董躍華 王貴剛 楊燕君 魏玉磊 高永山 姜偉華

(河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院胸心外科，河北 張家口 075000)

在我國惡性腫瘤發(fā)病及致死率中，肺癌居首位[1]。非小細(xì)胞肺癌(Non-small-cell lung carcinoma，NSCLC )則是肺癌中主要類型。雖手術(shù)、放化療等治療方式已應(yīng)用多年，但整體療效不盡理想，且多數(shù)患者在初診之時(shí)已錯(cuò)過治療最佳時(shí)機(jī)[2-5]。隨著人們對(duì)癌基因依賴研究不斷深入，EGFR基因靶向療法以其良好的藥物響應(yīng)率及低副作用等特點(diǎn)逐漸成為NSCLC主要治療手段之一[6]。因此，對(duì)致癌基因的研究，尤其對(duì)致癌基因與病理分型及預(yù)后關(guān)系的探討，有助于在治療過程中篩選優(yōu)勢(shì)人群[7-9]。Runx3是TGF-β信號(hào)通路中重要的調(diào)節(jié)因子之一，其表達(dá)缺失將限制Smad蛋白功能，干擾TGF-β信號(hào)通路的生物活性，導(dǎo)致腫瘤發(fā)生[10]。間質(zhì)上皮轉(zhuǎn)化因子(Met)及下游信號(hào)通路的異常激活介導(dǎo)肺癌等多種腫瘤的演進(jìn)，且Met基因擴(kuò)增與EGFR敏感性突變患者耐藥性產(chǎn)生密切相關(guān)[11]。研究[12]顯示，TGF-β與HGF/c-Met信號(hào)通路在癌癥發(fā)展過程中存在負(fù)相關(guān)性?；贓GFR、Runx3、Met三者在NSCLC發(fā)病過程中的作用及聯(lián)系，本研究探討NSCLC患者EGFR、Runx3和Met突變情況與其病理分型、TNM分期及生存期的相關(guān)性，旨在為NSCLC的個(gè)體化靶向治療提供更多臨床依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014年2月～2016年8月我院經(jīng)手術(shù)途徑留取新鮮腫瘤標(biāo)本96例。入選標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)后病理確診為NSCLC。②亞裔患者。③未接受過分子靶向藥物、放療及化療藥物治療。④既往無身體其他部位惡性腫瘤病史。其中男性63例，女性33例；60歲以下41例，60歲及以上55例；吸煙32例，不吸煙64例。按照國際抗癌聯(lián)盟(UICC)(2016)分期標(biāo)準(zhǔn)[13]，Ⅰ期23例，Ⅱ期22例，Ⅲ期29例，Ⅳ期22 例。以2012年WHO制定的肺、胸膜、胸腺和心臟腫瘤病理學(xué)和遺傳學(xué)中對(duì)肺癌的組織學(xué)分型標(biāo)準(zhǔn)[14]，其中腺鱗癌3例，腺癌26例，鱗癌67例。本研究所有程序均經(jīng)醫(yī)院的醫(yī)學(xué)倫理委員審核批準(zhǔn)(BFFY20140027)。本研究入選患者對(duì)研究過程知情，且自愿簽署知情同意書。

1.2 儀器與試劑 儀器：LightCycler?96全自動(dòng)熒光定量PCR系統(tǒng)(Roche公司，96 通量)，切片機(jī)(德國萊卡公司，2135)，臺(tái)式高速度冷凍離心機(jī)(德國ELRCRON公司)，37℃恒溫培養(yǎng)箱(上海天呈科技有限公司)。試劑：免疫組化S-P試劑盒、胃蛋白酶、DAB顯色試劑盒(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司)，鼠抗人EGFR單克隆抗體、兔抗人Runx3單克隆抗體、鼠抗人Met單克隆抗體(上海基爾頓生物科技有限公司)，Trizol試劑(invitrogen公司)，多聚賴氨酸(Sigma公司)。

1.3 DNA 提取及基因突變檢測(cè) 將經(jīng)10%中性福爾馬林固定的樣本進(jìn)行常規(guī)HE染色，篩選出>50%腫瘤成分的瘤組織蠟塊切片。腫瘤組織切片后置于離心管保存，一抗孵育前經(jīng)檸檬酸緩沖液(0.01 mol/L)進(jìn)行抗原修復(fù)，采用免疫組化法測(cè)定EGFR、Runx3和Met表達(dá)。同時(shí)，對(duì)制備好的組織切片進(jìn)行DNA提取，采用Nanodrop one測(cè)定DNA濃度，并以A260/A280值在1.8～2.0為有效值判斷純度。采用人多基因突變檢測(cè)通用試劑盒進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用二代測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。所有檢測(cè)依據(jù)試劑說明書及實(shí)驗(yàn)室規(guī)范進(jìn)行操作。

1.4 隨訪 以電話或門診形式進(jìn)行隨訪，隨訪時(shí)間從病例確診至2019年12月31日。隨訪期間記錄患者后續(xù)治療、腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等資料，并對(duì)患者的無進(jìn)展生存時(shí)間進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

2 結(jié)果

2.1 EGFR、Runx3和Met表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系 EGFR表達(dá)與患者年齡、性別、吸煙史、分期、組織學(xué)分型、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間、病理分化均無關(guān)(P>0.05)；Runx3表達(dá)與分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，與年齡、性別、吸煙史、組織學(xué)分型、生存時(shí)間、病理分化均無關(guān)(P>0.05)；Met表達(dá)與分期、組織學(xué)分型有關(guān)(P<0.05)，與患者年齡、性別、吸煙史、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間、病理分化均無關(guān)(P>0.05)，見表1。

表1 EGFR、Runx3和Met表達(dá)與臨床病理特征關(guān)系Table 1 Relationship between the expressions of EGFR，Runx3，Met and clinicopathological features of disease

2.2 EGFR、Runx3和Met突變情況與臨床病理特征的相關(guān)性 EGFR突變與患者組織學(xué)分型、生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)，與分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、病理分化無關(guān)(P>0.05)；Runx3突變與患者組織學(xué)分型、分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)，與病理分化無關(guān)(P>0.05)；Met突變情況與患者組織學(xué)分型、分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間、病理分化均無關(guān)(P>0.05)。見表2。

表2 EGFR、Runx3和Met突變情況與臨床病理特征的相關(guān)性Table 2 Relationship between the mutations of EGFR，Runx3，Met and clinicopathological features of disease

2.3 EGFR、Runx3和Met表達(dá)和突變情況與患者生存時(shí)間的相關(guān)性 EGFR突變與Runx3突變與患者生存時(shí)間呈正相關(guān)(P<0.05)；Runx3的表達(dá)及突變與患者復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)(P<0.05)，見表3。

表3 EGFR、Runx3和Met表達(dá)和突變情況與患者生存時(shí)間的相關(guān)性Table 3 Correlation between EGFR，Runx3 and Met expression and mutation status and patient survival time

3 討論

近年來，我國肺癌發(fā)病率、致死率逐年攀升[15]。自1991年起，我國的肺癌死亡率躍居各類癌癥之首，NSCLC占肺癌病理類型的80.85%。盡管NSCLC治療方法取得了不少進(jìn)展，但NSCLC總的5年生存率仍低于15%[16]。高特異性、高療效、低毒性的分子靶向藥物能夠?qū)δ[瘤細(xì)胞特定靶點(diǎn)起效，成為腫瘤精準(zhǔn)醫(yī)療的一大利器。以EGFR為分子靶標(biāo)開發(fā)的EGFR酪氨酸激酶抑制劑是目前NSCLC治療中應(yīng)用最廣泛、最典型的分子靶標(biāo)藥物[17]。因此，深入研究致癌基因與病理分型及預(yù)后關(guān)系，對(duì)在NSCLC治療過程中篩選優(yōu)勢(shì)人群頗有益處。

鑒于EGFR在NSCLC發(fā)生、發(fā)展中的作用，本研究探討了EGFR表達(dá)、突變與NSCLC病理分化、TNM分期、生存期等臨床病理特征的關(guān)系。結(jié)果顯示，EGFR表達(dá)在不同病理分化、TNM分期、生存期等臨床病理特征間無差異，但EGFR突變與組織學(xué)分型有關(guān)(P<0.05)，該結(jié)果與汪園園等[18]的研究一致。有學(xué)者[19]認(rèn)為EGFR酪氨酸激酶編碼區(qū)基因突變是EGFR分子靶向藥物奏效的必要條件之一，推測(cè)亞裔女性、無吸煙史、腺癌患對(duì)EGFR酪氨酸激酶抑制劑可能有較高的藥物敏感反應(yīng)，該推測(cè)在Seow等[20]研究中得以證實(shí)。

Runx3為重要的新進(jìn)抑癌基因，以往研究[21]顯示，Runx3表達(dá)程度與肺癌患者生存率呈正相關(guān)，且Runx3低表達(dá)的患者肺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移率高、癌細(xì)胞多為低分化。本研究結(jié)果顯示，Runx3表達(dá)與分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)，提示Runx3的表達(dá)在NSCLC的發(fā)生、發(fā)展中可能起重要作用。此外，本研究結(jié)果表明，Runx3突變與患者組織學(xué)分型、分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間有關(guān)(P<0.05)，60歲以下、腺癌患者Runx3突變率較高，與以往報(bào)道[22]相符。Tang等[23]研究則指出NSCLC的Ⅲ期患者比Ⅰ、Ⅱ期患者更容易發(fā)生Runx3突變，與本研究結(jié)果相一致。同時(shí)，本文結(jié)果表明，Runx3突變率在出現(xiàn)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存期低于三年患者中更高，證實(shí)了Runx3突變是預(yù)后不良的重要原因。

Met基因擴(kuò)增是EGFR酪氨酸激酶抑制劑獲得性耐藥產(chǎn)生機(jī)制之一，此外，Met所介導(dǎo)的HGF/c-Met信號(hào)通路與Runx3參與的TGF-β通路在腫瘤發(fā)展過程中存在負(fù)相關(guān)性[24]。因此，Met基因在NSCLC發(fā)生發(fā)展及預(yù)后中更為關(guān)鍵。本研究發(fā)現(xiàn)，Met表達(dá)與分期、組織學(xué)分型有關(guān)(P<0.05)。Li等[25]研究表明，Met基因mRNA表達(dá)水平在腺癌患者中更高，且陽性率與患者TNM分期有關(guān)，與本研究研究結(jié)果相一致。目前對(duì)于Met基因突變與臨床病理特征之間是否擁有聯(lián)系尚無定論。本研究中Met基因突變率為2.6%～6.5%，與以往研究在NSCLC中的總發(fā)生率為3%～6%相符[26]。本文結(jié)果顯示，Met突變與病理分型、生存期等無關(guān)，可能由于Met總突變發(fā)生率較低，本文病例較少所致。因此，有關(guān)Met基因突變與臨床病理特征的影響有待后續(xù)進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

NSCLC患者中EGFR突變可與Runx3、Met 突變共存，Met 突變率較低。EGFR突變與患者組織學(xué)分型、生存時(shí)間有關(guān)；Runx3突變與患者組織學(xué)分型、分期、復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、生存時(shí)間有關(guān)。因此EGFR與Runx3的突變有望成為NSCLC患者組織學(xué)分型、判斷預(yù)后的潛在指標(biāo)，為實(shí)施精準(zhǔn)治療提供理論支撐。