛋白得率分別是8.07%±0.11%、7.06%±0.09%；提取的活性因子TMWEIF-1、TMWEIF-2的NO釋放量分別是（3.68±0.03）g/mL、（4.11±0.17）g/mL，二者具有顯著性差異（<0.05）。所得實(shí)際值與預(yù)測(cè)值接近，表明各工藝參數(shù)準(zhǔn)確可靠。

2.3 傅里葉紅外光譜分析

TMWEIF的FT-IR譜圖如圖4 a所示，對(duì)于TMWEIF-1，其在3 398 cm處存在-O-H伸縮振動(dòng)吸收峰，來(lái)源于TMWEIF中的蛋白質(zhì)；2 933 cm處的吸收峰屬于酯類(lèi)的亞甲基-C-H的反對(duì)稱(chēng)伸縮振動(dòng)吸收峰，這來(lái)源于其中的糖鏈或蛋白質(zhì)。同時(shí)，對(duì)于TMWEIF-2，其分別在3 402 cm和2 929 cm處存在-O-H和酯類(lèi)的亞甲基-C-H的吸收峰，與TMWEIF-1相近，表明它們組分相似。

TMWEIF-1和TMWEIF-2在1 628 cm和1 591 cm處的吸收峰是蛋白質(zhì)的酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰，來(lái)源于C=O的伸縮振動(dòng)。酰胺Ⅰ帶的特征吸收峰的存在說(shuō)明了TMWEIF中含有一定量的蛋白質(zhì)。

TMWEIF在1 200～700 cm范圍內(nèi)主要出現(xiàn)1 080 cm、1 037 cm、1 029 cm、932 cm和888 cm5個(gè)吸收峰，推測(cè)是多糖類(lèi)物質(zhì)吸收峰。TMWEIF-1在1 080 cm(-C-O-)和1 029 cm(-C-C-)處的特征吸收峰表明了葡聚糖的存在，932 cm和888 cm附近的吸收峰表明其中既含有-型糖苷鍵，也含有-型糖苷鍵；而TMWEIF-2中1 080 cm、1 037cm和888cm的吸收峰表明其中存在葡聚糖且主要是-型糖苷鍵。

綜上所述，F(xiàn)T-IR光譜吸收峰特征顯示，TMWEIF-1和TMWEIF-2中蛋白質(zhì)和多糖物質(zhì)的吸收峰較強(qiáng)，表明TMWEIF-1和TMWEIF-2中主要含有的成分是蛋白質(zhì)和多糖類(lèi)物質(zhì)。這與TMWEIF基本組成含量測(cè)定結(jié)果相一致。

2.4 紫外光譜分析

如圖4 c所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2在200 nm附近有一強(qiáng)吸收峰，260~280 nm之間有一個(gè)弱的吸收峰，表明TMWEIF中含有一定量的多糖和蛋白類(lèi)物質(zhì)，這與FI-IR光譜分析結(jié)果一致。此外TMWEIF-1的紫外光譜掃描曲線位于TMWEIF-2的曲線之上，表明以蛋白得率為響應(yīng)值優(yōu)化的提取工藝所得TMWEIF-1的蛋白和多糖含量高。這與TMWEIF基本組成含量測(cè)定結(jié)果相一致。

2.5 TMWEIF基本組成分析

TMWEIF中的多糖含量和蛋白含量測(cè)定結(jié)果顯示，TMWEIF-1、TMWEIF-2的多糖含量分別為（306.95±1.16）mg/g、（304.98±1.35）mg/g，二者之間無(wú)顯著性差異（>0.05）；蛋白含量分別為（132.14±4.43）mg/g、（107.78±4.45）mg/g，二者之間具有顯著性差異（<0.05）。

2.6 圓二色譜分析

利用圓二色譜可以解析蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)組成，如圖 4 d所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2在190 nm 處呈現(xiàn)負(fù)吸收峰，在205 nm附近存在正吸收峰，表明TMWEIF中的蛋白含有大量的-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)；TMWEIF-2較TMWEIF-1相比，TMWEIF-2中-轉(zhuǎn)角結(jié)構(gòu)含量更高（72.00%±2.92%，<0.05）。此外，TMWEIF-1和TMWEIF-2均在210 nm附近有一負(fù)峰，表明TMWEIF含有-螺旋結(jié)構(gòu)，且TMWEIF-1含有更高比例的-螺旋（39.88%± 3.56%，<0.05）。而研究表明，-螺旋和-折疊代表蛋白質(zhì)分子的有序性，-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)均反映蛋白質(zhì)分子松散程度。這說(shuō)明了TMWEIF-1中的蛋白質(zhì)有序性更好，TMWEIF-2中蛋白相對(duì)較松散。而TMWEIF-2誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞釋放NO的能力更高，可能與其相對(duì)松散的結(jié)構(gòu)從而能暴露出更多的作用位點(diǎn)有關(guān)。

圖4 TMWEIF的傅里葉紅外光譜、氨基酸組成、紫外光譜和圓二色譜分析 Fig.4 Fourier transform infrared spectroscopy, amino acid composition, ultraviolet spectrum and circular dichroism analysis of TMWEIF

2.7 氨基酸組成分析

兩組TMWEIF的氨基酸含量如表3所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2的氨基酸均為17種，氨基酸含量無(wú)顯著性差異。從總氨基酸含量（TAA）來(lái)看，氨基酸組分總含量平均值為9.7%，兩種TMWEIF中必需氨基酸（EAA）含量較豐富（>0.05），EAA平均含量占TAA的27%，EAA/NAA分別為38.43%、37.77%，說(shuō)明TMWEIF具備良好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。兩組TMWEIF中氨基酸含量高低排序一致，含量較高的依次是谷氨酸和天冬氨酸，分別占氨基酸總量的34.65%、35.65%，2種氨基酸屬于鮮味氨基酸，符合松茸鮮味濃郁的特征。另有研究表明，谷氨酸在生長(zhǎng)的關(guān)鍵時(shí)期包括快速生長(zhǎng)的新生兒時(shí)期扮演著重要角色，可增強(qiáng)機(jī)體免疫細(xì)胞的免疫功能。本研究對(duì)NO的測(cè)定結(jié)果表明TMWEIF能夠促進(jìn)巨噬細(xì)胞釋放NO，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用，而TMWEIF中豐富的谷氨酸則可能是其具備良好免疫活性重要原因之一。此外，谷氨酸還具有對(duì)大多數(shù)區(qū)域的神經(jīng)元興奮作用，參與海馬區(qū)的學(xué)習(xí)記憶過(guò)程，所以TMWEIF具有開(kāi)發(fā)提高免疫力和記憶力食品的應(yīng)用潛力。

表3 TMWEIF的氨基酸含量分析 Table 3 Analysis of amino acids contents of TMWEIF mg·g-1

如圖4 b所示，TMWEIF-1和TMWEIF-2的必需氨基酸、疏水氨基酸、堿性氨基酸、酸性氨基酸的百分含量相近。曾有研究發(fā)現(xiàn)，食源性蛋白的免疫效果與其氨基酸組成及含量有關(guān)，特別是疏水氨基酸和堿性氨基酸。TMWEIF中疏水氨基酸和堿性氨基酸平均占氨基酸總量的48%。因此，TMWEIF可能具備良好的免疫效果，這與RAW264.7細(xì)胞NO釋放量測(cè)定結(jié)果相符。

綜上所述，TMWEIF中所含氨基酸種類(lèi)齊全，必需氨基酸含量較豐富，但TMWEIF-2中與免疫效果密切相關(guān)的谷氨酸、疏水氨基酸和堿性氨基酸相對(duì)含量占比略高，基于營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和潛在生物活性?xún)煞矫婵紤]，TMWEIF提取工藝2更具有免疫活性因子制備的應(yīng)用價(jià)值。

3 結(jié) 論

1）基于響應(yīng)面法，以蛋白得率為指標(biāo)確定了松茸水提免疫活性因子1（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor-1，TMWEIF-1）優(yōu)化的工藝參數(shù)：液料比45∶1 mL/g、提取時(shí)間140 min、提取溫度20 ℃；以巨噬細(xì)胞NO釋放量為指標(biāo)確定了松茸水提免疫活性因子2（Tricholoma Matsutake Water Extract Immunoactive Factor-1，TMWEIF-2）的優(yōu)化的工藝參數(shù)：液料比30∶1 mL/g、提取時(shí)間120 min、提取溫度20 ℃。

2）TMWEIF-1和TMWEIF-2主要成分均為蛋白質(zhì)和多糖，所含蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)為-螺旋和-轉(zhuǎn)角，所含多糖以-型糖苷鍵的葡聚糖為主；TMWEIF-2中蛋白質(zhì)-轉(zhuǎn)角比例顯著高于TMWEIF-1（<0.05），蛋白相對(duì)較松散。TMWEIF-2中與免疫活性高度相關(guān)的谷氨酸、疏水氨基酸和堿性氨基酸的總量高于TMWEIF-1，NO釋放量顯著高于TMWEIF-1。并且，TMWEIF-2制備工藝的液料比小，提取時(shí)間短。因此，TMWEIF-2的制備工藝參數(shù)更具應(yīng)用前景。

本研究為松茸源免疫活性因子開(kāi)發(fā)利用提供了理論依據(jù)。今后將對(duì)松茸多肽和松茸多糖進(jìn)行進(jìn)一步的免疫活性研究。