龔佳,黃其田,史榮超,張夢(mèng)瑤,劉灑灑,楊曉兵*

1(西北農(nóng)林科技大學(xué) 葡萄酒學(xué)院,陜西 楊凌,712100)2(中國(guó)科學(xué)院大連化學(xué)物理研究所生物技術(shù)部,遼寧 大連,116023)

脂肪酸是一類重要的化合物,被廣泛應(yīng)用于食品和化學(xué)工業(yè)中[1]。在食品行業(yè)中,飽和脂肪酸可作為某些發(fā)酵飲料中的主要芳香物質(zhì)、表面活性劑、食品添加劑和增塑劑[2-4];奇數(shù)碳脂肪酸及其衍生物可作為合成香精和香料等前體物質(zhì)[5],還可用作飲食評(píng)估中食物攝入的標(biāo)準(zhǔn)生物標(biāo)志物以及冠心病風(fēng)險(xiǎn)和二型糖尿病風(fēng)險(xiǎn)的指示物[1,6]。

當(dāng)前,利用動(dòng)、植物油脂生產(chǎn)脂肪酸面臨原料短缺、生產(chǎn)周期長(zhǎng)、價(jià)格波動(dòng)大等諸多風(fēng)險(xiǎn)和挑戰(zhàn),而微生物油脂因其不與民爭(zhēng)糧爭(zhēng)地,不受氣候、環(huán)境和場(chǎng)地等限制,培養(yǎng)周期短,易規(guī)?；糯蟮葍?yōu)勢(shì)受到廣泛關(guān)注[7]。產(chǎn)油酵母是一類能積累超過自身干重30%油脂的微生物[8-9],在特定的培養(yǎng)條件下能夠超過自身干重的60%[10-12]。此外,產(chǎn)油酵母具有生長(zhǎng)速度快、底物利用譜廣、耐受多種木制纖維素水解副產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn),被認(rèn)為是生產(chǎn)油脂的理想細(xì)胞工廠[13]。

脂肪酸組成的差異賦予油脂不同的功能與用途,富含油酸、硬脂酸和棕櫚酸等長(zhǎng)鏈脂肪酸的脂質(zhì)可用于可可脂的替代品,而富含單不飽和脂肪酸的脂質(zhì)適合生產(chǎn)生物柴油[14-15]。調(diào)控培養(yǎng)基的成分或改變發(fā)酵條件(如碳源、溫度和pH等)能夠改變微生物油脂脂肪酸組成,獲得富含特定脂肪酸的油脂[16-17]。本文分析了圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)等4株產(chǎn)油酵母油脂的脂肪酸組成;研究了碳源、溫度和pH對(duì)圓紅冬孢酵母油脂脂肪酸組成的影響,以期為定向改造產(chǎn)油酵母合成特定脂肪酸提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 菌種

圓紅冬孢酵母(Rhodosporidiumtoruloides)CGMCC 2.1389、皮狀絲孢酵母(Trichosporoncutaneum)CGMCC 2.571、斯達(dá)式油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)CGMCC 2.1560,中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC);彎曲隱球菌(Cryptococcuscurvatus)ATCC 20509,美國(guó)菌種保藏中心(ATCC)。

1.1.2 培養(yǎng)基與溶液

YPD種子液培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨20,酵母提取物10,葡萄糖20。固體培養(yǎng)基為YPD液體培養(yǎng)基加15 g/L瓊脂粉。

限氮培養(yǎng)基(g/L)：葡萄糖70,(NH4)2SO40.1,酵母提取物0.75,KH2PO41.0,MgSO4·7H2O 1.5,痕量元素儲(chǔ)液1%(體積分?jǐn)?shù)),pH 6.0。

痕量元素儲(chǔ)液(g/L)：CaCl2·2H2O 4.0,FeSO4·7H2O 0.55,一水合檸檬酸0.52,ZnSO4·7H2O 0.1,MnSO4·H2O 0.076;另外補(bǔ)加濃硫酸100 μL/L。以上培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌15 min。

1.1.3 主要設(shè)備

ZQZY-CF8振蕩培養(yǎng)箱,上海知楚儀器有限公司;7890B-7000D三重四級(jí)桿氣質(zhì)聯(lián)用儀,安捷倫科技有限公司;V-530紫外可見分光光度計(jì),日本分光公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法和分析方法

1.2.1 產(chǎn)油酵母的培養(yǎng)和產(chǎn)油發(fā)酵

將產(chǎn)油酵母在YPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng),30 ℃,48 h。挑取單菌落,接種到含有50 mL YPD液體培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,30 ℃,200 r/min發(fā)酵48 h獲得種子液。以10%的體積比例將種子液接種到含45 mL限氮培養(yǎng)基的250 mL搖瓶中,30 ℃,200 r/min條件下發(fā)酵至培養(yǎng)基中碳源低于2 g/L。

1.2.2 碳源、溫度和pH對(duì)圓紅冬孢酵母脂肪酸組成的影響

菌株活化、培養(yǎng)等方法同1.2.1。除考察溫度的試驗(yàn)組外,發(fā)酵轉(zhuǎn)速和溫度均為200 r/min和30 ℃。培養(yǎng)條件試驗(yàn)組分別為：(1)碳源為葡萄糖、木糖、蔗糖和甘油,C/N摩爾比(C/N=260)配置氮限制培養(yǎng)基;(2)初始pH分別為4、5、6、7和8,用4 mol/L NaOH溶液調(diào)控培養(yǎng)基初始pH;(3)溫度：20、25、30、33和37 ℃。

1.2.3 生物量測(cè)定方法

取30 mL發(fā)酵液,8 000×g離心5 min;所得菌體用去離子水洗滌2次,于105 ℃烘至恒重,以g/L表示菌體生物量。

1.2.4 碳源的測(cè)定方法

利用DionexICS2500離子色譜儀(Dionex公司,CarboPac100保護(hù)柱(4 mm×50 mm)、CarboPac100分析柱(4 mm×250 mm)。洗脫條件：30 ℃,流速0.5 mL/min。NaOH濃度從0到15 min為22 mmol/L,隨后1 min內(nèi)增加到200 mmol/L,保持15 min[18]。甘油、木糖、葡萄糖和蔗糖的保留時(shí)間分別為1.7、12.2、13.5和16.7 min。

1.2.5 油脂含量測(cè)定方法

采用酸熱法提取產(chǎn)油酵母油脂[10]。向裝有0.5 g干菌體的50 mL圓底離心管中加入3 mL的4 mol/L HCl溶液,78 ℃水浴處理1 h,冷卻后加入3 mL甲醇和3 mL氯仿,漩渦振蕩1 min;8 000×g離心5 min收集氯仿層;加入3 mL氯仿重復(fù)萃取,直至氯仿層澄清透明;合并氯仿抽提液,加入等體積1 g/L NaCl溶液,振蕩混勻;8 000×g離心5 min,取下層氯仿層,無水Na2SO4過濾;真空蒸發(fā)除去氯仿,105 ℃烘干至恒重。以g/L表示油脂產(chǎn)量,g/(g·DCW)表示油脂含量。

1.2.6 脂肪酸組成分析方法

油脂甲酯化[10]：取200 mg油脂,加入0.5 mL 50 g/L的KOH/CH3OH溶液,轉(zhuǎn)入10 mL圓底燒瓶,70 ℃回流50 min;加入0.7 mL三氟化硼乙醚甲醇溶液[V(三氟化硼乙醚溶液)∶V(甲醇)=4∶10],繼續(xù)回流10 min,冷卻后加入1 mL去離子水并混勻;加入0.7 mL正己烷萃取,去離子水洗滌2次,用0.22 μm濾膜過濾后用GC-MS進(jìn)行分析。

脂肪酸組成分析：Agilent 7890A-7000D型氣質(zhì)聯(lián)用儀(GC-MS),色譜柱采用HP-5MS(30 m×0.25 m×0.25 μm)。升溫程序：初始溫度80 ℃,保持1 min,7 ℃/min升溫至250 ℃,保持10 min;分流進(jìn)樣比10∶1;載氣氦氣;流速1.0 mL/min;測(cè)定方式：全掃描方式;進(jìn)樣量1 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,每個(gè)試驗(yàn)平行3次。采用Origin 2021進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)油酵母的脂肪酸組成分析

營(yíng)養(yǎng)限制是常用的促進(jìn)產(chǎn)油微生物合成和積累油脂的策略[18]。本研究采用氮元素限制培養(yǎng)基實(shí)現(xiàn)油脂合成積累,采用C/N質(zhì)量比為260,所得4株產(chǎn)油酵母油脂產(chǎn)量分別為7.5、9.41、8.75和10.6 g/L,含量分別為52.74%、43.8%、42.19%和53.56%(圖1)。

4株菌油脂中有18種共有脂肪酸,包括短鏈脂肪酸(short-chain fatty acids,SCFA,C<10)：己酸(C6∶0)、庚酸(C7∶0)、辛酸(C8∶0)和壬酸(C9∶0);中鏈脂肪酸(medium-chain fatty acid,MCFA,10≤C<16)：葵酸(C10∶0)、月桂酸(C12∶0)、肉豆蔻酸(C14∶0)和十五烷酸(C15∶0);長(zhǎng)鏈脂肪酸(long-chain fatty acid,LCFA,16≤C<20)：棕櫚油酸(C16∶1)、棕櫚酸(C16∶0)、十七碳烯酸(C17∶1)、十七烷酸(C17∶0)和油酸(C18∶1),硬脂酸(C18∶0);超長(zhǎng)鏈脂肪酸(very long-chain fatty acid,VLCFA,C ≥ 20)：二十烷酸(C20∶0)、二十二烷酸(C22∶0)、二十三烷酸(C23∶0)和二十四烷酸(C24∶0)(圖2-b～2-e)。除皮狀絲孢酵母外,另3株產(chǎn)油酵母油脂中還含有二十五烷酸(C25∶0)和二十六烷酸(C26∶0);亞油酸(C18∶2)僅在圓紅冬孢酵母油脂中出現(xiàn)(圖2-d)。

4株產(chǎn)油酵母油脂中LCFA占總脂肪酸的90%左右,其中C18∶1、C18∶0和C16∶0在圓紅冬孢酵母中含量分別為38.38%、17.71%和35.77%;在皮狀絲孢酵母中為11.73%、11.94%和66.71%;在斯達(dá)式油脂酵母中為19.12%、23.54%和43.97%;在彎曲隱球菌中為20.25%、28.51%和40.08%(圖2-a),與之前報(bào)道基本一致[19]。產(chǎn)油酵母油脂中SCFA含量為0.57%～2.44%,MCFA含量為0.28%～1.67%,VLCFA含量為5.30%～8.11%,這些脂肪酸總量?jī)H占總脂肪酸的10%左右(圖2-a)。

a-脂肪酸類別;b-SCFA;c-MCFA;d-LCFA;e-VLCFA圖2 四種產(chǎn)油酵母油脂的脂肪酸組成Fig.2 Fatty acid composition of lipids from the four oleaginous yeasts.

2.2 培養(yǎng)條件對(duì)圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成的影響

2.2.1 碳源對(duì)圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成的影響

碳源因代謝路徑的不同,其能量和還原度會(huì)有細(xì)微差別。在合成油脂過程中,碳源不僅影響產(chǎn)油酵母生長(zhǎng)、油脂積累和脂肪酸的組成,還會(huì)影響油脂的功能和用途[19-20]。圓紅冬孢酵母能夠利用葡萄糖高效合成胞內(nèi)油脂,油脂中的脂肪酸多達(dá)21種,在所試酵母中具有一定代表性。因此,以圓紅冬孢酵母為研究對(duì)象,探究碳源、溫度和pH對(duì)產(chǎn)油酵母的脂肪酸組成的影響。葡萄糖、木糖、蔗糖和甘油是常用的微生物油脂生產(chǎn)碳源,以該4種碳源為底物時(shí),圓紅冬孢酵母油脂產(chǎn)量為12.16～16.61 g/L,油脂含量為48.6%～54.52%(圖3);所得油脂中分別檢測(cè)到了21、20、20和20種脂肪酸,但在后3種碳源為底物所獲的油脂中未檢測(cè)到C12∶0(圖4-c)。

在4種所試碳源中,圓紅冬孢酵母油脂中的LCFA含量均占到總脂肪酸的90%以上(圖4-a)。以葡萄糖為碳源時(shí),油脂中C18∶1、C18∶0和C16∶0的含量分別為42.38%、17.71%和30.78%;以木糖為碳源時(shí),其含量為分別為47.45%、11.85%和32.24%;以蔗糖為碳源時(shí),其含量分別為46.54%、12.22%和33.39%;以甘油為碳源時(shí),其含量分別為35.68%、23.79%和29.29%(圖4-d)。在這4種碳源中,SCFA的總含量為0.57%～79%;MCFA的總含量為0.27%～2.21%;VLCFA的總含量為2.86%～5.66%(圖4-a)?？傮w而言,木糖和蔗糖有利于圓紅冬孢酵母積累C18∶和C16∶0;甘油有利于C17∶0和C18∶0的積累;葡萄糖和甘油則有利于VLCFA的合成與積累。

圖3 碳源對(duì)圓紅冬孢酵母的生物量、油脂濃度和油脂含量的影響Fig.3 Effect of carbon source on the biomass,lipid titer,and lipid content of R.toruloides

a-脂肪酸類別;b-SCFA;c-MCFA;d-LCFA;e-VLCFA圖4 碳源對(duì)圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成和含量的影響Fig.4 Effects of carbon source on the fatty acid composition and content of R.toruloides

2.2.2 溫度對(duì)圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成的影響

培養(yǎng)溫度能夠影響細(xì)胞內(nèi)酶的活性,擾動(dòng)細(xì)胞內(nèi)代謝途徑及強(qiáng)度,改變細(xì)胞(膜)中飽和脂肪酸(saturated fatty acid,SFA)和不飽和脂肪酸(unsaturated fatty acids,UFA)的比例[21]。在試驗(yàn)溫度范圍內(nèi),圓紅冬孢酵母中油脂產(chǎn)量為6.57～9.28 g/L,油脂含量49.01%～61.13%,油脂產(chǎn)量和含量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì),表明低溫或高溫均不利于生物量和油脂積累(圖5)。

如圖6所示,在所試溫度范圍內(nèi),油脂中LCFA的含量始終占總脂肪酸的90%以上,其中C18∶1的含量在30.21%～41.70%,C18∶0的含量在14.30%～16.86%,波動(dòng)不大;C16∶0的含量在35.56%～44.82%。SCFA總含量在0.43%～1.58%;MCFA含量為2.04%～2.64%;VLCFA含量為3.07%～5.86%,近1.9倍的變化。此外,結(jié)果還表明培養(yǎng)溫度為20 ℃時(shí)有利于C8∶0、C9∶0、C12∶0以及C17系奇數(shù)碳脂肪酸的積累,但20 ℃時(shí)僅檢測(cè)到17種脂肪酸,未檢測(cè)到C10∶0、C18∶2、C25∶0和C26∶0;37 ℃有利于C20∶0、C22∶0和C24∶0等VLCFA的積累。

圖5 溫度對(duì)圓紅冬孢酵母的生物量、油脂濃度和油脂含量的影響Fig.5 Effect of temperatures on the biomass,lipid titer,and lipid content of R.toruloides

∑C18/∑C16和C18∶1/C18∶0可分別作為延長(zhǎng)酶和Δ9去飽和酶活性的參數(shù)[22]。調(diào)控溫度能夠改變油脂中SFA與UFA的比例。當(dāng)溫度較低時(shí),∑C18/∑C16和值都比較低,提示延長(zhǎng)酶和Δ9去飽和酶活性較低,影響了相應(yīng)脂肪酸的合成。

a-脂肪酸類別;b-SCFA;c-MCFA;d-LCFA;e-VLCFA圖6 溫度對(duì)圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成和含量的影響Fig.6 Effect of temperature on the fatty acid composition and content of R.toruloides

2.2.3 pH對(duì)圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成的影響

培養(yǎng)基pH能夠改變蛋白質(zhì)等生物大分子所帶電荷,引起細(xì)胞膜電荷變化,從而改變微生物吸收利用營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的能力[23]。培養(yǎng)基中初始pH為4～8時(shí),圓紅冬孢酵母中油脂產(chǎn)量為77.06～9.16 g/L,油脂含量為48.41%～58.90%(圖7)。

如圖8所示,C18∶1含量為40.03%～43.60%,C18∶0含量為11.23%～13.63%,C16∶0含量為32.95%～36.16%,表明初始pH值對(duì)C16∶0、C18∶0和C18∶1的含量影響較小。在pH為7和8時(shí),C16∶1含量是其他pH時(shí)1.5倍左右。在pH為5時(shí)有利于C18∶2的積累。pH在4～8,SCFA含量為0.32%～0.63%,MCFA的含量為2.10%～2.26%,VLCFA的含量為2.59%～3.35%。當(dāng)pH為5時(shí),SCFA含量降至最低;pH為4時(shí),C22∶0的含量最高。

圖7 初始pH對(duì)圓紅冬孢酵母的生物量、油脂濃度和油脂含量Fig.7 Effect of initial pH on the biomass,lipid concentration,and lipid content of R.toruloides

a-脂肪酸類別;b-SCFA;c-MCFA;d-LCFA;e-VLCFA圖8 初始pH對(duì)圓紅冬孢酵母的脂肪酸組成和含量的影響Fig.8 Effect of initial pH on the fatty acid composition and content of R.toruloides

3 結(jié)論

本文解析了圓紅冬孢酵母、皮狀絲孢酵母、斯達(dá)式油脂酵母和彎曲隱球酵母的油脂脂肪酸組成,證明產(chǎn)油酵母能夠合成和積累鏈長(zhǎng)介于6～26的多種脂肪酸。通過調(diào)控培養(yǎng)條件,能夠改變產(chǎn)油酵母油脂中脂肪酸的組成。碳源和溫度對(duì)油脂脂肪酸組成的影響較大,主要影響C16和C18系脂肪酸、SCFA和VLCFA在油脂中組成比例,而初始pH則會(huì)影響油脂產(chǎn)量和含量。本研究豐富了產(chǎn)油酵母脂肪酸組成的相關(guān)信息,為后續(xù)構(gòu)建脂質(zhì)細(xì)胞工廠合成特定脂肪酸及衍生物提供了依據(jù)。