秦璐 ，谷永勝 ，李琳 ，張凱華 ，姚文濤 ，吳宗鍇，何偉亮，牛小莉，李俐濤，王賀波*

腦血管病發(fā)病率、致殘率、死亡率高，是影響居民生活質(zhì)量的重要原因。全球疾病負擔(dān)研究顯示，缺血性腦血管病約占所有腦血管病事件的62.4%［1］，腦血管病已成為我國健康壽命損失的第一病因［2］。目前認為，動脈粥樣硬化是缺血性心腦血管病發(fā)生、發(fā)展的重要病理學(xué)基礎(chǔ)［3］，而超聲測定頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度（carotid intima-media thickness，cIMT）作為一種臨床常用的無創(chuàng)性動脈粥樣硬化檢測方法，已在世界范圍內(nèi)被廣泛使用［4］。橫斷面研究表明，血清總膽紅素（total bilirubin，TBIL）水平與高血壓、高脂血癥患者cIMT呈負相關(guān)［5-7］，提示TBIL可能為動脈粥樣硬化的保護因素，但目前探究TBIL和間接膽紅素（indirect bilirubin，IBIL）作用的大型隊列研究較少。本研究通過回顧性隊列研究方法，應(yīng)用彩色超聲診斷儀測定cIMT，探討TBIL和IBIL平均暴露水平對健康體檢人群頸動脈粥樣硬化進展的影響，以期為腦血管病防治提供新思路。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本隊列研究數(shù)據(jù)來自2010年1月至2019年12月于河北省人民醫(yī)院體檢中心進行健康體檢者。所有研究對象均為石家莊地區(qū)居民。納入標準：（1）初次體檢時cIMT≤1 mm；（2）進行≥2次的體檢且初次體檢時TBIL≤34.2 μmol/L。排除標準：（1）初次體檢或隨訪結(jié)束時的TBIL和/或IBIL數(shù)據(jù)缺失者；（2）潛在的吉爾伯特人群，即TBIL＞34.2 μmol/L，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）＞80 U/L和/或丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）＞80 U/L者［8］；（3）嚴重腎臟疾病、心功能不全，以及醛固酮增多癥、庫欣綜合征等糖脂代謝異常者。本研究經(jīng)河北省人民醫(yī)院倫理委員會審核批準（編號：2021102）。

1.2 資料收集 （1）一般資料收集。第一次體檢時收集參與者信息，包括年齡、性別、吸煙和飲酒狀況、既往史。（2）體格檢查。測量身高、體質(zhì)量，計算體質(zhì)指數(shù)（BMI）；使用自動血壓計測量靜坐血壓，包括收縮壓和舒張壓，測血壓前休息5 min，均檢測右手臂，間隔5 min后復(fù)測，計算兩次測量的平均值。（3）實驗室檢查。第一次體檢時禁食至少8 h，采集靜脈血液標本，采用血液分析儀測定白細胞計數(shù)（WBC）、中性粒細胞計數(shù)（NEUT）。采用日本日立公司全自動生化分析儀進行生化指標檢測。采用CHOD-PAP底物法測定血清總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG），采用直接法和選擇抑制法分別測定高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），采用國際臨床化學(xué)與檢驗醫(yī)學(xué)聯(lián)合會推薦方法測定AST、ALT，采用己糖激酶法測定血糖，采用脲酶-谷氨酸脫氫法測定尿素氮（BUN），采用堿性苦味酸法測定血肌酐（Scr），采用釩酸鹽氧化法測定TBIL和直接膽紅素（direct bilirubin，DBIL），計算IBIL。（4）超聲檢查。應(yīng)用彩色超聲診斷儀（佳能醫(yī)療系統(tǒng)和西門子醫(yī)療系統(tǒng)）測量cIMT，醫(yī)師經(jīng)過標準化專業(yè)培訓(xùn)并獲得資格認證。縱向掃描雙側(cè)頸動脈（圖1），動脈壁的兩條高回聲線分別為內(nèi)膜線和中膜線，兩條高回聲線之間的距離即為cIMT，測量雙側(cè)cIMT取平均值。

圖1 頸動脈內(nèi)膜-中膜厚度的測量Figure 1 Measurement of carotid intima-media thickness

1.3 定義與診斷標準 （1）高血壓：收縮壓/舒張壓≥140/90 mm Hg（1 mm Hg=0.133 kPa），或既往診斷為高血壓，目前正在服用降壓藥物者［9］。（2）糖尿?。嚎崭寡恰?.0 mmol/L或餐后2 h血糖≥11.1 mmol/L或口服葡萄糖耐量試驗（OGTT ）2 h血糖≥11.1 mmol/L，或既往診斷為糖尿病，目前應(yīng)用降糖藥物或胰島素者［10］。（3）BMI分組：以BMI=24 kg/m2作為成年人超重與否的分界線［11］。（4）IBIL計算公式：IBIL=TBIL-DBIL。（5）估算的腎小球濾過率（eGFR）計算公式：eGFR=175×Scr-1.154×年齡-0.203×（0.742女性）［12］。（6）腎功能不全是指有慢性腎臟病史且eGFR＜60 ml·min-1·（1.73 m2）-1的患者。（7）心功能不全：紐約心功能分級為Ⅳ級，即休息時也有心源性呼吸困難癥狀者。（8）吸煙定義為目前吸煙或既往吸煙而戒煙未滿3年，飲酒定義為每日飲用白酒＞40 g。（9）隨訪終點：頸動脈粥樣硬化進展，即體檢發(fā)現(xiàn)cIMT＞1 mm；如隨訪期內(nèi)cIMT未增加，則以最后一次體檢時間為隨訪終點。（10）分組定義：頸動脈粥樣硬化進展組為隨訪終點時cIMT＞1 mm；非進展組為直至隨訪結(jié)束，cIMT≤1 mm。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用Excel軟件導(dǎo)出數(shù)據(jù)并雙人整理核查，采用R 4.0.3軟件進行統(tǒng)計分析。正態(tài)分布的計量資料采用（±s）表示，兩組比較采用獨立樣本t檢驗；非正態(tài)分布的計量資料采用中位數(shù)（四分位數(shù)間距）〔M（QR）〕表示，兩組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗；計數(shù)資料采用相對數(shù)表示，兩組間比較采用χ2檢驗。以膽紅素水平為自變量構(gòu)建Cox比例風(fēng)險回歸模型，采用方差膨脹因子診斷法檢驗混雜因素之間是否存在共線性，排除方差膨脹因子＞5的混雜因素，分析血清膽紅素水平與頸動脈粥樣硬化進展的關(guān)系。由于部分參與者的血清清蛋白信息不完整，本研究在主模型分析中沒有考慮血清清蛋白水平，通過調(diào)整有清蛋白數(shù)據(jù)的參與者的血清清蛋白水平進行敏感性分析，驗證結(jié)論。以P＜0.05（雙側(cè)）為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 研究對象頸動脈粥樣硬化進展情況 共入選11 394例研究對象，其中女3 962例（34.77%），男7 432例（65.23%），平均基線年齡（48.6±12.4）歲，參與者的平均隨訪時間為（2.39±1.46）年；在隨訪期間，1 586例（13.92%）cIMT增加，納入頸動脈粥樣硬化進展組，9 808例（86.08%）cIMT無增加，納入非進展組。

2.2 頸動脈粥樣硬化進展組與非進展組基線特征比較 頸動脈粥樣硬化進展組與非進展組年齡、性別、BMI、高血壓史、糖尿病史、LDL-C、TC、TG、ALT、AST、BUN、eGFR水平比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；吸煙史、飲酒史、WBC、NEUT、HDL-C、Scr水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 頸動脈粥樣硬化進展組與非進展組基線特征比較Table 1 Comparison of characteristics between the carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

2.3 頸動脈粥樣硬化進展組與非進展組不同性別研究對象TBIL和IBIL水平比較 頸動脈粥樣硬化進展組平均TBIL和IBIL水平分別為（14.59±4.60）μmol/L和（10.90±3.54）μmol/L，非進展組平均TBIL和IBIL水平分別為（14.44±4.60）μmol/L和（10.89±3.63）μmol/L，兩組間TBIL及IBIL水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（tTBIL=1.26，PTBIL=0.211；tIBIL=0.08，PIBIL=0.937）。在頸動脈粥樣硬化進展組和非進展組中，男性的TBIL和IBIL水平均高于女性，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.001），見表2。

表2 頸動脈粥樣硬化進展組與非進展組不同性別研究對象TBIL和IBIL水平比較（±s，μmol/L）Table 2 Comparison of TBIL and IBIL levels between different genders in carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

表2 頸動脈粥樣硬化進展組與非進展組不同性別研究對象TBIL和IBIL水平比較（±s，μmol/L）Table 2 Comparison of TBIL and IBIL levels between different genders in carotid atherosclerosis progressive group and non-progressive group

注：TBIL=總膽紅素，IBIL=間接膽紅素

性別 例數(shù) TBIL IBIL頸動脈粥樣硬化進展組男1 109 15.34±4.69 11.38±3.64女477 12.16±3.86 9.79±3.01 t值 -11.04 -9.00 P 值 ＜0.001 ＜0.001非進展組男6 323 15.38±4.63 11.55±3.69女3 485 11.90±4.01 9.69±3.19 t值 -29.64 -26.15 P 值 ＜0.001 ＜0.001

2.4 健康體檢人群血清膽紅素水平對頸動脈粥樣硬化進展影響的Cox回歸分析 模型1以cIMT是否增加為因變量（賦值：否=0，是=1），以膽紅素水平（賦值：以實際值納入）為自變量進行Cox回歸分析；模型2在模型1基礎(chǔ)上校正了性別（賦值：女=0、男=1）和年齡（賦值：＜60歲=0、≥60歲=1）；模型3在模型2基礎(chǔ)上校正了BMI（賦值：＜24 kg/m2=0、≥24 kg/m2=1）、吸煙史（賦值：無=0，有=1）、飲酒史（賦值：無=0，有=1）；模型4在模型3基礎(chǔ)上校正了高血壓（賦值：無=0，有=1）、糖尿?。ㄙx值：無=0，有=1）、HDL-C、LDL-C、TG、TC、ALT、AST、eGFR（計量資料以實際值納入）。研究隊列中5人缺失是否患高血壓的信息，85人缺失是否患糖尿病的信息，在進行Cox回歸分析時，模型4及敏感性分析中沒有納入缺失信息者。模型4結(jié)果顯示：TBIL水平每升高1個標準差，頸動脈粥樣硬化進展的風(fēng)險下降6.6%〔HR（95%CI）=0.934（0.881，0.990）〕；IBIL水平每升高1個標準差，頸動脈粥樣硬化進展的風(fēng)險下降17.4%〔HR（95%CI）=0.826（0.777，0.877）〕，見表 3。

表3 健康體檢人群血清膽紅素水平對頸動脈粥樣硬化進展影響的Cox回歸分析Table 3 Cox regression analysis of the influence of serum bilirubin level on the progression of carotid artery plaque in healthy subjects

表4顯示了在模型4基礎(chǔ)上對年齡、性別、BMI、飲酒、吸煙、高血壓、糖尿病進一步分層分析（變量賦值同表3）。結(jié)果顯示TBIL、IBIL對于不同亞組人群頸動脈粥樣硬化的保護作用沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）。

表4 在不同分層人群中膽紅素對頸動脈粥樣硬化進展影響的Cox回歸分析Table 4 Cox regression analysis of the effect of bilirubin on carotid plaque progression in different stratified populations

2.5 敏感性分析 為了排除血清清蛋白水平對膽紅素與頸動脈粥樣硬化進展的混雜影響，且由于僅有部分體檢人群有血清清蛋白數(shù)據(jù)，因此模型5在模型4的基礎(chǔ)上進一步校正血清清蛋白水平，結(jié)果顯示在除外血清清蛋白的影響后，膽紅素水平仍是頸動脈粥樣硬化進展的保護因素〔HR（95%CI）分別為0.912（0.833，0.998）、0.841（0.767，0.922），P＜0.05〕，見表 3。

3 討論

本研究采用隊列設(shè)計，在石家莊地區(qū)研究血清膽紅素對頸動脈粥樣硬化的影響。調(diào)整了混雜因素后發(fā)現(xiàn)，TBIL和IBIL水平是頸動脈粥樣硬化進展的保護因素，IBIL的保護作用更強。

研究表明，膽紅素是動脈粥樣硬化的保護因素［13］。TAO等［14］進一步研究了IBIL的作用，認為IBIL是動脈粥樣硬化的保護因素。本研究結(jié)果支持了上述結(jié)論，且IBIL的保護作用較TBIL更強。BERGMANN等［15］發(fā)現(xiàn)，IBIL對男性和女性的保護作用沒有統(tǒng)計學(xué)差異，本研究結(jié)果支持此結(jié)論。一項涉及2 207例研究對象的橫斷面研究使用肱-踝脈波速度作為觀察指標，得出膽紅素只對男性有保護作用，對女性沒有保護作用的結(jié)論［16］。這些研究結(jié)果的不同可能與研究設(shè)計、人群異質(zhì)性、膽紅素水平不同有關(guān)。有研究發(fā)現(xiàn)膽紅素是最有效的內(nèi)源性抗氧化劑，在腦梗死等急性氧化應(yīng)激事件時可迅速增加，其水平與腦梗死的嚴重程度及不良功能預(yù)后呈正相關(guān)［17］。但在健康人群和高血壓、糖尿病、肥胖等人群中，膽紅素具有抗氧化作用，其水平可能與機體氧化應(yīng)激水平呈負相關(guān)，可降低腦血管病的發(fā)病風(fēng)險［18］。膽紅素代謝途徑如下：血紅蛋白分解為脂溶性的IBIL，后者與清蛋白結(jié)合，在血液中運輸；少于0.01%的膽紅素以游離膽紅素形式存在；IBIL在肝細胞內(nèi)尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1的催化下轉(zhuǎn)化為水溶性膽紅素［19］，即DBIL，大部分DBIL通過膽道系統(tǒng)排出，小部分DBIL水解為非結(jié)合膽紅素，即IBIL，進入腸肝循環(huán)。膽紅素-清蛋白復(fù)合物不能自由通過各種生物膜，降低了其對細胞的影響。膽紅素在肝臟中的結(jié)合反應(yīng)使得膽紅素水溶性增加，利于代謝排出。游離膽紅素水平影響其向組織細胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運，因此膽紅素對于人體有益還是有害主要取決于游離膽紅素水平［20］。游離膽紅素水平不穩(wěn)定且難以測定，故采用IBIL水平代替。因此本研究重點探討了IBIL對動脈粥樣硬化的作用。血液中游離膽紅素水平受多種因素影響，血清清蛋白水平是游離膽紅素水平的影響因素之一［21］，其可影響膽紅素的清除和對機體的作用。在本研究中，調(diào)整人群血清清蛋白水平后，TBIL和IBIL對于頸動脈粥樣硬化仍具有保護作用。

動脈粥樣硬化的典型特征是動脈壁的慢性炎性狀態(tài)，脂質(zhì)和炎性細胞的逐漸積累導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙、動脈壁發(fā)生動脈粥樣硬化［22］。而膽紅素可通過抗氧化、抗感染、免疫調(diào)節(jié)和阻斷細胞間黏附作用，以延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展［20，23-24］。煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶家族是體內(nèi)最重要的活性氧來源，可能參與氧化應(yīng)激介導(dǎo)的端粒縮短［25］，這一途徑可能與動脈粥樣硬化的發(fā)生及進展密切相關(guān)。而膽紅素是一種強大的線粒體超氧化物抑制劑，通過膽紅素加氧酶抑制NADPH氧化酶活性［26］，從而減少體內(nèi)超氧化物的產(chǎn)生。膽紅素還能清除過多的活性氧，減少自由基誘導(dǎo)的脂蛋白氧化修飾［27］。膽紅素通過抑制補體誘導(dǎo)［28］及阻斷促炎細胞因子［24］的產(chǎn)生來影響機體的炎性反應(yīng)途徑。在動脈粥樣硬化形成過程中，內(nèi)皮環(huán)境的改變導(dǎo)致黏附分子表達增加，觸發(fā)免疫細胞遷移到動脈壁［29］。研究表明，IBIL可防止腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)的細胞間黏附分子蛋白的過度表達，從而抑制免疫細胞向動脈內(nèi)膜遷移，限制炎性反應(yīng)，延緩動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展［23］。這為高膽紅素血癥個體預(yù)防動脈粥樣硬化提供了理論依據(jù)。

本研究的局限性：隊列數(shù)據(jù)中缺乏膳食、運動、調(diào)脂藥物使用、糖尿病患者血糖控制情況、是否使用胰島素等信息，所以未能校正上述混雜因素，可能使膽紅素對動脈粥樣硬化進展影響的估計受影響；同時，本研究人群僅源于石家莊地區(qū)，且為回顧性隊列研究，亟待今后開展多中心、前瞻性隊列研究。

綜上所述，膽紅素是動脈粥樣硬化進展的影響因素，TBIL和IBIL水平每升高1個標準差，頸動脈粥樣硬化進展的風(fēng)險分別下降6.6%和17.4%。膽紅素在不同性別、年齡、BMI、高血壓、糖尿病、吸煙、飲酒特征人群中對頸動脈粥樣硬化的影響無差異。本研究對臨床醫(yī)師早期預(yù)防和治療動脈粥樣硬化性疾病有一定的借鑒意義。

作者貢獻：秦璐負責(zé)文章的構(gòu)思與設(shè)計、論文撰寫；秦璐、谷永勝、王賀波負責(zé)研究的實施與可行性分析、結(jié)果的分析與解釋；秦璐、谷永勝、李琳、張凱華負責(zé)數(shù)據(jù)收集；秦璐、谷永勝、李琳、張凱華、姚文濤負責(zé)數(shù)據(jù)整理；秦璐、谷永勝負責(zé)統(tǒng)計學(xué)處理；秦璐、吳宗鍇、何偉亮、王賀波負責(zé)論文的修訂；秦璐、牛小莉、李俐濤負責(zé)英文的修訂；王賀波負責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負責(zé)，監(jiān)督管理。

本文無利益沖突。