楊朝炳 呂賽群 彭濤 牛翔科 植彪 肖建明

(成都大學(xué)附屬醫(yī)院放射科，四川 成都 610081)

近年關(guān)于腰椎神經(jīng)根性疼痛研究[1-3]表明，疼痛原因除了椎間盤突出的機械壓迫外，還包括非機械壓迫因素。隨著腰椎神經(jīng)根非機械壓迫機制研究的深入，各種非壓迫性腰神經(jīng)根性疼痛的介入微創(chuàng)治療得到了飛速發(fā)展，患者獲益良多，但患者預(yù)后定量評估方法有限。磁共振擴散張量成像(Diffusion Tensor Imaging，DTI)能顯示神經(jīng)根走行及量化分析，并能定量評估水分子在組織中的擴散運動[4-6]。腰椎神經(jīng)根的水分子橫向擴散受纖維束多層膜結(jié)構(gòu)的限制，縱向擴散卻不受影響，而DTI中的FA值能定量測定水分子在神經(jīng)纖維束的各向異性值，由此可評價纖維束膜結(jié)構(gòu)的完整性。因此，DTI在外周神經(jīng)系統(tǒng)的應(yīng)用越來越廣泛并取得了良好的效果[7]。本研究探索磁共振擴散張量成像技術(shù)能否定量評估實驗豬腰椎非壓迫性神經(jīng)根炎消炎液微創(chuàng)治療的療效，為進一步的研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選取健康普通級雌性巴馬小型豬共6只，體質(zhì)量20 kg左右，無跛行，實驗前經(jīng)CT及MRI檢查，排除胸腰段脊柱相關(guān)疾病。由成都達(dá)碩實驗動物有限公司提供(生產(chǎn)許可證號：SCXK(川)2013-24)，同時實驗進程中的動物飼養(yǎng)工作亦由該公司承擔(dān)(四川省實驗動物使用許可證號：SYXK(川)2014-189)。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核通過。

1.2 MRI檢查及圖像處理與測量

1.2.1 檢查前準(zhǔn)備 檢查前實驗動物禁食8 h，禁飲4 h。常規(guī)消毒后，肌內(nèi)注射氯胺酮約300 mg，待進入麻醉狀態(tài)后，于耳后靜脈穿刺靜脈留置針，并持續(xù)靜脈滴注氯胺酮混合液(氯胺酮600 mg+地西泮20 mg+500 mL生理鹽水)維持麻醉。實驗過程中，密切關(guān)注實驗動物的一般情況，評估麻醉深度：如因麻醉過淺而不自主運動，可肌內(nèi)加注氯胺酮100 mg；如因麻醉過深而呼吸抑制，可減緩滴注速率。

1.2.2 檢查序列及參數(shù) 使用SIEMENS AVANTO 1.5T超導(dǎo)型磁共振掃描儀進行檢查，使用8通道相控陣脊柱線圈，采取仰臥位、頭先進方式固定實驗動物，動物中線置于線圈中心，身體長軸平行于主磁場長軸。掃描前進行勻場，然后進行T2WI序列、DTI掃描。T2WI序列：采用可變翻轉(zhuǎn)角的自旋回波序列(spcR)矢狀位掃描，TR/TE：2000/117 ms，視野(FOV)250×250 mm，層厚1 mm，層間距0，層數(shù)88，平均次數(shù)2次，分辨率256×254，相位編碼方向：H-F，并行因子2，翻轉(zhuǎn)角150°，帶寬399。DTI：采用單次激發(fā)自旋回波平面成像序列(SE-EPI)橫斷位掃描，TR/TE：12000/117 ms，視野(FOV)200×200 mm，層厚3 mm，層間距0，層數(shù)48，平均次數(shù)5次，分辨率132×132，相位編碼方向：A-P，并行因子2，帶寬996，彌散方向12，b值0、800。

1.2.3 MRI圖像處理與測量 圖像的后處理工作在SIEMENS工作站進行，運用neuro 3D(MR)軟件進行后處理，先將T2解剖圖像進行多平面重建，然后將重建后的多平面圖像與DTI進行融合，定義參數(shù)：b0閾值為60～1353，Diffusion Map閾值0～1000，b值為800。結(jié)合橫斷位T2解剖圖像輔助定位進行神經(jīng)根FA值的測量。測量每根神經(jīng)根的三個節(jié)段，并取其平均值的方法，盡量減小測量誤差。感興趣區(qū)(Region of interest，ROI)的大小為12～28 mm2(18.3±7.6 mm2)。ROI放置位置分別為L2～3、L3～4、L4～5雙側(cè)神經(jīng)根椎間孔外段、椎間孔內(nèi)段及椎管內(nèi)段的中央?yún)^(qū)域，測量范圍應(yīng)避免超出所測量的神經(jīng)根截面，并盡可能多的包含神經(jīng)根。

1.3 非壓迫性神經(jīng)根炎造模及微創(chuàng)介入治療

1.3.1 非壓迫性神經(jīng)根炎造模 磁共振檢查完成后，繼續(xù)保持實驗動物麻醉狀態(tài)，將實驗動物移至CT檢查床俯臥位固定，對術(shù)區(qū)進行常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，在CT引導(dǎo)下用17 cm 19G巴德針穿刺L2～3、L3～4、L4～5椎間盤髓核，連接電動經(jīng)皮椎間盤旋切器(Stryker instruments，USA)進行椎間盤髓核的旋切，旋切器推進速率為0.5～1 mm/s，每個椎間盤旋切出約1.0 g椎間盤髓核組織，將椎間盤髓核組織置于無菌器皿加入生理鹽水，制備成混懸液約12 mL備用。通過CT引導(dǎo)穿刺，分別注入2 mL上述混懸液于L2～3、L3～4、L4～5雙側(cè)椎間孔硬膜外腔神經(jīng)根周圍，并避免刺傷神經(jīng)根，從而建立神經(jīng)根非壓迫性損傷模型。造模完成后，在造模術(shù)后當(dāng)天及第2、4天肌注青霉素G 33000 U/kg，預(yù)防術(shù)后感染。將實驗動物繼續(xù)常規(guī)飼養(yǎng)，密切觀察其一般情況及活動時肢體情況。

1.3.2 微創(chuàng)介入治療 造模成功14天后，將實驗豬隨機分為實驗組(消炎液治療)與對照組(生理鹽水治療)。同樣用上述方法麻醉、磁共振檢查及CT導(dǎo)向下穿刺實驗動物L(fēng)2～3、L3～4、L4～5雙側(cè)椎間孔。在實驗組動物每根神經(jīng)根周圍注射消炎液10 mL(曲安奈德120 mg、利多卡因30 mL、維生素B12 6 mg制成溶液共約72 mL)，在對照組動物每根神經(jīng)根周圍注射生理鹽水10 mL。同樣用造模術(shù)后的方案肌注青霉素G預(yù)防術(shù)后感染及密切觀察動物情況。

1.4 神經(jīng)根組織免疫組化檢查

1.4.1 標(biāo)本取材 兩組隨機各取1只試驗豬于相應(yīng)取材時間點(治療后3、7、14 d)再次按前述方法麻醉及磁共振檢查后，麻醉狀態(tài)下處死并解剖出L2～3、L3～4、L4～5雙側(cè)神經(jīng)根近段，然后置于4%多聚甲醛固定液并標(biāo)記。取材方法：持續(xù)麻醉狀態(tài)下，采用仰臥位，將實驗動物固定于手術(shù)臺上，沿左側(cè)胸骨旁線剪開胸壁，充分暴露心臟并鈍行分離心包，于心尖向左心室內(nèi)快速注射100 mL生理鹽水，然后剪開右心耳，再次于心尖快速注射生理鹽水100 mL及10%中性甲醛固定液200 mL。使甲醛固定液通過血液循環(huán)快速到達(dá)神經(jīng)根周圍。待動物呼吸心跳停止后，將動物取俯臥位，逐層剝離腰背部皮膚、肌肉并取去T11～L5節(jié)段脊柱，再用骨鉗咬斷L1～5雙側(cè)椎板，從后方打開椎管并充分暴露脊髓及雙側(cè)神經(jīng)根，分別剪取7～10 mm L2～3、3～4、4～5雙側(cè)神經(jīng)根近段，并固定、標(biāo)記送免疫組化檢查。

1.4.2 免疫組化(S-P法) ①一抗：TNF-α，兔多克隆抗體，批號：ab6671，英國abcam--艾博抗(上海)貿(mào)易有限公司。②二抗：生物素化山羊抗兔IgG(H+L)，批號：13152A11，北京中杉金橋生物有限公司。③三抗：辣根酶標(biāo)記鏈霉素卵蛋白素(HRP/A-V)，批號：13152A11，北京中杉金橋生物有限公司。④封閉用正常山羊血清，批號：13152A11，北京中杉金橋生物有限公司。⑤顯色劑：濃縮型DAB試劑盒，批號：K135925C，北京中杉金橋生物有限公司。

1.4.3 免疫組化步驟 先將載玻片防脫片處理、切片常規(guī)脫蠟至水、熱修復(fù)抗原，然后滴加山羊血清封閉液，室溫20 min；再滴加稀釋的一抗(1：200)，4℃過夜；再滴加二抗，37℃ 30 min；再滴加三抗，37℃ 30 min。經(jīng)DAB室溫顯色2 min，蒸餾水洗滌后蘇木素輕度復(fù)染，脫水，透明，中性樹膠封片。

1.4.4 免疫組化圖像采集及評價 采用BA200Digital數(shù)碼三目攝像顯微攝像系統(tǒng)對切片進行400倍圖像采集。神經(jīng)根TNF-α蛋白的平均光密度測定使用Image-Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析 運用IBM SPSS Statistics Ver.21統(tǒng)計軟件，采用一維組間方差分析(one way ANOVA)統(tǒng)計方法進行數(shù)據(jù)處理和分析。先分別比較兩組實驗動物組間及組內(nèi)造模前、治療前、治療后各時間點神經(jīng)根平均FA值的差異及變化；再分別比較兩組治療后不同時間點組內(nèi)神經(jīng)根TNF-α蛋白含量變化及相同時間點組間神經(jīng)根TNF-α蛋白含量差異。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 神經(jīng)根平均FA值

2.1.1 造模前后兩組神經(jīng)根平均FA值 造模前實驗組神經(jīng)根平均FA值為(0.476±0.150)，對照組神經(jīng)根平均FA值為(0.394±0.115)。兩組間造模前神經(jīng)根平均FA值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表1。造模后實驗組神經(jīng)根平均FA值為(0.214±0.084)，對照組神經(jīng)根平均FA值為(0.180±0.061)；兩組間造模后神經(jīng)根平均FA值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)，見表2。與造模前相比，兩組實驗對象造模后神經(jīng)根平均FA值均出現(xiàn)減小(P<0.05)。

表1 造模前兩組實驗豬神經(jīng)根平均FA值表Table 1 Average FA values of nerve roots in the two groups before modeling

表2 造模后兩組實驗豬神經(jīng)根平均FA值表Table 2 Average FA values of nerve roots in the two groups after modeling

2.1.2 治療后各時間點兩組神經(jīng)根平均FA值 與治療前(造模后)相比，實驗組治療后3、7、14 d神經(jīng)根平均FA值均升高(P<0.05)，且與造模前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；而對照組治療前后神經(jīng)根平均FA值比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后各時間點實驗組神經(jīng)根平均FA值均較對照組高(P<0.05)，見表3。

表3 治療后兩組實驗豬神經(jīng)根平均FA值表Table 3 Average FA value of nerve root in the two groups after treatment

2.2 治療后兩組各時間點神經(jīng)根TNF-α蛋白含量 與治療后3天相比，實驗組治療后7、14 d神經(jīng)根TNF-α蛋白含量降低(P<0.05)；而對照組治療后3、7、14 d神經(jīng)根TNF-α蛋白含量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；治療后7、14 d實驗組神經(jīng)根TNF-α蛋白含量均較對照組明顯降低(P<0.05)，見表4、圖1。

表4 治療后兩組實驗豬神經(jīng)根TNF-α平均光密度表Table 4 The mean optical density of TNF-α in nerve roots of the two groups after treatment

圖1 神經(jīng)根DTI測值及免疫組化圖Figure 1 DTI and immunohistochemistry of nerve roots注：A.對照組治療前FA值；B.實驗組治療前FA值；C.對照組治療后7天L4～5右側(cè)神經(jīng)根HE染色圖；D.對照組治療后7天FA值；E.實驗組治療后7天FA值；F.實驗組治療后7天L4～5右側(cè)神經(jīng)根HE染色圖

3 討論

傳統(tǒng)研究認(rèn)為腰椎神經(jīng)根性疼痛的原因是由腰椎間突出的機械壓迫導(dǎo)致的，然而近年來的研究認(rèn)為，神經(jīng)根性疼痛除了機械壓迫，還包括非壓迫性因素[1-3]。Marshall[8]首次提出化學(xué)性神經(jīng)根炎是由于纖維環(huán)破裂和椎間盤液沿神經(jīng)根鞘擴散而引起的神經(jīng)根炎癥。Sun等[9]進一步研究認(rèn)為椎間盤髓核屬于無血液供應(yīng)組織，獨立于人體免疫系統(tǒng)之外，在體內(nèi)具有免疫原性，椎間盤突出患者中，由于纖維環(huán)斷裂髓核組織突出于椎管內(nèi)，從而暴露于免疫系統(tǒng)中可導(dǎo)致自身免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致化學(xué)性炎癥。Peng等[10]通過非壓迫性神經(jīng)根痛的臨床病例證實，化學(xué)性神經(jīng)根炎所致臨床病理疼痛現(xiàn)象存在。因此影像檢查中突出的椎間盤未壓迫神經(jīng)根，而臨床出現(xiàn)神經(jīng)病理性疼痛，神經(jīng)根組織免疫組化檢查中也出現(xiàn)炎性反應(yīng)及炎癥因子即能診斷該疾病。同時，有研究表明，髓核組織本身就含有多種致炎因子，包括TNF-α、IL-1a等，其中TNF-α在炎癥的發(fā)生過程中扮演重要作用，神經(jīng)病理性疼痛與其濃度高低呈正相關(guān)[11-12]。神經(jīng)根受壓的無疼痛患者神經(jīng)根FA值反而無變化[13]，表明神經(jīng)根FA值可能是闡明神經(jīng)根病病理機制的潛在工具。本研究以神經(jīng)根中TNF-α蛋白含量為參考標(biāo)準(zhǔn)，以反映神經(jīng)根炎治療過程中的轉(zhuǎn)歸及與神經(jīng)根平均FA值的相對應(yīng)關(guān)系，從而評價非壓迫性腰椎神經(jīng)根炎消炎液微創(chuàng)治療的療效。

Balbi等[14]研究表明腰椎椎間盤突出患者受壓患側(cè)神經(jīng)根較健側(cè)及健康志愿者相對應(yīng)節(jié)段神經(jīng)根FA值減低。本研究同樣發(fā)現(xiàn)造模后FA值較減低，推測其原因可能是由于神經(jīng)根暴露于髓核組織中發(fā)生自身免疫性炎癥、化學(xué)性炎癥，神經(jīng)發(fā)生沃勒變性，神經(jīng)髓鞘及外周多層膜結(jié)構(gòu)的完整性被破壞、通透性增加，水分子在神經(jīng)橫軸方向擴散運動增加，神經(jīng)根的各向同性增加，各向異性減小，因此FA值降低[15]；治療后神經(jīng)的遠(yuǎn)端軸索再生、新生的軸索密度增加，水分子在神經(jīng)縱行方向擴散運動增加，F(xiàn)A值也隨之升高[16]。

細(xì)胞因子是一類由多種細(xì)胞產(chǎn)生并分泌到胞外的糖蛋白分子，具有多種生物學(xué)功能，其中TNF-α在根性神經(jīng)痛方面發(fā)揮重要作用。神經(jīng)根發(fā)生自身免疫性炎癥及化學(xué)性炎癥后，各種炎性細(xì)胞因子及其他炎癥介質(zhì)的參與，導(dǎo)致神經(jīng)根TNF-α蛋白含量增高[17]。本實驗中用自體髓核造模誘發(fā)神經(jīng)根炎后，將消炎液注入神經(jīng)根周圍治療，主要治療藥物是曲安奈德，為腎上腺皮質(zhì)激素類藥，該類藥品用于治療腰椎神經(jīng)根性疼痛得到廣泛認(rèn)可，其機制可能為減少前列腺素的合成，維持細(xì)胞膜的穩(wěn)定，從而抑制痛覺C纖維的傳導(dǎo)沖動[18]；同時也有助于神經(jīng)根損傷的修復(fù)，通過調(diào)節(jié)合成bFGF，從而促進神經(jīng)根功能的恢復(fù)，還能降低毛細(xì)血管的通透性，減輕水腫，抑制炎癥浸潤，從而使 TNF-α的合成和釋放減少[19]。有研究證實神經(jīng)根鞘內(nèi)外局部使用糖皮質(zhì)激素治療后血液中TNF-α明顯降低[20]；而且曲安奈德也能有效治療神經(jīng)損傷后的根性疼痛[21]。

有研究表明神經(jīng)根FA值與TNF-α平均光密度存在負(fù)相關(guān)關(guān)系[22]。Eguchi 等[23]通過研究腰椎間盤突出癥患者發(fā)現(xiàn)受壓迫神經(jīng)FA均值明顯低于未損傷神經(jīng)，術(shù)后患處神經(jīng)根FA值顯著升高，且FA值和神經(jīng)癥狀的嚴(yán)重程度之間存在很強的相關(guān)性。本實驗研究結(jié)果也印證了消炎液治療后神經(jīng)根TNF-α蛋白含量均較對照組明顯降低，神經(jīng)根的FA值也較治療前及對照組升高，且與造模前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這提示擴散張量成像可用于非壓迫性椎間盤突出所致神經(jīng)根自身免疫性炎癥、化學(xué)性炎癥以及治療后炎癥轉(zhuǎn)歸的評估[24]，并能提供定量信息以評估神經(jīng)根完整性及病理生理改變[25]，同時腰椎非壓迫性神經(jīng)根炎能在此種配伍的消炎液微創(chuàng)治療中獲益。

本研究的不足之處：①僅對每只實驗動物相鄰節(jié)段的多組神經(jīng)根同時進行實驗，可能會造成相互干擾，對實驗數(shù)據(jù)造成影響。②實驗動物樣本量較少，且部分神經(jīng)根為同一實驗對象，統(tǒng)計結(jié)果可能會有偏差。③FA值ROI的放置可能會受人為的測量誤差影響。④只使用一種消炎液的配伍，未對其他配伍的藥物進行比較。⑤本研究為動物實驗研究，未對實驗對象痛覺、行動能力等主觀治療轉(zhuǎn)歸進行評估。

4 結(jié)論

本實驗結(jié)果表明，CT導(dǎo)向下消炎液微創(chuàng)治療腰椎非壓迫性神經(jīng)根炎有效，磁共振擴散張量成像能在不同時間點定量監(jiān)測神經(jīng)根炎的轉(zhuǎn)歸及評價手術(shù)治療療效。