禤淑霞 謝小雷 陳晨 劉艷枚 林金端 李付廣 潘意珍 湯巧敏 尹衛(wèi)國

1997年Lo 等［1］發(fā)現(xiàn)孕婦外周血中存在胎兒游離DNA（cell?free fetal DNA，cffDNA），2008年提出應用高通量測序（Next?generation Sequencing，NGS）技術對cffDNA 進行檢測，經生物信息學分析評估胎兒患常見染色體非整倍體風險的方法［2］，即無創(chuàng)產前檢測技術（Non?invasive prenatal test?ing，NIPT）。2012年，美國婦產科醫(yī)師學會（Amer?ican College of Obstetricians and Gyencologists，ACOG）聲明NIPT 可用于胎兒罹患染色體非整倍體疾病的高風險人群［3］，這是國外最早明確NIPT用途的指南。在國內，2016年國家衛(wèi)健委明確將NIPT 檢測技術作為介于血清學篩查和羊水穿刺染色體核型分析之間的二次篩查手段，是對常規(guī)產前篩查和產前診斷技術的有益補充［4］。

隨著NIPT 的深入研究及技術優(yōu)化，國內外對NIPT 的臨床應用共識也在不斷改變、調整、細化。NIPT 應用人群從指定的唐篩高風險人群擴展到普通人群，而慎用人群中的雙胎妊娠也更改為適用人群［5?6］。但隨之而來的問題也浮現(xiàn)，例如NIPT 能否取代血清學篩查作為一線篩查技術，是否應用于性染色體異常（Sex Chromosome Aneuploidies，SCA）以及罕見染色體非整倍體（Rare autosomal trisomies，RATs）篩查等，甚至存在NIPT 可以代替產前診斷的誤解。因此，如何更好地將NIPT 應用于不同人群的產前篩查，降低畸形出生率，是每一位產前診斷工作者面臨的挑戰(zhàn)。

本研究通過分析NIPT 檢測結果，結合NIPT高風險孕婦的羊水細胞核型分析，對NIPT 低風險人群進行產前及產后隨訪，評價NIPT 并技術對不同染色體異常的陽性預測值（PPV），以及不同臨床指征中的陽性檢出率，評價NIPT 在產前篩查中的應用價值。

1 材料與方法

1.1 研究對象

2017年10月至2021年6月在清遠市人民醫(yī)院行NIPT 檢測的孕婦6 535 例，納入標準：孕周12周以上，單雙胎，因臨床或個人要求行NIPT 在研究截止時已得知妊娠結局。排除標準：曾有染色體異常分娩史；夫妻一方有明確染色體疾?。辉袐D一年內接受過異體輸血；移植手術；細胞治療或接受過免疫治療等可能對高通量測序結果造成干擾的；胎兒B 超懷疑有異常的；各種基因病的高風險人群［4］。納入的例數(shù)中，6 446 例為單胎妊娠，89 例為雙胎妊娠；6 403 例為自然受孕，132 例為輔助生殖受孕。孕婦年齡平均（30.00±4.94）歲；孕周平均（17.20±4.19）周。所有受檢者均經過充分咨詢，自愿選擇NIPT 并簽署知情同意書。本研究經過本院倫理委員會審批通過。

1.1.1 臨床指征分組

將所有孕婦按照不同指征進行分組［7］。第一組：①高齡組，即孕婦預產年齡≥35 歲。②低齡組，孕婦產齡<35 歲；第二組：①唐篩高風險組：經血清學篩查，21 三體的截斷值≤270，18 三體的截斷值≤350。②唐篩臨界風險組：經血清學唐氏篩查，21 三體270<截斷值≤1 000，18 三體350<截斷值≤1 000。③唐篩單指標異常組：經血清學三聯(lián)或四聯(lián)篩查，AFP、β?HCG、uE3、PAPPA（四者任一）的MoM 值偏高或偏低；第三組：①超聲軟指標異常組：經B 超檢測發(fā)現(xiàn)NT 增厚或臨界性增厚、脈絡叢囊腫、鼻骨偏短、胎兒生長受限、側腦室增寬、心室強回聲光點、腸回聲增強等情況。②不良生育史組：曾有不良生育情況的人群。③無臨床指征但要求NIPT 組：無臨床指征，但孕婦自己要求做NIPT 檢測的人群，其中包括未行血清學篩查、輔助生殖（IVF）及雙胎人群。

1.2 試劑及儀器

胎兒染色體非整倍體（T13/T18/T21）檢測試劑盒（100 人份/盒）購自杭州貝瑞和康基因診斷技術有限公司（國械注準：20153400461）。主要儀器包括貝瑞和康Illumina NextSeq CN500 高通量測序儀。核型分析采用以色列BI 培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞，使用ZEISS Axio Image.Z2 全自動顯微鏡進行掃片分析。

1.3 檢測方法

1.3.1 NIPT 檢測

以血漿游離DNA 采血管（Cell Free DNA BCT）采集孕婦外周血8～10 mL，4 h 內分離血漿。取1.2 mL 血漿提取胎兒游離DNA、構建文庫、定量、高通量測序及生物信息學分析，計算每條染色體的Z值；當Z值≥3 為三體高風險，當Z值<3 為三體低風險。生物信息學分析由北京貝瑞和康基因有限公司完成。

1.3.2 羊水細胞染色體核型分析

對于NIPT 檢測提示胎兒存在21 三體綜合征（21?trismy sydrome，T21）、18 三體綜合征（18?tris?my sydrome，T18）、13 三體綜合征（13?trismy sy?drome，T13）及性染色體異常的高風險孕婦，建議進行羊水穿刺。取羊水細胞，均分為2 管，1 800 r/min離心12 min 后取細胞懸液1.5 mL，采用平行雙線分別接種，37℃培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)7 d，經換液、轉種，約10 d 左右根據(jù)細胞生長情況收取細胞。以秋水仙堿終止羊水細胞生長、刮取細胞、低滲、預固定、固定、再固定、滴片、烤片、胰酶消化及Giem?sa 染色制備羊水染色體片，以ZEISS Axio Image.Z2 掃片。每個標本至少計算30 個分裂相，分析5個完整核型。

1.4 追蹤隨訪

跟蹤隨訪高風險孕婦的妊娠結局；對低風險孕婦，進行產前產后隨訪，判斷有無其他異常情況或假陰性的情況出現(xiàn)，以分娩后無異常為陰性。

1.5 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 22.0 軟件進行統(tǒng)計學分析；計量資料采用（±s）表示，計數(shù)資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗。P<0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 NIPT 檢測結果

6 535例孕婦中共有88 例NIPT 高風險，檢出率為1.35%。見表1。

表1 NIPT 篩查胎兒染色體非整倍體的檢測結果［n（%）］Table 1 Detection results of fetal chromosome aneuploidy screened by NIPT［n（%）］

2.2 不同臨床指征的檢測率對比

各組間的陽性檢出率，高齡組和低齡組比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；唐篩高風險和唐篩臨界風險及單指標異常比較，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；不良生育史和超聲軟指標及要求NIPT 組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。見表2。

表2 不同臨床指征的NIPT 檢測情況比較Table 2 Comparison of NIPT detection of different clinical indications

2.3 隨訪情況

所有經羊水細胞核型確診者中，除1 例47，XYY 選擇繼續(xù)妊娠且分娩后新生兒無明顯異常，其余均選擇終止妊娠；確診為正常核型的孕婦繼續(xù)妊娠至分娩，其中2 例NIPT 提示SCA 但核型正常者，分娩后孩子分別為外耳畸形（隱耳）、卵圓孔未閉，其余均正常。NIPT 低風險孕婦的后續(xù)產檢無異常，新生兒出生后無異常，未見假陰性。

3 討論

本研究分析了6 535 例孕婦外周血樣本，NIPT提示高風險的有88 例，檢出率為1.35%，與文獻報道（1.41%）相符［8］。其中68 例經羊水細胞分析，21 三體、18 三體、13 三體的PPV 分別為72%、83.3%、0%，低于相關國外報道（99.17%，98.24%，100%）［9］，但與國內報道的結果相近（84.21%，75%，0%）［10］。分析其原因，一方面，本研究中假陽性病例的的Z 值都處于［?6，6］之間，其中［?5，5］之間的有8 例。研究表明NIPT 真實性與Z 值的大小相關，Z 值越大，胎兒染色體非整倍體的風險越大［11］。另一方面，假陽性與孕婦自身因素如惡性腫瘤、染色體變異、拷貝數(shù)變異、母體嵌合，以及雙胎消失綜合征、胎盤嵌合等因素有關［12?13］。此外，檢出的例數(shù)較少也可能造成數(shù)據(jù)差異，特別是13 三體只檢出3 例。

SCA 的PPV 為40%，對于45，X 的檢出率較低（3/10），結果與國內外報道的文獻結果（33.3%～47%）有較高的一致性［10，14］。性染色體較常規(guī)染色體的PPV 低，可能與GC 含量的偏向性有關，可通過改進染色體內標參照方法、分析胎兒特異性甲基化DNA 比例差異，從而修正GC 含量，減小變異系數(shù)，進而提高性染色體檢出率［15］。

RTAs 的PPV 約為7.14%（1/14），與文獻報道（9.38%）接近［16］。RTAs 的致病性多為不明確，可能與胎盤嵌合或單親二倍體有關［17］。因其檢測的有效性差及致病性的不明確，在實際應用中，應根據(jù)以下的原則進行補充報告：①該變異有明確的致病性，有相關報道及處理方案；②對病人進行充分的遺傳咨詢，以免造成孕婦不必要的心理負擔及增加穿刺率甚至引產率。經隨訪未發(fā)現(xiàn)假陰性。假陰性主要是由于cffDNA 濃度過低（<4%）［13，18］，在實際應用中可通過加強質控、優(yōu)化NIPT 管理流程及技術［19?21］，加強孕期各指標的全流程監(jiān)控，降低假陰性的風險。

高齡組、唐篩高風險組的PPV 和其他分組比較，差異有統(tǒng)計學意義。研究表明［22?23］，高齡產婦由于卵細胞質量下降，生殖功能減退、生殖細胞或受精卵易發(fā)生染色體畸變或不分離等原因，導致胎兒染色體異常的發(fā)生率較高，特別是21?三體的檢出率明顯增高（35.48%～45.20%）。唐篩高風險組的PPV 為1.46%，檢出的9 例中只有5 例確診，若以NIPT 為二線篩查，可大幅減少羊水穿刺的案例，避免因入侵性檢測（約0.4～1%的概率）造成的流產［24］。經超聲檢測異常的孕婦，聯(lián)合NIPT 檢測，可提高胎兒染色體異常的檢出率［25］。值得注意的是，NIPT 不能檢測染色體結構異常，當NIPT 為低風險但超聲檢查為結構異常時，建議孕婦行進一步的檢查或產前診斷［4］。目前也有關于NIPT 雙胎妊娠和IVF 人群的應用研究［26］，其檢出率也能達到70%～80%，但仍需解決cffDNA 中位值較低，取樣失敗率較高等問題［27?28］。

綜上所述，NIPT 可檢測全部染色體非整倍體，提高了檢出率，既可作為減少侵入性的二次產前篩查，也可作為一線的產前篩查方法。但由于NIPT 存在假陽性及假陰性的情況，13號染色體的PPV較低，性染色體異常及其他染色體異常的檢出也有待完善及優(yōu)化。高齡及唐篩高風險人群患染色體異常疾病的風險升高，應重點關注NIPT 在此類人群中的應用。NIPT 高風險的孕婦仍需要核型分析或基因芯片分析，不能作為產前診斷的確認方法。臨床應用中應根據(jù)實際情況，多種產前篩查方法聯(lián)合應用，有助于及早發(fā)現(xiàn)罹患染色體病的胎兒，降低出生缺陷率。