歐成明，趙美琦，孫銘，毛培勝

（中國農(nóng)業(yè)大學草業(yè)科技學院，草業(yè)科學北京市重點實驗室，北京 100193）

紫花苜蓿（Medicago sativa）是一種多年生豆科牧草，因為其具有抗逆性好、優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)等特點，被譽為牧草之王［1］。紫花苜蓿通過生物固氮的作用能對土壤進行改良［2］，不僅有較高的經(jīng)濟利用價值，對生態(tài)環(huán)境的保護和修復也有很大的利用價值，在我國農(nóng)業(yè)、畜牧業(yè)發(fā)展和保護生態(tài)環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用［3］，被廣泛種植在鹽堿地、灘涂地以及土壤退化地區(qū)進行土地改良和草原恢復。

鹽脅迫作為一種主要的非生物脅迫，對植物種子的萌發(fā)、植物生長的速率、植物的光合作用等大部分生理代謝過程都會造成影響［4］，尤其影響種子萌發(fā)和幼苗生長，在玉米（Zea mays）［5］、油菜（Brassica napus）［6］、燕麥（Avena sativa）［7］的研究中發(fā)現(xiàn)，當鹽濃度到達某一閾值時種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率降低，幼苗長度縮短，種子活力降低。郭湘等［8］進行了苜蓿耐鹽性研究，結果表明當NaCl濃度達到250 mmol·L-1時，胚根生長受到顯著抑制；種子萌發(fā)過程中的滲透調(diào)節(jié)能力下降，抗氧化酶活性降低，活性氧大量積累，種子萌發(fā)和幼苗生長受到明顯抑制［9］。種子包衣技術是一種能增強種子抗逆性，促進種子萌發(fā)的種子處理技術，研究發(fā)現(xiàn)用黃腐酸、胺鮮酯和微肥對苜蓿種子進行包衣處理，能有效提高出苗率［10］；用腐熟羊糞對老芒麥（Elymussibiricus）種子進行包衣處理，可以提高種子活力和幼苗的抗逆性［11］，用脫硫石膏和粉煤灰對野牛草（Buchloe dactyloides）種子進行包衣處理，可以提高野牛草種子在鹽堿地的發(fā)芽率［12］。目前，國內(nèi)外工廠的膜衣、殼衣和丸衣等包衣工藝已經(jīng)很成熟，但針對不同逆境條件促進種子萌發(fā)的丸衣技術，一直都是牧草種子加工研究與實踐的重點。

氧化脅迫是植物響應鹽脅迫的一種形式，鹽脅迫會使植物體內(nèi)活性氧（reactive oxygen species，ROS）增加，過量的ROS會對脂類物質(zhì)進行攻擊，造成細胞損傷［13］。抗壞血酸（ascorbic acid，AsA）是一種普遍存在于動植物組織中的抗氧化劑，也叫維生素C，化學名是L-蘇糖型-六-2-烯醇-1內(nèi)酯［14］。AsA是許多物質(zhì)代謝和氧化還原反應的重要參與者［15］。用AsA處理種子能有效清除種子體內(nèi)的ROS，防止細胞衰老，增強種子抗逆性，提高種子活力［16］。水楊酸（salicylic acid，SA）是一種植物內(nèi)源激素，普遍存在于植物體內(nèi)的酚酸類物質(zhì)，學名鄰羥基苯甲酸。研究表明，SA可以通過誘導逆境相關蛋白的表達等來緩解逆境脅迫對植物的影響［17］。用SA對植物葉片和種子進行處理，能提高植物對鹽脅迫、干旱脅迫、低溫脅迫的抵抗能力，提高種子的活力和幼苗成活率［18-19］。

AsA和SA提高植物耐鹽性的研究主要集中在種子引發(fā)和外源噴施，用于種子丸衣的研究較少。因此，本試驗以植物鹽脅迫影響機制為基礎，采用不同濃度的AsA和SA進行丸衣處理，通過分析NaCl脅迫下丸衣種子的萌發(fā)情況和種苗的生長變化，以期獲得具有耐鹽性能的紫花苜蓿種子丸衣配方，增強紫花苜蓿種子在鹽脅迫下的萌發(fā)能力，旨在提高鹽脅迫下紫花苜蓿播種效率，提高鹽漬土地的利用效率，為天然草地改良和人工草地建設提供技術支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗所用的紫花苜蓿種子是由酒泉大業(yè)種業(yè)有限責任公司提供的中苜1號紫花苜蓿種子（2017年收獲），種子初始含水量4.3%，千粒重2.153 g，發(fā)芽勢90%，發(fā)芽率97%，死種子1%，硬實種子2%。試驗于2018年進行。

1.2 試驗設計與處理

1.2.1NaCl脅迫濃度篩選 將紫花苜蓿未丸衣種子在不同NaCl濃度下進行紙上發(fā)芽試驗，NaCl濃度（質(zhì)量分數(shù)）梯度設置為0、0.50%、1.00%、1.25%、1.50%，每個處理重復4次。

1.2.2丸衣處理 用1、2、4、8 mmol·L-1AsA和1、5、10、20 mmol·L-1SA溶液對紫花苜蓿種子進行拌種（藥種比1∶100），然后進行丸衣處理［20］（分別記為PAA1、PAA2、PAA4、PAA8和PAS1、PAS5、PAS10、PAS20；未丸衣種子為CK1，不做拌種處理的丸衣種子記為CK2）。

1.2.3丸衣種子耐鹽性能評價 在1.2.1篩選出的NaCl濃度下，對1.2.2丸衣種子進行紙上發(fā)芽試驗，4次重復，測量并計算種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、種苗長、苗重和平均發(fā)芽時間。

1.3 試驗方法

1.3.1含水量調(diào)整 因為紫花苜蓿種子含水量太低，為使含水量達到同一水平，需要進行含水量的調(diào)整，根據(jù)樣品種子的初始含水量（4.3%），按照下述方法調(diào)整，目標含水量為10%。具體調(diào)整方法如下：考慮平衡速度，選擇KNO3飽和溶液進行水分的調(diào)整。稱取0.1 kg KNO3放入大燒杯中，加入1 L蒸餾水，充分攪拌，確保燒杯底部有結晶析出后，將溶液過夜放置，確保溶液已經(jīng)達到飽和狀態(tài)。稱取干凈飽滿的紫花苜蓿種子，質(zhì)量記為W0，計算出達到相應含水量時種子的質(zhì)量，記為W。將種子放入74μm的篩子中，貼上標簽，放入干燥器，頻繁稱取其質(zhì)量，達到要求后立即將種子密封于鋁箔袋中保存于4℃冰箱中備用。達到要求含水量的種子質(zhì)量：

式中：MC0為初始含水量；MCr為需達到的含水量；W0為初始種子質(zhì)量（g）。

1.3.2發(fā)芽試驗 參照牧草種子檢驗規(guī)程（GB/T 2930.4-2017）紫花苜蓿丸衣種子發(fā)芽標準進行紙上發(fā)芽試驗，選取紫花苜蓿丸衣種子100粒，將其放入盛有3層濾紙的11.5 cm×11.5 cm有蓋培養(yǎng)皿中，設4次重復，未丸衣種子為對照（CK）。將培養(yǎng)皿放置于光照培養(yǎng)箱（GXZ-380B-LED，寧波江南儀器廠）中，在20℃恒溫，光照8 h和黑暗16 h條件下培養(yǎng)。初次計數(shù)為第4天，末次計數(shù)為第10天。統(tǒng)計正常種苗數(shù)、不正常種苗數(shù)、新鮮未發(fā)芽數(shù)、硬實種子數(shù)和死種子數(shù)，待第10天發(fā)芽結束后，計算發(fā)芽勢、發(fā)芽率。培養(yǎng)期間每24 h統(tǒng)計種子發(fā)芽情況，以胚根突破種皮2 mm為標準，計算平均發(fā)芽時間。

式中：t為發(fā)芽時間；n為在時間t時，新發(fā)芽的種子數(shù)。

丸衣種子發(fā)芽方法同上。

1.3.3種苗生長指標測定 發(fā)芽10 d結束后，每個重復隨機選取10株種苗測量種苗長度（cm）和鮮重（g），重復4次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

采用SPSS 20.0進行二因素方差分析和單因素方差分析（ANOVA）做平均值多重比較（Duncan），顯著水平為0.05。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對紫花苜蓿未丸衣種子發(fā)芽的影響

結果表明，NaCl脅迫影響了紫花苜蓿種子的萌發(fā)，延長了平均發(fā)芽時間，降低了發(fā)芽勢和發(fā)芽率；種苗長和鮮重也顯著（P＜0.05）降低。在NaCl濃度為0.50%時，紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和種苗鮮重與CK處理差異不顯著（P＞0.05），而平均發(fā)芽時間顯著（P＜0.05）延長，種苗長顯著（P＜0.05）降低（表1）。當NaCl濃度達到1.00%時，種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率、種苗長和種苗重都顯著（P＜0.05）下降，平均發(fā)芽時間顯著（P＜0.05）延長。1.25%和1.50%濃度的NaCl顯著（P＜0.05）影響了種子發(fā)芽率（表1），發(fā)芽率分別下降到了56%和24%。因此以這兩個濃度作為鹽脅迫濃度進行丸衣處理的篩選。

表1 NaCl脅迫對紫花苜蓿種子發(fā)芽的影響Table 1 Effects of NaCl str ess on alfalfa seed ger mination

2.2 NaCl脅迫對紫花苜蓿AsA丸衣種子發(fā)芽和種苗生長的影響

用AsA對紫花苜蓿種子進行丸衣處理，結果表明，在1.25%和1.50%NaCl脅迫條件下，AsA丸衣可以提高種子的發(fā)芽率（表2）。在0 NaCl處理中，CK1種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率都最高，丸衣處理顯著（P＜0.05）延長了平均發(fā)芽時間，丸衣種子處理間發(fā)芽率和平均發(fā)芽時間差異不顯著（P＞0.05）；在1.25%NaCl處理中，CK1種子發(fā)芽率最低，為56%，顯著（P＜0.05）低于丸衣種子。PAA1種子發(fā)芽勢最高，為20%，顯著（P＜0.05）高于其他丸衣處理和CK1；在1.50%NaCl中，CK1種子發(fā)芽率最低，和CK2間差異不顯著（P＞0.05），且顯著（P＜0.05）低于PAA1、PAA4、PAA8處理，其中PAA4處理發(fā)芽率最高，其次是PAA8，發(fā)芽率分別為46%和43%。PAA2處理種子平均發(fā)芽時間最長，除PAA1外，顯著（P＜0.05）大于其他處理（表2）。

通過不同濃度NaCl處理，在紫花苜蓿AsA丸衣種子出苗后，測定其種苗生長情況。在0 NaCl條件下，CK1的種苗長顯著（P＜0.05）大于PAA8處理，但與其他處理間差異不顯著（P＞0.05）；在1.25%和1.50%NaCl脅迫下，PAA4處理的種苗長度均達到最大，而且在1.50%NaCl時，顯著（P＜0.05）大于其他處理，且種苗重也是最大，但與其他處理無顯著（P＞0.05）差異。在1.25%NaCl中，各處理間種苗重無顯著（P＞0.05）差異，而在沒有NaCl脅迫時，AsA丸衣處理可以不同程度的增加種苗重量（表2）。綜上，紫花苜蓿AsA丸衣的最佳耐鹽配方為PAA4（4 mmol·L-1AsA）。

方差分析結果表明（表3），NaCl脅迫和丸衣處理對紫花苜蓿種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、平均發(fā)芽時間和種苗重都有顯著（P＜0.05）影響。NaCl脅迫和AsA丸衣處理在影響種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、平均發(fā)芽時間和種苗重上有顯著（P＜0.05）互作效應。

2.3 NaCl脅迫對紫花苜蓿SA丸衣種子發(fā)芽和種苗生長的影響

方差分析結果表明，NaCl脅迫和SA丸衣處理在影響種子發(fā)芽勢、發(fā)芽率、平均發(fā)芽時間和種苗長上有顯著（P＜0.05）互作效應（表3）。用不同濃度的SA對紫花苜蓿種子進行丸衣處理，在0 NaCl，CK1的發(fā)芽勢和發(fā)芽率最高，平均發(fā)芽時間最短；CK2處理的發(fā)芽勢最低，平均發(fā)芽時間最長。在1.25%NaCl時，PAS1的發(fā)芽勢和發(fā)芽率最高，為17%和72%；PAS20發(fā)芽率最低，為50%，其他處理間差異不顯著（P＞0.05）（表2）。用SA處理的丸衣種子平均發(fā)芽時間顯著（P＜0.05）大于CK1和CK2，在1.50%NaCl時，PAS1處理的發(fā)芽率顯著（P＜0.05）高于其他處理，為42%，CK1和CK2的發(fā)芽率分別為24%和30%，隨著SA濃度的增大，丸衣種子的發(fā)芽率逐漸降低；SA丸衣處理不同程度的延長了種子平均發(fā)芽時間（表2）。

表3 NaCl和丸衣對紫花苜蓿種子發(fā)芽影響方差分析Table 3 Analysis of variance of NaCl and pelleting on germination characters in alfalfa seed

在紫花苜蓿SA丸衣種子出苗后，測定其種苗生長情況。在0 NaCl時，PAS5處理的種苗長小于其他處理，其他處理間差異不顯著（P＞0.05）；丸衣不同程度地增加了種苗重量（表2）。在1.25%NaCl時，PAS5處理的種苗長顯著（P＜0.05）大于CK2，其他處理間無顯著（P＞0.05）差異。在1.50%NaCl時，除了PAS20以外，其他SA處理的丸衣種子的種苗長顯著（P＜0.05）大于CK1和CK2；PAS5處理的種苗重顯著（P＜0.05）大于PAS10和PAS20，其他處理間無顯著（P＞0.05）差異（表2）。

表2 不同含量AsA或SA對紫花苜蓿丸衣種子發(fā)芽的影響Table 2 Effects of differ ent contents of AsA or SA on ger mination in alfalfa pelleted seeds

綜上，紫花苜蓿SA丸衣的最佳耐鹽配方為PAS1（1 mmol·L-1SA）。

3 討論

鹽脅迫是一種常見的非生物脅迫，能夠抑制植物種子的萌發(fā)，影響幼苗的生長發(fā)育。在高粱（Sorghum bicolor）［21］、黃瓜（Cucumissativus）［22］、小麥（Triticum aestivum）［23］、水稻（Oryza sativa）［24］等作物種子研究中發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫會不同程度的抑制植物種子的萌發(fā)。本試驗結果也發(fā)現(xiàn)，隨著NaCl濃度的增加，紫花苜蓿種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率逐漸降低，當NaCl濃度達到1%時，發(fā)芽勢和發(fā)芽率顯著（P＜0.05）下降，平均發(fā)芽時間顯著（P＜0.05）延長，苗長和鮮重也呈下降趨勢。種子在萌發(fā)過程中受到鹽脅迫時，會誘導活性氧的產(chǎn)生，同時會抑制抗氧化酶的活性，導致自由基無法被清除而大量累積，進而使細胞膜上的不飽和脂肪酸過氧化，損傷細胞膜結構，影響細胞膜功能，從而抑制種子的萌發(fā)［25］。

AsA是一種普遍存在于動植物組織中具有傳遞電子和質(zhì)子能力的抗氧化劑，是許多物質(zhì)代謝和氧化還原反應的重要參與者［14-15］。研究表明，用0.5 mmol·L-1AsA對青豆（Pisum sativum）種子進行浸種處理，可以提高種子活力和幼苗生長性能［26］。董秋麗等［27］采用NaCl溶液（濃度為0、50、100、200 mmol·L-1）、AsA溶液（濃度為0、0.5、1.0、1.5、2.0 mmol·L-1）處理燕麥種子，研究發(fā)現(xiàn)，NaCl脅迫降低了燕麥種子的活力水平，隨AsA濃度的增加，燕麥種子的發(fā)芽率在100和200 mmol·L-1的NaCl脅迫下呈先升后降的趨勢，1 mmol·L-1的AsA引發(fā)對NaCl脅迫的緩解效果最好，這說明AsA引發(fā)對NaCl脅迫的緩解作用與其濃度有關，適宜的濃度能有效緩解NaCl脅迫。并且用AsA浸種處理對不同濃度的NaCl脅迫緩解作用也不同［28］，本試驗的交互作用結果也說明了這一點，當NaCl濃度增加到1.25%和1.50%時，AsA丸衣可以不同程度地提高紫花苜蓿種子的耐鹽性。其中，在NaCl濃度為1.5%時，配方PAA4處理的效果最好，顯著（P＜0.05）提高了在此鹽脅迫濃度下種子的發(fā)芽率。這說明種子在萌發(fā)過程中受到一定程度鹽脅迫傷害時，適宜濃度的AsA處理才會起到緩解作用，因此，不同的種子對NaCl脅迫的耐受性不同，相應地AsA處理的濃度也不完全相同。研究表明，NaCl脅迫會導致植物種子內(nèi)活性氧的快速產(chǎn)生，而外源AsA可以促進酶促和非酶促抗氧化作用，有效清除鹽脅迫產(chǎn)生的活性氧，從而提高植物種子耐鹽性，促進萌發(fā)及幼苗生長［29］，而鹽脅迫的程度和外源AsA作用時機的關系和作用機理還有待進一步的研究。

SA是一種重要的信號分子，通過調(diào)節(jié)細胞抗氧化機制、誘導逆境相關蛋白的表達等來緩解外界脅迫對植物的影響［17］。在低溫［30］、鹽堿［31］、蟲害［32］等逆境脅迫下，通過外源SA處理可以增強苜蓿抵抗逆境脅迫的能力。因此，利用SA對種子進行處理，研究鹽脅迫下種子的萌發(fā)特性，對提高種子抗逆性和種子發(fā)芽能力具有重要意義。但SA處理的濃度與物種有關，馬齒莧（Portulaca oleracea）種子在200 mmol·L-1的NaCl脅迫下，種子的發(fā)芽勢和發(fā)芽率大大降低，1 mmol·L-1的SA處理可以提高種子各項發(fā)芽指標，對種子萌發(fā)有促進作用［33］。0.1～0.4mmol·L-1SA可以緩解鹽脅迫對水飛薊（Silybum marianum）種子造成的傷害，而當SA濃度大于0.6 mmol·L-1時，對種子萌發(fā)產(chǎn)生抑制作用［34］。另外，李防洲等［35］在研究棉花（Gossypium hirsutum）抗寒性時，發(fā)現(xiàn)1～10 mmol·L-1SA包衣能提高其抗寒能力，而過低或過高都沒有很好的效果。本試驗方差分析結果也表明（表3），NaCl和AsA濃度存在顯著（P＜0.05）的交互作用，低濃度的SA處理（PAS1）可以提高NaCl脅迫下種子的發(fā)芽率和種苗重，而高濃度的SA處理（PAS20）的發(fā)芽率和種苗重則是最低。通過比較說明，植物種子對于鹽堿脅迫的耐受性不同，相應地SA處理的濃度也不完全相同，并且種子對SA的濃度較為敏感，適宜的SA濃度可以緩解鹽溶液的脅迫，而過高則會產(chǎn)生抑制作用。研究表明，SA處理通過提高幼苗內(nèi)超氧化物歧化酶、過氧化氫酶等細胞保護性酶的活性，從而提高蒲公英（Taraxacum mongolicum）［36］、三角葉濱藜（Atriplex triangularis）［37］對鹽脅迫的抵抗能力。因此，低濃度SA處理可能未能激發(fā)種苗體內(nèi)抵抗鹽脅迫的保護酶活性，而過高濃度的SA則可能破壞了種苗內(nèi)部的生理代謝過程，由此推測SA通過提高保護酶的活性來緩解鹽脅迫的危害，而SA與保護酶響應鹽脅迫的調(diào)控機制還有待進一步的研究說明。另外，SA對鹽脅迫下種子萌發(fā)的影響也可能與種子本身所含的內(nèi)源激素種類、分布及濃度不同有關。

4 結論

通過外源抗氧化劑AsA、植物激素SA拌種后進行紫花苜蓿種子丸衣處理，發(fā)現(xiàn)AsA和SA型丸衣可以提高紫花苜蓿種子的耐NaCl脅迫能力，篩選確定4 mmol·L-1AsA（PAA4）、1 mmol·L-1SA（PAS1）分別為最佳耐鹽處理。