陳 悅，劉會超，賈文慶，何松林，郭英姿，朱小佩，王艷麗，杜曉華，王 政

（1. 河南科技學(xué)院，河南 新鄉(xiāng) 453000；2. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)，河南 鄭州 450002）

衰老是一個以細(xì)胞程序性死亡（Programed cell death，PCD）結(jié)束的高度調(diào)控的過程[1-2]。細(xì)胞核是植物細(xì)胞遺傳與代謝的調(diào)控中心，細(xì)胞正常的生理活動依賴于細(xì)胞核的完整性，其形態(tài)是反映植物細(xì)胞衰老程度的重要指標(biāo)，可反映細(xì)胞的PCD 進(jìn)程。曹慧等[3]在對八棱海棠和平邑甜茶的研究中發(fā)現(xiàn)，植物死亡與細(xì)胞核狀況具有顯著相關(guān)性；在小麥胚乳細(xì)胞[4]、月季花瓣細(xì)胞[5]、黃瓜根尖細(xì)胞[6]、煙草花冠細(xì)胞[7]研究中也發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。植物自由基、活性氧產(chǎn)生和消除之間的平衡，是通過2 個抗氧化機(jī)制維持的：一類是酶系統(tǒng)，包括超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、抗壞血酸過氧化物酶（APX）和過氧化物酶（POD）等；另一類是非酶的小分子化合物系統(tǒng)，如酚類物質(zhì)、黃酮類化合物和果糖。當(dāng)遭受外界環(huán)境脅迫時(shí)，植物細(xì)胞的2 個抗氧化系統(tǒng)將開啟，合成酶及非酶清除物質(zhì)，從而減輕活性氧對細(xì)胞生物膜的侵蝕，保護(hù)細(xì)胞結(jié)構(gòu)，如越橘[8]、云南含笑[9]、甜櫻桃[10]、玉蟬花[11]等植物在冷應(yīng)激下SOD 和CAT 活性顯著增加。保護(hù)酶活性和非酶物質(zhì)含量一定程度上是植物細(xì)胞受傷害程度或者細(xì)胞衰亡進(jìn)程的重要指標(biāo)[12-14]。

牡丹（Paeonia suffruticosa）為芍藥科芍藥屬多年生落葉小灌木，是世界著名花卉，其花大色艷，雍容華貴，是富貴祥和的象征。隨著人們生活水平的提高，作為高檔切花的牡丹市場需求量越來越大，探討牡丹切花衰老的機(jī)制對于推進(jìn)牡丹切花產(chǎn)業(yè)化發(fā)展具有重要意義。目前，僅史國安等[15]、王榮花[16]、孟海燕[17]、曹滿等[18]對牡丹鮮切花貯藏技術(shù)方面進(jìn)行研究探討，關(guān)于牡丹鮮切花花瓣細(xì)胞程序性死亡的細(xì)胞學(xué)、生理學(xué)機(jī)制方面的系統(tǒng)研究尚未見報(bào)道。牡丹鳳丹粉株型高大，當(dāng)年生枝條及花梗長達(dá)25～30 cm，直立，是牡丹切花最有前景的材料之一。為此，以牡丹鳳丹粉切花為試材，研究低溫對其切花細(xì)胞核形態(tài)、切花壽命、保護(hù)酶活性、丙二醛（MDA）含量、可溶性蛋白含量及O-·2產(chǎn)生速率等的影響，以期解析低溫下牡丹花瓣衰老的生理及細(xì)胞學(xué)機(jī)制，確定牡丹切花保存最佳溫度，為牡丹切花的保鮮及開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料及處理

試驗(yàn)在河南省園藝植物資源利用與種質(zhì)創(chuàng)新工程研究中心進(jìn)行。以生長一致、健康無病蟲害的7 年生鳳丹粉切花為材料，采集的切花花蕾直徑為2～3 cm，長度為15～20 cm，基部帶木質(zhì)。將切花帶回實(shí)驗(yàn)室，基部斜剪后放入盛有蒸餾水的水瓶，每瓶6 枝，然后分成4 份，每個處理5 瓶、30 枝，分別置于2 ℃、4 ℃、8 ℃、（25±1）℃（室溫，對照）瓶插，每2 d 取樣測定一次，取材周期為17 d，直至花瓣萎蔫凋謝為止。每處理隨機(jī)取樣，重復(fù)測定3次。

1.2 測定指標(biāo)及方法

1.2.1 切花瓶插壽命和最大花徑的統(tǒng)計(jì) 牡丹鳳丹粉切花瓶插壽命計(jì)算參照張玉等[19]的方法，以最外層花瓣展開與花托垂直到花瓣萎蔫失色、凋謝作為瓶插壽命。用游標(biāo)卡尺測定花徑，每2 d 測定一次，取最大值作為最大花徑。

1.2.2 鳳丹粉花瓣細(xì)胞核的形態(tài)觀察 細(xì)胞核的形態(tài)觀察參考曹慧等[3]的方法并加以改進(jìn)。切片采用新鮮花瓣制作，第1層花瓣邊緣向內(nèi)1/3處切取長7～8 mm、寬4～5 mm 的小塊，置于10 mL 70%乙醇中固定2 h后，取出用PBS緩沖液反復(fù)沖洗3次。將沖洗干凈的切片材料置于載玻片上，用濾紙擦干凈，滴加20 μL 濃度為0.029 mol/L 的DAPI 染液，蓋好蓋玻片，于黑暗處染色15～20 min，置于OLYMBUS 熒光倒置顯微鏡下觀察拍照，熒光激發(fā)波長為330～380 nm。以20 倍物鏡觀察載玻片上、下、左、右、中5個視野，用圖像分析軟件IMAGEN 對細(xì)胞核進(jìn)行計(jì)數(shù)，取平均數(shù)。判斷細(xì)胞核正常的標(biāo)準(zhǔn)：當(dāng)細(xì)胞核正常時(shí)，細(xì)胞核位于細(xì)胞正中央，細(xì)胞核形態(tài)完整，邊緣清晰圓滑，為標(biāo)準(zhǔn)的球形，排列整齊。細(xì)胞核正常率計(jì)算公式為:細(xì)胞核正常率=正常細(xì)胞核數(shù)/新鮮花瓣熒光細(xì)胞核數(shù)×100%。

1.2.3 6 個生理指標(biāo)的測定 酶液的提?。簻?zhǔn)確稱量1.000 g 牡丹花瓣，放入預(yù)冷研缽中，加入少許PVP、石英砂，然后加入10 mL 0.05 mol/L 磷酸緩沖液（pH=7.0），勻速研磨30～40 s，然后將混合液倒入試管中，于10 000×g冷凍離心機(jī)里離心20 min，上清液即為酶液。

SOD 活性采用氮藍(lán)四唑法（NBT）[20]測定；CAT活性采用紫外吸收法[21]測定；POD 活性采用愈創(chuàng)木酚顯色法[21]測定。MDA 含量采用硫代巴比妥酸法測定[21]；可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法測定[22]；O-·2含量采用羥胺氧化法[20]測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)均采用DPS 軟件進(jìn)行分析，鄧肯新復(fù)極差法（SSR）檢測各數(shù)據(jù)間的差異，顯著性水平為P＜0.05，采用EXCEL 2010處理數(shù)據(jù)及制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫處理對牡丹鳳丹粉切花瓶插期觀賞品質(zhì)的影響

由表1 可知，不同溫度處理間瓶插壽命差異性顯著，4 個溫度處理下鳳丹粉瓶插壽命依次為4 ℃＝2 ℃＞8 ℃＞對照，4、2 ℃處理下鳳丹粉瓶插壽命最長，達(dá)17 d，對照最短，僅為7 d。4 個溫度處理下最大花徑依次為4 ℃＞8 ℃＞對照＞2 ℃。對照最大花徑為12.8 cm，7 d 時(shí)花瓣全部凋謝；8 ℃處理鳳丹粉瓶插壽命為13 d，最大花徑為13.2 cm；4 ℃處理鳳丹粉瓶插壽命為17 d，最大花徑達(dá)到13.3 cm；2 ℃處理鳳丹粉在衰老過程中出現(xiàn)萎蔫、失水現(xiàn)象，影響切花觀賞性，最大花徑為12.4 cm。4 ℃下較2 ℃下花瓣平展，形態(tài)好，觀賞價(jià)值高，有效延長了瓶插期并保障了鳳丹粉的觀賞性。

表1 低溫處理對牡丹鳳丹粉切花瓶插期觀賞品質(zhì)的影響Tab.1 Effects of low temperature treatment on ornamental value of peony Fengdanfen

2.2 低溫處理對牡丹鳳丹粉切花花瓣細(xì)胞核形態(tài)及正常率的影響

植物細(xì)胞中細(xì)胞核和各種細(xì)胞器在細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定及有序分布是進(jìn)行正常代謝的前提，花瓣細(xì)胞在衰老過程中其成分、結(jié)構(gòu)均會出現(xiàn)異常，細(xì)胞核的形態(tài)在一定程度上是花瓣P(guān)CD 進(jìn)展的標(biāo)志物，通過DAPI 染色后顯微鏡下觀察，可以確定細(xì)胞核的完整情況[23]。由圖1A1—2可知，對照早期處理的花瓣細(xì)胞核熒光明亮，形態(tài)呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的圓形，邊界清晰；由圖1A3—5 可知，隨著處理時(shí)間增加，細(xì)胞核向兩級拉伸變形程度增加，造成正常細(xì)胞核的數(shù)量減少，細(xì)胞核逐漸向兩端拉長變形，后期細(xì)胞核分解逐漸消失。由圖1B2 可以看出，2 ℃處理有少數(shù)花瓣細(xì)胞核在瓶插3 d 開始向兩端拉長變形；由圖1B3—5 可知，隨著處理時(shí)間增加，細(xì)胞核向兩級拉長變形的數(shù)量越來越多，且逐漸模糊消失，正常細(xì)胞核數(shù)降低；由圖1C2—3可知，4 ℃處理花瓣細(xì)胞核在3 d 出現(xiàn)變形；由圖1C4—5 可知，4 ℃處理細(xì)胞核隨時(shí)間的增加而向兩級拉伸變形，逐漸分解消失。由圖1D2—3可以看出，8 ℃處理花瓣細(xì)胞核在3 d開始變形，5 d 僅有少數(shù)細(xì)胞核正常；由圖1D4—5 可知，8 ℃處理7～13 d，僅能看到極少數(shù)正?；ò昙?xì)胞核。由此看出，隨著花瓣細(xì)胞逐漸凋亡，花朵逐漸衰敗，且低溫處理對花瓣細(xì)胞PCD有顯著影響。

圖1 低溫處理下牡丹鳳丹粉切花花瓣DAPI熒光染色細(xì)胞核形態(tài)變化Fig.1 Nuclear shape changes of peony Fengdanfen petals treated by DAPI under low temperature

由圖2 可知，隨處理時(shí)間增加，4 個溫度處理下花瓣細(xì)胞核正常率基本呈下降的趨勢，但下降幅度不同。對照細(xì)胞核正常率下降最快，瓶插3 d 下降52.39 個百分點(diǎn)，8 ℃下降48.47 個百分點(diǎn)，而2 ℃下降36.22 個百分點(diǎn)，4 ℃則下降30.66 個百分點(diǎn)，2 ℃和4 ℃下花瓣細(xì)胞核正常率下降速度較緩慢。瓶插7 d，對照細(xì)胞核正常率僅為1.25%，花朵已經(jīng)萎蔫，花瓣大面積皺縮，出現(xiàn)卷翹現(xiàn)象，失去觀賞價(jià)值；而2、4、8 ℃處理細(xì)胞核正常率分別達(dá)30.83%、48.35%、21.44%，細(xì)胞核形態(tài)較完整，花朵形態(tài)直立，花瓣正常，未出現(xiàn)皺縮卷翹。瓶插時(shí)間越長，細(xì)胞核向兩端拉長變形的數(shù)量越多，2、4 ℃瓶插17 d僅有極少數(shù)細(xì)胞核完整，細(xì)胞核正常率為0.81%、2.33%。4個溫度處理細(xì)胞核形態(tài)變化的趨勢一致，但同一天細(xì)胞核變形程度卻不相同，表明低溫對花瓣細(xì)胞核正常率有顯著影響。綜合來看，與其他3個溫度處理相比，4 ℃下花瓣細(xì)胞核正常率下降緩慢，是鳳丹粉切花保存的最佳溫度。

圖2 低溫處理下牡丹鳳丹粉切花花瓣DAPI熒光染色細(xì)胞核正常率變化Fig.2 Nuclear normal rate changes of peony Fengdanfen petals treated by DAPI under different temperature

2.3 低溫處理對牡丹鳳丹粉切花花瓣保護(hù)酶活性的影響

2.3.1 SOD 活性 由圖3A 可知，不同貯存溫度及處理時(shí)間對SOD 活性有顯著影響（P＜0.05）。隨著處理時(shí)間的增加，對照SOD 活性呈先升后降再升趨勢，峰值出現(xiàn)在7 d，此時(shí)花瓣出現(xiàn)萎蔫失色，喪失瓶插價(jià)值。4 ℃處理5 d降到最低值，但仍高于其他溫度處理，11 d 達(dá)到峰值。4 ℃處理SOD 活性在瓶插期間（1～17 d）保持較高水平，且4 ℃處理花瓣平展，形態(tài)較好，觀賞價(jià)值較高。8 ℃處理鳳丹粉花瓣SOD活性呈升-降-升-降趨勢，11 d達(dá)到峰值。綜合來看，牡丹鳳丹粉切花萎蔫失色時(shí)SOD 活性達(dá)到峰值或處于高水平，此時(shí)可能是花瓣細(xì)胞活性氧、自由基產(chǎn)生過多，需要提高SOD 活性來清除，但隨著時(shí)間的延長，SOD活性不足以抵御傷害，最后造成牡丹切花萎蔫死亡。

2.3.2 POD 活性 由圖3B 可知，隨著處理時(shí)間的增加，對照和2、4 ℃處理POD 活性呈先升高后降低趨勢，8 ℃處理POD 活性呈降-升-降趨勢。瓶插5 d，對照和8 ℃處理POD 活性分別為0.388、0.326 U/g。8 ℃處理POD 活性整體低于對照，與SOD 活性變化一致，這2 個酶活性較低可能是8 ℃下鳳丹粉切花壽命較短的原因。2 ℃和4 ℃處理鳳丹粉POD 活性峰值出現(xiàn)時(shí)間較晚，均在7 d 出現(xiàn)，2 ℃與4 ℃相比POD 活性上升或下降速度都較為緩慢。瓶插中期（5～7 d），4 ℃處理POD 活性較高，降低活性氧、自由基引起的氧化脅迫能力較強(qiáng)，這可能是4 ℃下瓶插品質(zhì)較好的原因。

圖3 4個溫度下牡丹鳳丹粉切花生理指標(biāo)的變化Fig.3 Changes of physiological indexes of peony Fengdanfen at four temperatures

2.3.3 CAT 活性 由圖3C 可知，2 ℃與8 ℃處理CAT 活性變化幅度劇烈，引起瓶插品質(zhì)下降，進(jìn)而縮短瓶插壽命。對照CAT 活性呈升-降-升變化趨勢，在瓶插7 d 出現(xiàn)峰值。4 ℃處理CAT 活性呈升-降-升-降趨勢，瓶插15 d 時(shí)CAT 活性仍為瓶插1 d的1.75 倍。表明在瓶插期間（1～17 d），4 ℃處理鳳丹粉花瓣抗氧化系統(tǒng)與自由基、活性氧處于平衡狀態(tài)，并且在瓶插后期仍然具有較強(qiáng)的清除H2O2能力，能夠有效減輕花朵受到的脅迫傷害，保持花瓣形態(tài)。

2.4 低溫處理對牡丹鳳丹粉切花MDA含量的影響

由圖3D 可知，對照MDA 含量隨著時(shí)間延長呈增加趨勢，瓶插7 d 出現(xiàn)峰值，達(dá)到11.686 nmol/g；8 ℃處理切花MDA 含量呈先升高后降低隨后急劇增加趨勢，13 d 出現(xiàn)峰值，達(dá)到13.503 nmol/g。對照、8 ℃處理下，伴隨著MDA 含量峰值的出現(xiàn)，切花萎蔫失色，表明花瓣膜脂過氧化是其花瓣衰亡的原因之一。2 ℃處理MDA含量變化幅度較大，瓶插7 d出現(xiàn)峰值（6.929 nmol/g），而4 ℃下MDA 含量5 d 達(dá)到峰值（6.982 nmol/g），整體變化較2 ℃下平緩，說明在瓶插過程中膜脂過氧化程度較輕，膜系統(tǒng)較完整，這可能是4 ℃下鳳丹粉切花形態(tài)較好的原因。

2.5 低溫處理對牡丹鳳丹粉切花可溶性蛋白含量的影響

由圖3E可以看出，不同溫度處理之間可溶性蛋白含量整體變化趨向相同，僅2 ℃處理下略有不同。對照可溶性蛋白含量在瓶插7 d 達(dá)到峰值（4.111 mg/g）。4 ℃處理在15 d 出現(xiàn)峰值，在瓶插后期可溶性蛋白含量均高于瓶插1 d時(shí)，可能是因?yàn)樵? ℃下有新的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。2 ℃處理在15 d 出現(xiàn)峰值，與4 ℃處理下瓶插后期變化一致，說明2 ℃和4 ℃低溫處理有可能誘導(dǎo)新的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。8 ℃處理可溶性蛋白含量在瓶插7 d 最高，為3.998 mg/g，13 d 最低，為2.772 mg/g。

2.6 低溫處理對牡丹鳳丹粉切花O-·2產(chǎn)生速率的影響

從圖3F 可知，不同溫度處理下O-·2產(chǎn)生速率變化不同。對照O-·2產(chǎn)生速率呈降-升-降變化趨勢。2、8 ℃處理分別在瓶插3、7 d 出現(xiàn)峰值，2 ℃處理O-·2產(chǎn)生速率變化幅度大，引起瓶插品質(zhì)降低。4 ℃處理O-·2產(chǎn)生速率變化平緩，瓶插17 d 時(shí)O-·2產(chǎn)生速率為瓶插1 d 時(shí)的0.967 倍，說明在瓶插過程中，受到的氧化脅迫較小，因此瓶插壽命較長。

2.7 牡丹鳳丹粉切花生理指標(biāo)及細(xì)胞核正常率的相關(guān)性分析

從表2 可以看出，鳳丹粉細(xì)胞核正常率與POD活性呈極顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.01），與O-·2產(chǎn)生速率、可溶性蛋白含量呈顯著正相關(guān)關(guān)系（P＜0.05），說明低溫處理下POD 是主要的抗氧化酶，其降低鳳丹粉的活性氧水平，消除H2O2和酚類、胺類、醛類、苯類等物質(zhì)對細(xì)胞的毒害，使細(xì)胞代謝保持在平衡狀態(tài)。

表2 牡丹鳳丹粉切花生理指標(biāo)和細(xì)胞核正常率的相關(guān)性分析Tab.2 Correlation analysis physiological indexes and nuclear normal rate of cut flower Fengdanfen

3 結(jié)論與討論

3.1 低溫對牡丹鳳丹粉切花瓶插壽命的影響

溫度是影響植物細(xì)胞衰老速度的主要因素，低溫處理可以減緩細(xì)胞活動。低溫處理增加了藍(lán)莓[24]、獼猴桃[25]等的保鮮時(shí)間，延緩了唐菖蒲[26]和百合[27]、金魚草[28]、牡丹[18]花朵的衰老進(jìn)而延長了其適銷期。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這一點(diǎn)，低溫處理較對照有效地保持了鳳丹粉的花色、形態(tài)，延長了觀賞期，4、2 ℃處理下鳳丹粉瓶插壽命最長，達(dá)17 d，4 ℃觀賞性最佳。

3.2 牡丹鳳丹粉切花細(xì)胞核正常率與瓶插壽命的關(guān)系

切花在細(xì)胞程序性死亡過程中，花瓣?duì)顟B(tài)等表觀特征的健康程度較難量化，而細(xì)胞核是細(xì)胞代謝和遺傳的調(diào)控中心，是細(xì)胞能夠進(jìn)行正常代謝維持生命的重要標(biāo)志物。細(xì)胞核正常率是衡量切花健康程度的主要指標(biāo)，在矮牽牛、金魚草[29-30]的研究中發(fā)現(xiàn)，花瓣中細(xì)胞程序性死亡伴隨著DNA 降解，絕大部分細(xì)胞核彌散、裂解，在干旱脅迫下小麥胚乳細(xì)胞[31]以及月季、鳶尾和密花石斛花瓣[5，32]的研究中同樣發(fā)現(xiàn)了類似現(xiàn)象。本研究結(jié)果表明，2、4 ℃低溫處理下花瓣細(xì)胞核正常率與花朵的姿態(tài)、花瓣的形態(tài)呈明顯正相關(guān)。細(xì)胞核正常率高，細(xì)胞核邊緣清晰，呈現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)的圓形，此時(shí)花瓣細(xì)胞排列整齊一致，花瓣形態(tài)直立，平展無卷翹。細(xì)胞核正常率低時(shí)，花瓣出現(xiàn)卷翹或萎蔫。這表明細(xì)胞核正常率可以作為牡丹切花健康程度量化的代表性指標(biāo)，花朵萎蔫凋零的原因可能是細(xì)胞核的大量變形、彌散，引起細(xì)胞核代謝調(diào)控失調(diào)，導(dǎo)致細(xì)胞核調(diào)控細(xì)胞器等合成相關(guān)保護(hù)酶、氨基酸及蛋白質(zhì)的能力大幅降低，不能抵御外界環(huán)境的脅迫，從而造成活性氧大量積累，MDA 含量增多，膜脂過氧化程度加深，最終引起細(xì)胞死亡，花瓣萎蔫。

3.3 牡丹鳳丹粉切花細(xì)胞核正常率與保護(hù)酶活性、MDA和可溶性蛋白含量、O-·2產(chǎn)生速率的關(guān)系

本試驗(yàn)結(jié)果表明，在瓶插過程中花瓣細(xì)胞核正常率與抗氧化系統(tǒng)具有相關(guān)性，POD 活性是影響花瓣細(xì)胞核正常率的主要因素，其次是O-·2產(chǎn)生速率、可溶性蛋白含量；低溫處理可以減緩H2O2、O-·2等對花瓣細(xì)胞的侵蝕引起的花瓣細(xì)胞PCD，延長瓶插壽命。4 ℃為鳳丹粉切花短期貯藏的適宜溫度；切花花瓣細(xì)胞核正常率是牡丹鳳丹粉花瓣健康狀況的直觀反映，可作為切花質(zhì)量的一個評價(jià)指標(biāo)；氧化脅迫加劇引起細(xì)胞核正常率降低是導(dǎo)致鳳丹粉瓶插壽命縮短的重要原因之一；切花細(xì)胞核彌散過快，細(xì)胞核完整率快速降低、細(xì)胞解體數(shù)過多是對照鳳丹粉切花壽命較短的細(xì)胞學(xué)原因，切花細(xì)胞核彌散慢、正常細(xì)胞核較多是4 ℃下鳳丹粉切花壽命較長的細(xì)胞學(xué)原因。切花瓶插壽命與保護(hù)酶活性具有相關(guān)性，SOD、CAT、POD 活性保持較高水平，切花細(xì)胞能有效清除過多的活性氧、自由基，代謝基本保持平衡是4 ℃下切花壽命較長的生理原因。