黃日昇，彭云娟，李軼春

北海市中醫(yī)醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，廣西 北海 536000

長(zhǎng)期以來(lái)，由于抗生素、激素、抗腫瘤化療與放療藥物、免疫抑制劑、留置管和器官移植的廣泛應(yīng)用，臨床機(jī)會(huì)性真菌感染的發(fā)病率和死亡率逐年上升[1-3]，真菌已成為醫(yī)院感染的主要病原體之一。(1,3)-β-D-葡聚糖[(1,3)-β-D-glucan，BDG]是真菌細(xì)胞壁的主要成分，其含量可達(dá)到50%以上，其他微生物尚未發(fā)現(xiàn)有此物質(zhì)[4]，因此其成為深部真菌感染研究的熱點(diǎn)[5]。血清(1,3)-β-D-葡聚糖測(cè)定(G試驗(yàn))適用于除了隱球菌、接合菌(毛霉菌)外的深部真菌感染早期診斷，是目前應(yīng)用于侵襲性真菌感染(invasive fungal infection，IFI)輔助診斷最常用的非侵襲性血清學(xué)方法[6]。但在實(shí)際臨床案例中發(fā)現(xiàn)G試驗(yàn)假陽(yáng)性或假陰性率較高，影響其結(jié)果的因素較多，而實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程中反應(yīng)主試劑溶解方式的不同是主要影響因素之一，卻沒有得到足夠的重視。本文旨在通過(guò)對(duì)G試驗(yàn)(光度法)反應(yīng)主試劑采用手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解的檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行比較研究，分析主試劑不同溶解方式對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，提高G試驗(yàn)的敏感度與特異度。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2019年6～12月北海市中醫(yī)醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科、肺病科、腫瘤科長(zhǎng)期使用廣譜抗菌藥物、免疫抑制劑、糖皮質(zhì)激素、正在化療或放療的126例有臨床感染癥狀擬診IFI患者為研究對(duì)象，其中男性78例，女性48例，平均年齡(62.55±5.58)歲。本研究獲得醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有患者知情同意。本研究參考?xì)W洲癌癥研究治療組織及真菌研究組(EORTC/MSG)的診斷標(biāo)準(zhǔn)和中國(guó)侵襲性真菌感染工作組制定的臨床診斷侵襲性真菌病的診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]：(1)確診：組織病理學(xué)證實(shí)為真菌，無(wú)菌組織及血液培養(yǎng)為真菌；(2)臨床診斷：具有IFI宿主因素及臨床表現(xiàn)，同時(shí)伴有一項(xiàng)病原學(xué)依據(jù)；(3)臨床擬診：具有IFI宿主因素及臨床表現(xiàn)，無(wú)病原學(xué)依據(jù)，抗真菌治療有效；(4)排除診斷：不符合以上標(biāo)準(zhǔn)，單用抗菌藥物治療有效。IFI感染患者為確診和臨床診斷患者；不符合上述診斷標(biāo)準(zhǔn)，而明確細(xì)菌、病毒感染者為非侵襲性真菌感染患者。按照IFI確診標(biāo)準(zhǔn)將126 例患者分為感染組60 例和未感染組66例。

1.2 儀器與試劑 北京金山川MB-80 快速動(dòng)態(tài)微生物檢測(cè)系統(tǒng)、MI-01 智能金屬浴、KJ-201C 微量振蕩器；試劑：北京金山川科技有限公司生產(chǎn)的真菌(1,3)-β-D-葡聚糖檢測(cè)試劑盒(光度法)，GKT-1M包裝規(guī)格，主要組成包括反應(yīng)主試劑(成分：G因子、凝固酶原、凝固蛋白原。規(guī)格：凍干品，凍干前體積0.2 mL/支)、樣品處理液(成分：表面活性劑0.05%，K+0.01 mol/L，Mg2+0.02 mol/L。規(guī)格：0.9 mL/支)；配套材料：喜諾促凝劑型采血管、無(wú)熱源專用平底試管、一次性無(wú)熱源吸頭。

1.3 方法

1.3.1 G試驗(yàn)反應(yīng)主試劑手工振蕩與儀器振蕩溶解方法 選擇專用喜諾促凝劑型采血管采集靜脈血4 mL，3000 r/min 離心10 min，取上層血清0.1 mL，加入0.9 mL 樣品處理液中，使用移液器混勻后，在70℃的MI-01 智能金屬浴加熱15 min，然后自動(dòng)啟動(dòng)冷卻程序，冷卻5 min，此時(shí)的處理液上層為待測(cè)樣品。取該上層樣品0.2 mL(切忌震蕩)加入到反應(yīng)主試劑瓶子中(凍干品，凍干前體積0.2 mL/支)，反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解方式是使用手指輕輕敲振試劑瓶，肉眼判斷凍干品試劑完全溶解至無(wú)色透明；而反應(yīng)主試劑儀器振蕩溶解方式，則使用KJ-201C 微量振蕩器振蕩反應(yīng)主試劑瓶10 s 或20 s 以上，然后分別將這兩種溶解方法的復(fù)溶液移液至無(wú)熱源專用平底試管中(避免氣泡)，將其插入MB-80 儀進(jìn)行測(cè)定，反應(yīng)結(jié)束后，標(biāo)準(zhǔn)曲線將自動(dòng)計(jì)算待測(cè)血清中BDG的含量，以此比較反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解方式不同對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響。兩種溶解方式的敏感度和特異度計(jì)算公式為：敏感度=真陽(yáng)性例數(shù)/(真陽(yáng)性例數(shù)+假陰性例數(shù))；特異度=真陰性例數(shù)/(真陰性例數(shù)+假陽(yáng)性例數(shù))。試劑盒檢驗(yàn)結(jié)果解釋：＜60 pg/mL，無(wú)深部真菌感染(隱球菌、接合菌除外)；60～100 pg/mL，為觀察期，應(yīng)連續(xù)監(jiān)測(cè)；＞100 pg/mL，懷疑為深部真菌感染，建議臨床結(jié)合癥狀治療(本次研究判定為陽(yáng)性檢測(cè)結(jié)果)。

1.3.2 質(zhì)量控制 使用同一批號(hào)試劑盒配套質(zhì)控品(含BDG112.5 pg/mL，靶值225 pg/mL，質(zhì)控范圍160～290 pg/mL)與樣本一同檢測(cè)，使用常規(guī)質(zhì)量控制規(guī)則。

1.3.3 數(shù)據(jù)資料收集整理 通過(guò)衛(wèi)寧健康常規(guī)檢查系統(tǒng)與臨床信息系統(tǒng)CIS采集分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用χ2檢驗(yàn)，計(jì)量資料符合正態(tài)分布，以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)。均以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患者的G 試驗(yàn)反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解檢測(cè)結(jié)果比較 感染組與未感染組患者G 試驗(yàn)反應(yīng)主試劑儀器振蕩溶解方法較手工振蕩溶解方法有較低的標(biāo)準(zhǔn)差，兩組兩種溶解方法檢測(cè)結(jié)果比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，見表1。感染組G 試驗(yàn)反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解方法與儀器振蕩溶解方法檢測(cè)結(jié)果的敏感度分別為81.7%、90.0%；未感染組兩種溶解方法檢測(cè)結(jié)果的特異度分別為84.8%、92.4%。兩種方法檢測(cè)結(jié)果的敏感度和特異度比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。后者檢測(cè)結(jié)果敏感度與特異度分別較手工溶解方法提高8.3%與7.6%，見表2。

表1 感染組與未感染組反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

表1 感染組與未感染組反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解檢測(cè)結(jié)果比較(±s)

組別感染組未感染組t值P值例數(shù)6066手工振蕩復(fù)溶方法(pg/mL)137.27±45.8654.79±21.5412.780.001儀器振蕩復(fù)溶方法(pg/mL)119.73±26.0545.50±16.1718.970.001

表2 兩組患者的反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解陽(yáng)性率比較[例(%)]

2.2 G 試驗(yàn)反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解方法室內(nèi)質(zhì)控失控率比較 反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解后，同時(shí)使用同一批號(hào)試劑盒附帶質(zhì)控品進(jìn)行檢測(cè)，隨機(jī)挑選112 d 室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)，分析室內(nèi)質(zhì)控失控率，儀器振蕩較手工振蕩溶解方法失控率降低8.04%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=7.74，P=0.010＜0.05)，見表3。

表3 手工振蕩與儀器振蕩溶解方法室內(nèi)質(zhì)控失控率比較[例(%)]

2.3 G 試驗(yàn)反應(yīng)主試劑手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解方法室內(nèi)質(zhì)控統(tǒng)計(jì)數(shù)值比較 隨機(jī)挑選30 d室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析，手工振蕩溶解與儀器振蕩溶解檢測(cè)結(jié)果的室內(nèi)質(zhì)控統(tǒng)計(jì)數(shù)值均值分別為(241.41±47.35)pg/mL、(209.37±8.97)pg/mL，顯示使用儀器振蕩溶解方法所獲得的檢測(cè)結(jié)果均值更接近靶值(225 pg/mL)，明顯降低了標(biāo)準(zhǔn)差，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.64，P＜0.05)。

2.4 儀器振蕩溶解方法振蕩時(shí)間長(zhǎng)短對(duì)室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)值影響 隨機(jī)挑選30 d 室內(nèi)質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)分析，儀器振蕩溶解10 s與20 s以上兩種方法，其室內(nèi)質(zhì)控統(tǒng)計(jì)數(shù)值均值分別為(209.88±1.65)pg/mL和(209.27±1.33) pg/mL，兩種方式檢測(cè)結(jié)果的均值均接近靶值(225 pg/mL)，均有較低的標(biāo)準(zhǔn)差，同時(shí)顯示均值、標(biāo)準(zhǔn)差與儀器振蕩時(shí)間延長(zhǎng)(＞10 s)非線性關(guān)系，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=1.56，P＞0.05)。

3 討論

IFI 為常見疾病，主要由真菌侵入人體血液或組織，并生存和繁殖，進(jìn)而引起相應(yīng)組織器官損傷或發(fā)生炎癥反應(yīng)，嚴(yán)重威脅患者生命健康安全[8]。G試驗(yàn)具備操作簡(jiǎn)便、敏感度和特異度均較高等優(yōu)勢(shì)，廣泛應(yīng)用于臨床，成為IFI早期診斷的常用檢測(cè)方法[9]。

目前，G試驗(yàn)多數(shù)采用BDG抗原檢測(cè)法檢測(cè)BDG含量，BDG可特異性激活鱟變形細(xì)胞裂解產(chǎn)物中的G因子，從而激活凝血酶原形成凝固酶，使裂解物凝固。主要通過(guò)以下兩種方法檢測(cè)BDG濃度：一種是比濁法(濁度法)，即根據(jù)凝固后濁度增加引起吸光度或透光率的變化來(lái)檢測(cè)BDG含量。另一種是顯色法(光度法)，即在試劑中加入顯色底物，活化的凝固酶將底物中的黃色發(fā)光基團(tuán)(對(duì)硝基苯胺)釋放出來(lái)，通過(guò)吸光度的變化來(lái)檢測(cè)BDG 含量[10]。因此G試驗(yàn)反應(yīng)主試劑(凍干品)是否完全溶解，將影響吸光度或透光率的變化，從而影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

有研究報(bào)道，較多干擾因素可引起G試驗(yàn)假陽(yáng)性結(jié)果，極大影響了G 試驗(yàn)的敏感度與特異度[11-14]。最新研究顯示BDG 形態(tài)均一性也是影響G 試驗(yàn)的因素之一，BDG 以三螺旋結(jié)構(gòu)為主，但同時(shí)也存在單鏈和雙螺旋結(jié)構(gòu)等其他形態(tài)。目前對(duì)樣本進(jìn)行前處理主要有加熱稀釋法和堿處理法，前者很難使BDG形態(tài)均一化[15]，而后者可使多聚體形態(tài)轉(zhuǎn)化為單鏈結(jié)構(gòu)，從而獲得均一的BDG[16]。因此有學(xué)者提出用堿處理法提高試驗(yàn)的特異度，但堿處理法可能需要自動(dòng)化儀器設(shè)備，更高的檢測(cè)成本。通過(guò)文獻(xiàn)搜索顯示，大量學(xué)者研究更傾向利用G 試驗(yàn)聯(lián)合痰真菌培養(yǎng)與半乳甘露聚糖抗原檢測(cè)(GM試驗(yàn))來(lái)提高IFI早期診斷的敏感度與特異度，而在原有儀器設(shè)備基礎(chǔ)上，通過(guò)優(yōu)化G試驗(yàn)檢測(cè)流程，改良G試驗(yàn)主試劑溶解方式等方面的應(yīng)用研究卻被忽視，未能得到足夠的重視[9-10，17-18]。

目前關(guān)于G 試驗(yàn)反應(yīng)主試劑溶解的標(biāo)準(zhǔn)操作要求、振蕩溶解時(shí)間長(zhǎng)短、原理、影響因素等方面的研究報(bào)道極少。在本研究中，實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示感染組反應(yīng)主劑手工振蕩溶解后檢測(cè)結(jié)果的敏感度與未感染組反應(yīng)主劑手工振蕩溶解后檢測(cè)結(jié)果的特異度分別為81.7%、84.8%，與孟文晴等[9](82.1%、85.5%)、黃永杰等[18](82.30%、85.42%)研究基本一致，而使用儀器振蕩溶解后的檢測(cè)結(jié)果顯示，其顯著提高了感染組的敏感度(90.0%)與未感染組的特異度(92.4%)，降低了標(biāo)準(zhǔn)差。原因可能是儀器振蕩溶解的頻率、力度控制比手工法更恒定均勻，能使反應(yīng)主劑中的G 因子、凝固酶原等內(nèi)容物徹底溶解，從而更容易被樣本中的BDG 特異性激活，使檢測(cè)的敏感度和特異度增加。室內(nèi)質(zhì)控統(tǒng)計(jì)數(shù)值均值結(jié)果也顯示，儀器震蕩溶解法檢測(cè)結(jié)果的均值更接近靶值，降低了G試驗(yàn)(光度法)檢測(cè)結(jié)果的失控率與標(biāo)準(zhǔn)差。同時(shí)通過(guò)儀器振蕩復(fù)溶10 s 與20 s 兩種方法檢測(cè)結(jié)果差異無(wú)顯著性推測(cè)，儀器振蕩10 s已經(jīng)可以充分溶解反應(yīng)主試劑(凍干品)內(nèi)容物，不會(huì)造成其溶解不完全，避免了因殘留的凍干品顆粒增多，而導(dǎo)致吸光度增加引起的假陽(yáng)性。

綜上所述，在相同的條件下，G實(shí)驗(yàn)(光度法)反應(yīng)主試劑采用儀器振蕩(振蕩10 s即可)溶解方式的檢測(cè)結(jié)果與手工振蕩溶解檢測(cè)結(jié)果相比，前者能降低G試驗(yàn)的標(biāo)準(zhǔn)差，提高檢測(cè)的敏感度與特異度。