孔愛華，艾旭光，王德國

(1.菏澤定陶區(qū)人民醫(yī)院，山東 菏澤 274100；2.許昌學院 食品與藥學院；河南省食品安全生物標識快檢技術重點實驗室，河南 許昌 461000)

人乳頭瘤病毒(HPV)是乳多空病毒科的球形DNA病毒，能夠引起宮頸癌[1]，因此快速檢測并診治HPV就至關重要.目前常用的聚合酶鏈式反應(PCR)方法，需要熱循環(huán)儀，不適合基層篩查[2].而梯型熔解溫度等溫擴增(LMTIA)是一種新型核酸等溫擴增技術[3]，通過借鑒PCR技術[2]、環(huán)介導等溫擴增(LAMP)[4]、滾環(huán)擴增(RCA)[5]與交叉引物擴增(CPA)[6]等技術的反應機理，利用引物與靶序列的熔解溫度(Tm)差實現(xiàn)了聚合酶鏈式反應的等溫反應.借鑒環(huán)介導等溫擴增的引物設計方法，通過反向引物可以將PCR反應時間由1.5 h縮短到25 min以內.梯型熔解溫度等溫擴增技術改變了人們三十年來對PCR反應的認知，打破基層部門使用聚合酶鏈式反應技術必須采購熱循環(huán)儀的門檻[7]，解決了現(xiàn)有核酸等溫擴增技術存在的反應時間長、非特異性擴增等缺點,具有反應機理簡單、引物設計簡單、反應時間短、特異性強、靈敏度高、對靶序列長度要求低、適用范圍廣等優(yōu)點[8].因此探究LMTIA方法檢測高危型HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58核酸的可行性，為適于基層的高危型HPV篩查提供新思路.

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

材料試劑：10×LMTIA反應液(200 mmol·L-1Tris-HCl，pH 8.8，100 mmol·L-1KCl，100 mmol·L-1(NH4)2SO4，60 mmol·L-1MgSO4,1% Triton X-100，3.2 U Bst DNA polymerase μL-1)，德歌生物技術(山東)有限公司；dNTP(10 mmoL·L-1)，通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司；DEPC水(500 mL)，生工生物工程(上海)股份有限公司；SYBR GreenI熒光染料，賽默飛世爾科技.

儀器：Eppendorf移液槍，德國艾本德股份公司；Mixer-3000s渦旋混勻儀，杭州茂豐儀器有限公司；PGspin(PRF CGF)離心機，寧波拓普森科學儀器有限公司；1-14K高速冷凍離心機，德國 SIGMA公司；Gentier 96E/96R全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)，西安天隆科技有限公司；NanoDrop One/OneCN微量核酸蛋白濃度測定儀，美國賽默菲世爾公司.

1.2 試驗方法

1.2.1 靶序列篩選

根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫中HPV16(登錄號：FJ006723)、HPV18(登錄號：AY262282)、HPV35(登錄號：HQ537722)、HPV39(登錄號：KC470249)、HPV45(登錄號：EF202162)、HPV51(登錄號：KU298904)、HPV52(登錄號：AB819274)、HPV56(登錄號：EF177181)和HPV58(登錄號：AB819276)的基因組，通過BLAST在線比對軟件選取保守序列，并使用Oligo 7軟件(美國Molecular Biology Insights有限公司)，選取LMTIA方法所要求的溶解溫度曲線呈人字梯型、半人字梯型、直梯型的靶序列[3]，引物序列如表1所示.并且這些靶序列滿足LMTIA方法的另外兩個要求：GC含量為40%～80%；序列特異性高.

表1 高危型HPV病毒的靶序列篩選與LMTIA引物設計

1.2.2 LMTIA引物設計

使用在線軟件Primer3Plus(http://www.primer3plus.com/cgi-bin/dev/primer3plus.cgi)設計LMTIA引物．將Tm值范圍設置為59～63 ℃，引物長度設置為18～25 nt，設計一對外引物P1和D1；將Tm值范圍設置為35～85 ℃，引物長度設置為12～16 nt，設計一對外引物P2和D2.將P2引物的反向序列與P1引物通過四個堿基T連接成為引物P，將D2引物的反向序列與D1引物通過四個堿基T連接成為引物D，引物P和引物D作為LMTIA擴增引物[3]，HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58的LMTIA檢測引物序列如表1所示.

1.2.3 靶序列合成與克隆

合成表1中HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58的LMTIA檢測靶序列，并將合成靶序列克隆到pUC57載體上，基因序列合成與克隆委托通用生物系統(tǒng)(安徽)有限公司完成，將含有靶序列的pUC57載體作為模板進行溫度優(yōu)化、穩(wěn)定性與靈敏度測試.

1.2.4 溫度優(yōu)化

用10 μL的反應體系進行LMTIA反應溫度優(yōu)化，反應體系為：1.3 μmol的引物P和引物D，1.0 mmol的dNTP，1×LMTIA反應液(20 mmol Tris-HCl，pH 8.8，10 mmol KCl，10 mmol (NH4)2SO4，6 mmol MgSO4，0.1% Triton X-100，0.32 U Bst DNA polymerase μL-1)，1× SYBR GreenI，1pg含靶序列的pUC57載體模板，加ddH2O至10 μL，然后加20 μL的液體石蠟以防止氣溶膠污染[3].將Gentier 96E/96R全自動醫(yī)用PCR分析系統(tǒng)的反應溫度設置分別為49、50、51、52、53、54、55、56、57、58 ℃，加熱1 h.

1.2.5 LMTIA檢測方法穩(wěn)定性測試

采用上述10 μL的反應體系和選定的最優(yōu)溫度，1 pg含靶序列的pUC57載體模板為陽性對照，ddH2O為陰性對照，通過4個陽性對照和4個陰性對照測試高危HPV病毒LMTIA檢測方法的穩(wěn)定性[3].

1.2.6 LMTIA檢測方法靈敏度測試

將含靶序列的pUC57載體模板分別稀釋為100、10、1、0.1、0.01 fg，用上述反應體系在優(yōu)選溫度下測試所建LMTIA檢測方法的靈敏度[3].

2 結果與討論

2.1 LMTIA反應溫度優(yōu)化結果

由表2所示，HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58的LMTIA方法的最優(yōu)溫度差別較大，HPV16的最優(yōu)反應溫度為50 ℃，HPV51的最優(yōu)反應溫度為57 ℃，由此可見，溫度對LMTIA擴增效率的影響較大，因此建立理想的LMTIA檢測方法首先需要優(yōu)選溫度.

表2 高危型HPV病毒的LMTIA檢測方法的測試結果

2.2 HPV的LMTIA檢測方法的穩(wěn)定性

由表2可以看出，高危型HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58病毒LMTIA檢測方法的穩(wěn)定性測試中，所有的陽性對照均為陽性，所有的陰性對照均為陰性，說明LMTIA方法檢測HPV病毒穩(wěn)定性高，可重復性強.

2.3 HPV的LMTIA檢測方法的靈敏度

由表2所示，LMTIA方法檢測HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58的靈敏度分別為1，1，1，0.1，1，1，0.1，1，0.1 fg/reaction，相當于30～300 copies/reaction.如再加FRET熒光探針，可進一步提高靈敏度與特異性[9]，因此LMTIA方法的靈敏度高，適合用于高危型HPV病毒檢測.

3 結論

篩選高危型乳頭瘤病毒HPV16、HPV18、HPV35、HPV39、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56和HPV58基因組上呈人字梯型、半人字梯型、直梯型的特異性序列設計LMTIA引物，建立LMTIA檢測方法.結果表明，溫度對LMTIA擴增效率影響顯著，在最優(yōu)溫度下，LMTIA方法檢測高危型HPV病毒特異性基因的重復性強、靈敏度高.研究案例證實了梯型熔解溫度等溫擴增(LMTIA)反應中單鏈模板供應機理是準確的.LMTIA技術相對于LAMP技術具有性能優(yōu)勢，所以LMTIA方法對于高危型HPV病毒檢測具有廣闊的應用前景.