鐘春英， 肖長生， 齊小瓊， 董桃杏

(湖北第二師范學(xué)院化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院， 植物抗癌活性物質(zhì)提純與應(yīng)用湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 武漢 430205)

微生物污染是食品腐敗變質(zhì)的主要原因，一方面會(huì)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，另一方面，某些微生物產(chǎn)生的毒素會(huì)對(duì)人體健康產(chǎn)生威脅.為防止微生物的污染，在食品生產(chǎn)加工的過程中，通常會(huì)加入防腐劑.目前，我國食品工業(yè)中所用的防腐劑以化學(xué)防腐劑為主，如亞硝酸鹽、山梨酸、苯甲酸及其鹽類等.然而，過量使用化學(xué)防腐劑存在食物中毒、致癌等安全問題[1]，因此，尋找天然的生物抑菌活性物質(zhì)取代化學(xué)防腐劑引起了廣泛的關(guān)注[2-3].

微生物分布范圍廣，代謝產(chǎn)物結(jié)構(gòu)新穎，活性多樣，是天然抑菌活性物質(zhì)的重要來源[4].目前，被批準(zhǔn)可作為食品防腐劑使用的微生物來源的抑菌活性物質(zhì)有乳酸鏈球菌素(nisin)、乳酸片球菌素(pediocin)和carnocyclin A[5-6]，在我國，真正被廣泛應(yīng)用的只有乳酸鏈球菌素[7].但乳酸鏈球菌素本身也有缺陷，它在中性和堿性條件下溶解度低且不穩(wěn)定，僅對(duì)革蘭氏陽性菌有抑菌活性，對(duì)革蘭氏陰性菌、霉菌抑制效果不理想[8-10]，因此，發(fā)掘理化性質(zhì)好、廣譜的抑菌活性物質(zhì)以滿足食品工業(yè)防腐的需求成為研究的熱點(diǎn).

目前，國內(nèi)外學(xué)者就篩選廣譜抑菌活性物質(zhì)做了大量的研究，并從不同環(huán)境中分離到一些具有廣譜抑菌作用的微生物.如劉一平等[11]從北冰洋海域沉積物中篩選到一株枯草芽孢桿菌，該菌對(duì)金黃色葡萄球菌、白色念珠菌、肺炎克雷伯氏菌、銅綠假單胞菌、鼠傷寒沙門氏菌、大腸桿菌均有一定的抑制作用；Yi等[12]從陜西楊凌當(dāng)?shù)丶彝プ葬劃{水菜汁中分離到一株能產(chǎn)生細(xì)菌素的棒狀乳桿菌XN8，其對(duì)具有多重耐藥性的阪崎腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌等具有抑制作用；Simmi等[13]從土壤中分離的綠膿桿菌JU-Ch-1對(duì)細(xì)菌和真菌都表現(xiàn)出抑制活性.然而，目前這些產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)微生物的篩選通常是將樣品稀釋涂平板獲得大量的單菌落，再檢測純化的單菌落對(duì)指示菌是否有抑制作用；或者采用雙層平板法，即下層培養(yǎng)基混有指示菌，稀釋的樣品懸液混入上層培養(yǎng)基中培養(yǎng)，然后挑取能對(duì)指示菌產(chǎn)生抑菌圈的菌落檢測其抑菌譜[14].這些方法具有工作量大，效率低，難以得到具有廣譜抑菌活性的菌株等缺點(diǎn).

本實(shí)驗(yàn)以高濃度的土壤菌懸液涂布平板，篩選能產(chǎn)生透明抑菌圈的菌株，利用土壤中微生物種類多、數(shù)量大的特點(diǎn)，快速獲得45株對(duì)其他多種雜菌產(chǎn)生抑制作用的菌株，并對(duì)其中一株活性優(yōu)良的菌株HS-15進(jìn)行分類鑒定，探究培養(yǎng)時(shí)間對(duì)抑菌活性的影響，檢測抑菌活性物質(zhì)的抑菌譜及理化性質(zhì).本研究豐富了產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)微生物的菌種資源庫，為天然食品防腐劑的開發(fā)提供理論基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 土壤樣品 采自湖北隨州大洪山人跡稀少的密林，地理坐標(biāo)為31°31′14″ N，112°57′30″ E，以便獲得新型菌株.

1.1.2 指示菌 金黃色葡萄球菌CCTCC AB91093、枯草芽孢桿菌CCTCC AB90008、蘇云金芽孢桿菌CCTCC AB92004、大腸桿菌CCTCC AB93154、銅綠假單胞菌CCTCC AB2016055、變形桿菌CCTCC AB91103，黑曲霉CCTCC AF91006，黃曲霉CCTCC AF93035，三孢布拉霉菌CCTCC AF96002均購于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，由本實(shí)驗(yàn)室保存.

1.1.3 培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，pH 7.2，用于細(xì)菌的培養(yǎng)及保存；

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH，用于真菌的培養(yǎng)及對(duì)真菌抑菌活性的檢測.

1.1.4 試劑 DNA凝膠回收試劑盒、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司，2×PCR Mastermix、trans2k DNA marker購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白胨購于上海如吉生物科技發(fā)展有限公司，其它常規(guī)試劑購自國藥集團(tuán).

1.2 方法

1.2.1 土壤樣品的采集 選取有機(jī)質(zhì)豐富的土壤，為避免環(huán)境因素的影響，去掉表面覆蓋物，挖取深度為5～20 cm處微生物豐富的土壤，置于樣品采集袋備用.選取多處采集點(diǎn)，共采集樣品50份.

1.2.2 活性菌株的初篩 取1 g土壤加入99 mL滅菌水制成懸濁液，搖床震蕩30 min充分混勻，靜置10 min，取100 μL上清液涂布平板，28 ℃培養(yǎng)72 h，以土壤中含有的豐富的微生物為指示菌，挑取能拮抗其它微生物生長并產(chǎn)生抑菌圈的菌落，進(jìn)行三次平板劃線分離，將純化得到的單菌落轉(zhuǎn)接到新鮮的固體平板上培養(yǎng)后保存?zhèn)溆?

1.2.3 復(fù)篩 以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，參照文獻(xiàn)，用牛津杯法對(duì)初篩得到的菌株進(jìn)行復(fù)篩[8].將分離出的菌株接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)24 h，10 000 r · min-1離心10 min，用0.22 μm微孔濾膜對(duì)上清液進(jìn)行過濾，得到無細(xì)胞發(fā)酵液.將指示菌稀釋為107CFU · mL-1，取100 μL該指示菌液均勻涂布在平板上，再將滅菌的牛津杯置于平板，加入200 μL待測無細(xì)胞發(fā)酵液于牛津杯，4 ℃靜置擴(kuò)散5 h，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并測量抑菌圈直徑.

1.2.4 菌株形態(tài)的鑒定 將菌株接種在牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基上，置于28 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌落形態(tài)特征；挑取少許培養(yǎng)物進(jìn)行革蘭氏染色，顯微鏡下觀察菌體形態(tài).

1.2.5 16S rDNA基因序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 用細(xì)菌基因組試劑盒提取待測菌株的DNA，以其為模板，用細(xì)菌16S rDNA通用引物27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′)擴(kuò)增出該DNA片段.PCR 反應(yīng)體系(25 μL)：27F (10 μmol · L-1) 0.5 μL，1492R (10 μmol · L-1)0.5 μL，DNA 模板 1 μL，2×PCR Mix 12.5 μL，dd H2O 10.5 μL.擴(kuò)增條件為：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性1 min，54 ℃退火1 min，72 ℃延伸1.5 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃補(bǔ)平10 min.用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，DNA凝膠回收試劑盒純化目的條帶，純化產(chǎn)物交由上海生工進(jìn)行測序.

將測序所得的16S rDNA序列在NCBI中的 GenBank數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行BLAST分析，根據(jù)比對(duì)結(jié)果，選取有代表性菌株的16S rDNA序列，利用 Clustal W進(jìn)行比對(duì)，通過MEGA軟件中的NJ(neighbor joining， NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹.

1.2.6 菌株產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵過程 將活化的待測菌株轉(zhuǎn)接至液體培養(yǎng)基中，放入恒溫振蕩器，28 ℃、180 r · min-1培養(yǎng)，每隔2 h取一次樣，測菌液波長為600 nm的吸光值，繪制菌株的生長曲線；以金黃色葡萄球菌為指示菌，牛津杯法檢測不同培養(yǎng)時(shí)間無菌發(fā)酵液的抑菌活性.

1.2.7 抑菌活性物質(zhì)的初步鑒定

1) 發(fā)酵液中有機(jī)酸堿抑菌作用的排除.測定待測無細(xì)胞發(fā)酵液的pH值，與發(fā)酵前培養(yǎng)基的pH作比較，判斷抑菌活性是否由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸或堿引起.

2) 抑菌活性物質(zhì)分子量的初步確定.取5 mL無細(xì)胞發(fā)酵液加入透析袋透析，用PEG進(jìn)行濃縮，濃縮液中加入PBS調(diào)至體積為5 mL，以金黃色葡萄球菌為指示菌，牛津杯法檢測其抑菌活性.

3) 抑菌活性物質(zhì)的蛋白質(zhì)酶穩(wěn)定性檢測.分別取15 mg · mL-1的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶和蛋白酶K 100 μL，加入400 μL無細(xì)胞發(fā)酵液中，37 ℃溫育2 h，用無酶處理的無細(xì)胞發(fā)酵液為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用牛津杯法測其抑菌活性.

1.2.8 抑菌活性物質(zhì)對(duì)溫度和酸堿的耐受性 將無細(xì)胞發(fā)酵液分別置于20 ℃、40 ℃、60 ℃、80 ℃、100 ℃處理30 min，再靜置至室溫，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用牛津杯法檢測處理后發(fā)酵液的抑菌活性.

將無細(xì)胞發(fā)酵液的pH值分別調(diào)節(jié)為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，4 ℃處理2 h，再調(diào)回初始pH值，以未處理組為對(duì)照，以金黃色葡萄球菌為指示菌，用牛津杯法檢測處理后發(fā)酵液的抑菌活性.

1.2.9 抑菌譜的檢測 參照文獻(xiàn)，采用點(diǎn)植法檢測篩選的菌株對(duì)細(xì)菌的抑制作用[15].取107CFU · mL-1的指示菌100 μL，均勻涂布在牛肉膏蛋白胨平板上，用滅菌牙簽蘸取活化的待測菌，點(diǎn)接在涂布有指示菌的平板上，每個(gè)平板上點(diǎn)接3次，接種點(diǎn)之間彼此間隔均勻.37 ℃培養(yǎng)24 h至抑菌圈不再增大，觀察并分別測量抑菌圈和點(diǎn)接的待測菌株外緣直徑，用抑菌圈直徑減去點(diǎn)接的待測菌株外緣直徑表示該菌的抑菌圈大小.

參照文獻(xiàn)，用平板對(duì)峙法檢測篩選的菌株對(duì)真菌的抑制作用[16].用滅菌打孔器挖取直徑6 mm生長旺盛的真菌菌塊，將其放置于PDA平板中央，在距離菌塊2.5 cm處點(diǎn)接活化后的待測菌株，以不接種待測菌株的平板作為對(duì)照，置于28 ℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)3～5 d，觀察待測菌株對(duì)真菌生長的抑制作用.

1.2.10 數(shù)據(jù)分析 實(shí)驗(yàn)中每組數(shù)據(jù)均進(jìn)行3次重復(fù)，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差表示，數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，以p<0.05為顯著水平.

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的篩選

利用高濃度土壤懸液涂平板法，得到45株產(chǎn)明顯抑菌圈的菌株，根據(jù)菌落及菌體形態(tài)特征觀察，初步鑒定其中39株為細(xì)菌，6株為放線菌，圖1展示了部分有抑菌活性的菌株.本實(shí)驗(yàn)采用土壤懸液靜置后的上清液直接涂平板法分離菌種，由于土壤懸液中微生物的種類和數(shù)量較多，涂布后土壤中的多種混合菌體會(huì)長滿平板，故產(chǎn)生明顯抑菌圈的菌株具有較高的產(chǎn)廣譜抑菌活性物質(zhì)的潛力.

圖1 有抑菌活性的部分菌株Fig.1 Several strains with inhibitory activity

以金黃色葡萄球菌和大腸桿菌為指示菌，牛津杯法對(duì)上述有明顯抑菌圈的菌株進(jìn)行復(fù)篩，其中38株菌的無細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌和大腸桿菌有不同程度的抑菌活性，7株菌僅對(duì)金黃色葡萄球菌有抑菌活性，其中編號(hào)為HS-15的菌株抑菌效果較好，以其為對(duì)象進(jìn)行后續(xù)的研究.

2.2 菌株的鑒定

2.2.1 菌株HS-15的形態(tài)特征 菌株HS-15平板劃線長出來的單菌落形態(tài)特征如圖2A所示：圓形、邊緣不規(guī)整，乳白色、質(zhì)地潤澤、不透明.24 h培養(yǎng)物革蘭氏染色如圖2B所示：菌體為桿狀，以鏈狀排列，呈深紫色，為革蘭氏陽性菌.部分菌體已出現(xiàn)芽孢，芽孢形狀為橢圓形.

圖2 菌落形態(tài)(A)和細(xì)胞形態(tài)(B)Fig.2 Morphology of colony (A) and cell morphology (B)

2.2.2 16S rDNA序列相似性和系統(tǒng)發(fā)育分析 以菌株HS-15的總DNA為模板，PCR擴(kuò)增出16S rDNA的片段，長度約為1 400 bp，將測序結(jié)果輸入Genebank進(jìn)行BLAST比對(duì)，獲得相關(guān)的相似序列， Clustal W對(duì)齊后，利用MEGA 7.0軟件計(jì)算序列相似性，構(gòu)建菌株HS-15的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果如圖3所示.由圖可知，HS-15與Bacillusbingmayongensis的親緣關(guān)系最近.結(jié)合HS-15的菌落和菌體特征及系統(tǒng)發(fā)育分析結(jié)果，初步將其鑒定為兵馬俑芽孢桿菌.

圖3 菌株HS -15的16s rDNA系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of strain HS-15

2.3 菌株HS-15產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵過程

測定不同培養(yǎng)時(shí)間菌株HS-15的A600，以金黃色葡萄球菌為指示劑，牛津杯法檢測不同培養(yǎng)時(shí)間HS-15無菌發(fā)酵液的抑菌活性，并測量抑菌圈的大小，菌株HS-15產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)的發(fā)酵過程如圖所示.由圖4可知，菌株HS-15培養(yǎng)4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長期，菌體快速生長，至14 h進(jìn)入穩(wěn)定生長期.在對(duì)數(shù)生長期，隨著菌體的大量繁殖，產(chǎn)生的抑菌活性物質(zhì)逐漸增多，菌體生長8 h的無細(xì)胞發(fā)酵液可以檢測到對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性.隨著發(fā)酵的進(jìn)行，發(fā)酵液中抑菌活性物質(zhì)的濃度逐漸增加，培養(yǎng)20 h時(shí)菌株HS-15無細(xì)胞發(fā)酵液的抑菌活性最強(qiáng)，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈為18.2 mm，隨后，抑菌活性在最高水平維持一段時(shí)間；28 h之后，抑菌圈的直徑開始減小，推測在此階段，穩(wěn)定生長期的部分菌體細(xì)胞裂解，釋放的蛋白酶將部分抑菌活性物質(zhì)降解，故發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的量減少，抑菌活性開始降低.

圖4 菌株HS-15的生長及抑菌物質(zhì)生成曲線Fig.4 Growth curves of HS-15 strain and production of antimicrobial substances

2.4 抑菌活性物質(zhì)的初步鑒定

菌株HS-15培養(yǎng)20 h后，發(fā)酵液pH為7.0，與發(fā)酵前培養(yǎng)基pH(7.2～7.4)沒有明顯的區(qū)別，故可排除抑菌活性是由發(fā)酵過程中產(chǎn)生的有機(jī)酸或堿引起的.

20 h的無細(xì)胞發(fā)酵上清液經(jīng)透析袋、蛋白酶處理后，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性如表1所示.由表1可知，經(jīng)透析袋處理后，抑菌活性沒有變化，表明抑菌活性物質(zhì)不能通過透析袋.

表1 不同處理對(duì)發(fā)酵液抑菌活性的影響

用木瓜蛋白酶2 h處理后，無細(xì)胞發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性有所降低，抑菌圈直徑由17.8 mm降低至12.5 mm，但仍有一定的抑菌活性，表明木瓜蛋白酶能部分降解抑菌活性物質(zhì)；而胰蛋白酶和蛋白酶K處理后，幾乎沒有抑菌圈形成，表明抑菌活性物質(zhì)能被胰蛋白酶和蛋白酶K完全降解.

綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，將抑菌活性物質(zhì)初步鑒定為蛋白質(zhì)類物質(zhì).

2.5 抑菌活性物質(zhì)的穩(wěn)定性

2.5.1 抑菌活性物質(zhì)對(duì)溫度的耐受性 將無細(xì)胞發(fā)酵上清液用不同的溫度分別處理30 min，檢測處理后發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結(jié)果如圖5所示.低溫處理對(duì)活性物質(zhì)的抑菌活性沒有影響.當(dāng)溫度超過60 ℃時(shí)，隨著溫度的升高，抑菌活性有所下降.當(dāng)處理溫度為80 ℃時(shí)，抑菌圈直徑大小由17.3 mm降為13.5 mm；處理溫度為100 ℃時(shí)，抑菌圈降至12.3 mm，仍保持部分抑菌活性，表明菌株HS-15產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具有一定的熱穩(wěn)定性.

圖5 溫度對(duì)活性物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.5 The effect of temperature on antimicrobia activity of the active compound

2.5.2 抑菌活性物質(zhì)對(duì)酸堿的耐受性 將無細(xì)胞發(fā)酵上清液的pH值調(diào)節(jié)到3.0～11.0的不同值，處理2 h后，再調(diào)回起始pH值，測定處理液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌活性，結(jié)果如圖6所示.當(dāng)pH為5～9時(shí)，無細(xì)胞發(fā)酵液的抑菌活性變化不大；經(jīng)過pH為3.0的偏酸溶液和pH為11.0的偏堿溶液處理，抑菌活性有所下降，抑菌圈直徑由對(duì)照樣品的17.6 mm分別降至為11.6 mm、12.5 mm，但仍然有明顯的抑菌活性，表明抑菌活性物質(zhì)對(duì)酸堿有一定的耐受性.

圖6 pH對(duì)活性物質(zhì)抑菌活性的影響Fig.6 The effect of pH on antimicrobia activity of the active compound

2.6 菌株HS-15抑菌活性物質(zhì)的抑菌譜

采用點(diǎn)植法和平板對(duì)峙法分別檢測菌株HS-15對(duì)細(xì)菌和真菌的抑菌活性，測量HS-15菌落和抑菌圈外緣的直徑，用抑菌圈外緣的直徑減去HS-15菌落外緣的直徑表示HS-15菌落抑菌圈的大小.用抑菌圈的大小指征抑菌活性的強(qiáng)弱，當(dāng)抑菌圈直徑>9.0 mm時(shí)，表示抑菌能力較強(qiáng)[11].結(jié)果如表2所示，HS-15對(duì)金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、蘇云金芽孢桿菌等革蘭氏陽性菌，大腸桿菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌等革蘭氏陰性菌，黑曲霉、黃曲霉、三孢布拉霉菌等真菌都有明顯的抑制作用，表明菌株HS-15具有廣譜抑菌活性.其中，對(duì)革蘭氏陽性菌和真菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌.

表2 菌株HS-15的抑菌譜

3 討論

芽孢桿菌在自然界中廣泛存在，因其在生長的后期能形成芽孢，具有抗逆性強(qiáng)，易保藏等特點(diǎn)，且絕大多數(shù)具有良好的安全性，是作為生防菌或微生物生態(tài)制劑的理想菌種[17-18].目前研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬中的許多菌種，如枯草芽孢桿菌、蠟狀芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌等均能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，且這些抑菌活性物質(zhì)普遍具有抑菌譜廣、耐酸堿、熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點(diǎn)[19-22]，這些都為開發(fā)天然防腐劑提供了良好的條件，具有良好的應(yīng)用前景.兵馬俑芽孢桿菌是2014年我國福建省農(nóng)科院劉波團(tuán)隊(duì)首次從秦始皇兵馬俑土壤中分離出來的芽孢桿菌屬新種[23]，而對(duì)兵馬俑芽孢桿菌的功能目前還沒有相關(guān)報(bào)道，本研究首次發(fā)現(xiàn)兵馬俑芽孢桿菌能產(chǎn)生抑菌活性物質(zhì)，豐富了抗菌微生物資源庫，有望發(fā)掘新型抑菌活性物質(zhì).

本研究從土壤中分離到一株具有抑菌活性的兵馬俑芽孢桿菌HS-15，抑菌譜檢測表明，該菌對(duì)革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌和霉菌都有較強(qiáng)的抑制作用，表明其具有廣譜抑菌活性.經(jīng)透析帶處理，抑菌活性不變，但胰蛋白酶和蛋白酶K處理后，抑菌活性完全喪失，推測抑菌物質(zhì)可能為蛋白質(zhì).HS-15的抑菌物質(zhì)對(duì)胰蛋白酶敏感，有利于其經(jīng)食物進(jìn)入人體后，被體內(nèi)的蛋白酶降解，不會(huì)給機(jī)體帶來危害.同時(shí)，本實(shí)驗(yàn)表明，該抑菌物質(zhì)對(duì)木瓜蛋白酶有一定的抗性，可能與不同蛋白酶降解位點(diǎn)不同有關(guān)，抑菌物質(zhì)氨基酸組成的特異性導(dǎo)致其對(duì)不同蛋白酶敏感性不同.據(jù)報(bào)道，芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌蛋白物質(zhì)主要分為兩類：一是由核糖體合成途徑合成的具有抗菌活性的蛋白類抑菌物質(zhì)，具有分子量小、耐熱性好、兩親性等特點(diǎn)，包括具有抗菌活性的大分子蛋白、翻譯后修飾小肽和非修飾小肽三種.另一類是通過非核糖體合成途徑合成的多肽或脂肽，通過多肽合成酶系催化形成肽鍵并延伸肽鏈[24-25].此外，芽孢桿菌抑菌物質(zhì)還有細(xì)胞壁降解酶類、其它抗菌蛋白及揮發(fā)性抗菌活性物質(zhì)[14].菌株HS-15產(chǎn)生的抑菌物質(zhì)具體屬于哪一類活性物質(zhì)還不清楚，后期將對(duì)抑菌成分進(jìn)行分離提純，分析其組成結(jié)構(gòu)、作用機(jī)理及使用安全性，為天然防腐劑的開發(fā)應(yīng)用提供基礎(chǔ)和依據(jù).