謝葉真，趙學(xué)科，宋 昕，徐瑞華，魏夢(mèng)霞，王 苒，韓雪娜，孫 琳,2，陳亞杰,2，馬琳琳,2，喬佳欣,2，白合林，任景麗，周勝理，王立東

食管癌(esophageal cancer, EC)是世界多發(fā)惡性腫瘤之一，位居中國癌癥死亡的第四位[1]。我國是世界食管癌高發(fā)國家之一，新增病例數(shù)位于世界前列[2]。近幾年將早期檢測(cè)、手術(shù)、放化療等運(yùn)用于食管癌的防治，取得了不錯(cuò)的成效，但食管癌的預(yù)后不良，5 a生存率僅有15%～25%[3]。在中國，97%的食管癌是食管鱗癌，具有顯著高發(fā)區(qū)和家族聚集現(xiàn)象兩大流行病學(xué)特征[4]。已有研究表明，食管癌可能是環(huán)境和遺傳相互作用的結(jié)果[5]，其發(fā)生發(fā)展是由多種因素、多個(gè)階段、多個(gè)過程決定的，環(huán)境是主導(dǎo)，通過基因起作用[6-7]?；蚪M變異是DNA的堿基對(duì)改變，包括胚系突變(單核苷酸多態(tài)性，即SNP)和體細(xì)胞突變[8-9]。目前，用全基因組測(cè)序(whole genome sequencing, WGS)和全基因組外顯子測(cè)序(whole exome sequencing, WES)已發(fā)現(xiàn)了很多促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的體細(xì)胞突變[10-11]，但食管癌多發(fā)生在亞種人群，而有關(guān)食管鱗癌胚系突變的研究很少，本次實(shí)驗(yàn)以199例高發(fā)區(qū)食管癌患者的癌組織細(xì)胞和癌旁組織細(xì)胞的全外顯子測(cè)序數(shù)據(jù)，運(yùn)用順式表達(dá)數(shù)量性狀基因座的分析方法，得到了與基因表達(dá)水平相關(guān)的SNP，將其中rs2280851 SNP的3個(gè)基因型與199例高發(fā)區(qū)食管癌患者術(shù)后總生存期進(jìn)行生存分析，運(yùn)用LC-MS/MS蛋白表達(dá)定量測(cè)得CTR9蛋白表達(dá)量，探究食管癌的可疑致病SNP。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

納入的199例患者均來自鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建食管癌防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室50萬例食管癌患者臨床信息數(shù)據(jù)庫[4]，患者均來自于河南省食管癌高發(fā)區(qū)的某市級(jí)醫(yī)院，經(jīng)醫(yī)院確診并行手術(shù)治療，確診時(shí)間為2019年11月至2020年1月。其中男132例(66.33%)，女67例(33.67%)，每位患者對(duì)本研究均知情同意，并且此項(xiàng)研究已獲得鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

收集199位食管癌患者的癌組織和癌旁組織，均為新鮮組織樣本，在手術(shù)切除后30 min內(nèi)進(jìn)行宏觀解剖，并保存在-80℃下。樣本采集前未接受放化療等其他治療，以半定量的方式對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行視覺評(píng)分，僅選擇惡性細(xì)胞>70%的腫瘤進(jìn)行全基因組外顯子測(cè)序。癌旁正常組織是距腫瘤邊緣至少2 cm遠(yuǎn)的鄰近上皮正常組織(生殖系對(duì)照)，用于取樣和分子分析。本研究主要通過電話、家訪、村醫(yī)與患者或患者家屬直接聯(lián)系以及通過新合作醫(yī)療數(shù)據(jù)庫、醫(yī)療保障局?jǐn)?shù)據(jù)庫和公民死亡信息登記管理等系統(tǒng)查詢方式進(jìn)行隨訪，每0.5 a進(jìn)行一次隨訪，記錄去世時(shí)間和主要死因等。本研究隨訪截止到2021年12月31日，隨訪成功199 例。

1.2 組織樣本的制備

將199例食管癌患者的癌組織和癌旁組織配對(duì)，分裝到準(zhǔn)備好的已經(jīng)標(biāo)記的凍存管內(nèi)，樣本編號(hào)為001～199號(hào)，在樣本類型中，食管癌組織用字母T標(biāo)記(Tumor)，癌旁正常組織用字母N標(biāo)記(Normal)。收集到的樣品在液氮中快速冷凍并保存，同時(shí)保證每份樣品有足夠的DNA可供提取。

1.3 多組學(xué)SNP位點(diǎn)捕獲、檢測(cè)與篩選

1.3.1 DNA樣品檢測(cè)利用瓊脂糖凝膠電泳分析DNA樣本是否有蛋白，RNA污染及其降解程度。并用Qubit 3.0測(cè)出DNA樣本濃度，選擇0.6 μg以上的樣品進(jìn)行后續(xù)建庫。

1.3.2 建庫捕獲及上機(jī)測(cè)序采用Agilent液相芯片捕獲系統(tǒng)對(duì)人全外顯子區(qū)的DNA進(jìn)行富集，Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒進(jìn)行建庫及捕獲。后在Illumina平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.3.3 數(shù)據(jù)質(zhì)量控制高通量測(cè)序獲得的原始圖像數(shù)據(jù)經(jīng)過轉(zhuǎn)化后形成原始Raw Data測(cè)序序列。將原始Raw Data數(shù)據(jù)進(jìn)行過濾，并且控制平均堿基位置測(cè)序錯(cuò)誤率低于0.1%，樣本的測(cè)序reads達(dá)到95%以上的對(duì)比率，且堿基覆蓋深度達(dá)到10×以上時(shí)，該點(diǎn)檢測(cè)的SNP比較可信。

1.3.4 多組學(xué)SNP位點(diǎn)篩選實(shí)驗(yàn)方法為WES(由諾禾致源測(cè)序公司進(jìn)行)，基于WES數(shù)據(jù)中所檢測(cè)到的SNP位點(diǎn)，經(jīng)過將正常與癌組織中都有的SNP進(jìn)行比對(duì)，共有62萬個(gè)SNP；其中以編碼區(qū)非同義突變、P<0.2為條件篩選出的SNP位點(diǎn)有3 897個(gè)；在Mutation表中都存在且生存曲線有差異的有797個(gè)位點(diǎn)。

1.4 蛋白表達(dá)的測(cè)定

采用液相色譜—質(zhì)譜(liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)技術(shù)對(duì)199例食管癌的癌組織和癌旁組織樣本進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 rs2280851 SNP與食管癌患者生存期的關(guān)聯(lián)分析

rs2280851與生存期的生存分析曲線表明，rs2280851的A突變?yōu)镚，199例食管癌患者中，有109例G/G基因型個(gè)體，54例A/G基因型個(gè)體，36例A/A基因型個(gè)體；A/A基因型個(gè)體生存率顯著高于G/G基因型個(gè)體，A/A基因型個(gè)體生存率高于A/G基因型個(gè)體，A/G基因型個(gè)體生存率高于G/G基因型個(gè)體(P<0.001)。見圖1。

圖1 3種基因型術(shù)后生存分析比較

2.2 rs2280851與CTR9蛋白表達(dá)量的關(guān)系

eQTL分析表明，eQTL距離調(diào)控基因非常遠(yuǎn)，大于20 Mb以上，是通過調(diào)控HHLA1基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄子調(diào)控蛋白來介導(dǎo)靶標(biāo)目的基因的表達(dá)。作者做了rs2280851與CTR9蛋白表達(dá)量關(guān)系的研究。相對(duì)于rs2280851的參考型A/A，突變型G/G型蛋白表達(dá)量最少，rs2280851突變后，通過調(diào)控HHLA1基因產(chǎn)生的轉(zhuǎn)錄子，顯著降低CTR9的表達(dá)。見圖2。

圖2 rs2280851的3種基因型CTR9蛋白表達(dá)

3 討論

食管癌是常見的消化道腫瘤之一，我國食管癌主要是鱗癌[12]，高發(fā)于河南、山西、太行山、閩粵等地區(qū)[13]。食管癌是環(huán)境和遺傳長期相互作用的結(jié)果，有關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)p53、BRCA2等基因與食管癌相關(guān)[14-15]，但是所用方法通量低，不能鑒別易感基因和變異位點(diǎn)。以高通量方法，系統(tǒng)地闡明食管癌相關(guān)候選基因非常必要。本實(shí)驗(yàn)對(duì)199例高發(fā)區(qū)食管鱗癌患者進(jìn)行全外顯子測(cè)序，通過樣本檢測(cè)、數(shù)據(jù)質(zhì)控及與患者術(shù)后生存期進(jìn)行生存分析，發(fā)現(xiàn)rs2280851位點(diǎn)突變型G/G對(duì)食管鱗癌患者的生存影響較大，為可疑致病SNP。通過NCBI數(shù)據(jù)庫查找，rs2280851位點(diǎn)關(guān)聯(lián)的基因?yàn)镠LLA1。通過LC-MS/MS蛋白表達(dá)定量和eQTL相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)本組患者SNP rs2280851等位基因G的攜帶量與CTR9蛋白的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

rs2280851 SNP影響HLLA1所調(diào)控的CTR9蛋白的表達(dá)，rs2280851 SNP與食管癌患者的生存預(yù)后相關(guān)。正常人與HLLA1基因相關(guān)的rs2280851的堿基是A，當(dāng)A突變后，CTR9蛋白的表達(dá)量降低，但預(yù)后變差。由此可見，HLLA1基因SNP rs2280851G/G型可能是致病SNP。已有研究表明，CTR9是PAF1復(fù)合物重要的組成蛋白，PAF1在RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄時(shí)起到輔助功能，參與染色質(zhì)中組蛋白的甲基化修飾，在細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)錄延伸中發(fā)揮功能[16]。另外一個(gè)重要的蛋白是paf1，paf1和ctr9的突變會(huì)致癌或促進(jìn)癌相關(guān)疾病的發(fā)展[17]。現(xiàn)有研究表明CTR9蛋白在肝癌患者的腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，CTR9的下調(diào)顯著降低了肝癌細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移[18]。

目前普遍認(rèn)為食管癌的發(fā)生機(jī)制是環(huán)境—基因—遺傳相互作用，高發(fā)區(qū)是環(huán)境因素，高發(fā)區(qū)食管癌患者術(shù)后生存期低，可能與HLLA1基因的SNP rs2280851 A突變?yōu)镚，CTR9蛋白表達(dá)降低有關(guān)。本研究運(yùn)用全外顯子測(cè)序技術(shù)和LC-MS/MS蛋白表達(dá)定量，首次提出SNPrs2280851對(duì)應(yīng)的基因HLLA1的突變型GG是食管癌變的重要分子事件，提示HLLA1可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。同時(shí)為“環(huán)境-遺傳-基因互作”食管癌變機(jī)制提供了新的證據(jù)和高危人群分子分型標(biāo)記，有利于預(yù)警篩查早期發(fā)現(xiàn)和防治食管癌高危人群，確定用于早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷和個(gè)體化的分子靶標(biāo)，為進(jìn)一步建立食管癌高危人群預(yù)警篩查、早期發(fā)現(xiàn)和防治提供理論和技術(shù)支撐。