雷芊芊，周明夏

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院，江蘇 泰州 225300）

藥物安全性評(píng)價(jià)是指在實(shí)驗(yàn)室條件下，用試驗(yàn)系統(tǒng)對(duì)藥物安全性作出評(píng)價(jià)，為臨床研究提供理論依據(jù)，是評(píng)判藥物能否進(jìn)入臨床研究的重要研究手段。生殖毒性試驗(yàn)是藥物臨床安全性評(píng)價(jià)經(jīng)常使用的研究方式，按研究目的不同分為四類。Ⅰ段研究藥物對(duì)動(dòng)物精子活力、發(fā)情周期的影響；Ⅱ段研究藥物對(duì)雌性動(dòng)物妊娠及胚胎、胎仔發(fā)育的影響；Ⅲ段研究藥物對(duì)動(dòng)物遺傳學(xué)的影響；Ⅳ段研究?jī)?nèi)容包括藥物對(duì)妊娠動(dòng)物、胚胎、胎仔發(fā)育情況及對(duì)動(dòng)物群體遺傳學(xué)表達(dá)規(guī)律的影響。本試驗(yàn)通過(guò)小鼠尾靜脈注射神經(jīng)藥物，研究藥物對(duì)小鼠的生育能力和早期胚胎發(fā)育的影響，旨在為臨床研究提供動(dòng)物試驗(yàn)資料。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物的選擇

1.1.1 品種的選擇 根據(jù)藥物生殖毒性研究技術(shù)指南，小鼠具有體型小、操作方便、易于飼養(yǎng)、性成熟快、生育能力強(qiáng)、懷孕時(shí)間短、產(chǎn)仔數(shù)多、對(duì)藥物敏感等優(yōu)點(diǎn)，被定義為人類的常用試驗(yàn)動(dòng)物之一［1］。故使用小鼠作為試驗(yàn)動(dòng)物。

1.1.2 數(shù)量的選擇 在滿足研究目的、科學(xué)標(biāo)準(zhǔn)，監(jiān)管要求和動(dòng)物福利的前提下，盡量減少使用動(dòng)物。根據(jù)藥物生殖毒性研究技術(shù)指南，每組中每種性別的小鼠不得少于5 只［2］。為確保每組數(shù)據(jù)有效性，防止偶然性，每組每種性別使用10 只小鼠。

1.1.3 日齡體重的選擇 給藥時(shí)雄性動(dòng)物日齡為40～50 日齡；雌性為55～65 日齡。給藥時(shí)雄性動(dòng)物體重為27.2～34.4 g；雌性為24.7～28.6 g。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物稱重

試驗(yàn)動(dòng)物給藥前需稱重1 次，稱重后根據(jù)體重分組；分組后交配前1 周稱重2 次；交配期間不稱重；交配成功后，雌性小鼠在發(fā)現(xiàn)妊娠當(dāng)天、妊娠3 d、妊娠6 d、妊娠9 d、妊娠13 d 各稱重1 次，雄性小鼠交配成功后安樂(lè)死前稱重［3］。

1.3 動(dòng)物分組

根據(jù)動(dòng)物體重，采用隨機(jī)分組法，詳見(jiàn)表1。

表1 試驗(yàn)動(dòng)物分組情況

1.4 方法

1.4.1 動(dòng)物標(biāo)記識(shí)別

1）動(dòng)物個(gè)體標(biāo)記。分組前，用記號(hào)筆在小鼠尾部標(biāo)記臨時(shí)號(hào)。根據(jù)體重分組后雄性小鼠和雌性小鼠擁有一個(gè)惟一的動(dòng)物編號(hào)，用耳打孔法輔助識(shí)別。耳打孔法具體方式：左耳打孔代表十位，右耳打孔代表個(gè)位，左右耳打孔中央圈為組別［4］，詳見(jiàn)圖1。

圖1 耳打孔法

2）籠卡標(biāo)記。動(dòng)物飼養(yǎng)籠盒上掛有標(biāo)注動(dòng)物信息的籠卡。

1.4.2 動(dòng)物飼養(yǎng) 試驗(yàn)動(dòng)物在無(wú)菌屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度控制為20～24 ℃，濕度在30%～60%，光照12 h［5］，動(dòng)物在試驗(yàn)期間飲用純凈水，自由采食符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的小鼠生長(zhǎng)繁育飼料。交配前飼養(yǎng)在裝有墊料的飼養(yǎng)盒中，每盒最多飼養(yǎng)5 只同性別動(dòng)物；交配期間，雌性小鼠放在雄性小鼠籠中飼養(yǎng)；交配成功后，為了防止妊娠動(dòng)物在群養(yǎng)籠中相互咬傷而導(dǎo)致流產(chǎn)或其他事故，雌性小鼠單獨(dú)飼養(yǎng)在單個(gè)籠子里［6］。

1.4.3 給藥頻率與方法

1）給藥頻率。每天給藥1 次，雄性小鼠的給藥時(shí)間為交配前28 d 開(kāi)始至交配成功后停止；雌性小鼠的給藥時(shí)間為交配前14 d 開(kāi)始到妊娠6 d 停止［7］。

2）給藥方法。對(duì)照組飼喂神經(jīng)藥物輔料，低劑量組、中劑量組、高劑量組注射不同濃度的某神經(jīng)藥物，使用儀器為一次性滅菌注射器和配套針頭，采用尾靜脈注射方式給藥，10～20 s 完成。每只動(dòng)物的給藥量應(yīng)根據(jù)體重進(jìn)行調(diào)整，給藥量需精確到0.01 mL。

1.4.4 動(dòng)物觀察

1）臨床觀察。每天2 次臨床觀察。2 次臨床觀察需間隔2 h 以上［8］。

2）給藥局部觀察。試驗(yàn)給藥期間，每次給藥前需對(duì)給藥部位局部觀察；給藥結(jié)束后每周觀察1 次。如動(dòng)物給藥局部出現(xiàn)異常反應(yīng)，應(yīng)連續(xù)觀察至異?，F(xiàn)象消失或安樂(lè)死當(dāng)天。給藥部位局部觀察的主要內(nèi)容是觀察給藥局部是否出現(xiàn)破潰、出血等癥狀［9］。

1.4.5 親代動(dòng)物指標(biāo)檢測(cè)

1）親代雌性小鼠的妊娠檢查。1～4 組孕鼠在妊娠13 d 解剖進(jìn)行妊娠狀態(tài)檢查。將動(dòng)物安樂(lè)死后，切除子宮，觀察子宮狀態(tài)，并對(duì)活胎、死胎及吸收胎進(jìn)行計(jì)數(shù)。

2）親代雄鼠精子計(jì)數(shù)和活力檢查。交配成功后的雄性小鼠在24 h 內(nèi)實(shí)施安樂(lè)死，解剖后取左側(cè)附睪尾，吸取1 份精子懸液，滴至載玻片上，置于精子分析儀中進(jìn)行精子計(jì)數(shù)，檢查精子活力［10］。

3）親代雄鼠精子形態(tài)檢查。用一次性無(wú)菌膠頭滴管吸取精液樣本，在顯微鏡下觀察每只動(dòng)物200個(gè)精子中含有的畸形精子數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 體重

試驗(yàn)期間，對(duì)各組動(dòng)物稱量體重，未見(jiàn)異常，詳見(jiàn)表2、表3。

表2 雄性小鼠平均體重 （單位：g）

表3 雌性小鼠體重 （單位：g）

2.2 臨床觀察

試驗(yàn)期間，各組試驗(yàn)動(dòng)物均未出現(xiàn)不良反應(yīng)。

2.3 妊娠情況

與對(duì)照組相比較，各試驗(yàn)組動(dòng)物的妊娠率、活胎率、吸收胎率、死胎率未見(jiàn)異常，詳見(jiàn)表4、表5。

表4 動(dòng)物妊娠情況

表5 親代雌性小鼠剖宮產(chǎn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2.4 雄性小鼠精子活動(dòng)度和精子計(jì)數(shù)

與對(duì)照組相比，各劑量組雄性小鼠精子活動(dòng)度和精子計(jì)數(shù)未見(jiàn)明顯異常，詳見(jiàn)表6、表7。

表6 雄鼠精子活動(dòng)度和精子計(jì)數(shù)

表7 雄鼠精子活動(dòng)度和精子計(jì)數(shù)

2.5 親代雄鼠精子形態(tài)學(xué)檢查

通過(guò)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，對(duì)照組和各劑量組雄性小鼠精子畸形率未見(jiàn)明顯異常，詳見(jiàn)表8。

表8 雄性小鼠精子形態(tài)統(tǒng)計(jì)

2.6 親代鼠生育能力統(tǒng)計(jì)

與對(duì)照組相比，各劑量組親代雄性小鼠的交配率、生育率未見(jiàn)異常，各劑量組親代雌性小鼠的交配率、受孕率、妊娠率未見(jiàn)異常，詳見(jiàn)表9。

表9 小鼠生育能力統(tǒng)計(jì)

3 結(jié)論

隨著科學(xué)與技術(shù)的進(jìn)步，特殊人群的用藥安全越來(lái)越受到重視。為了特殊人群的用藥安全，在滿足試驗(yàn)要求和動(dòng)物福利的前提下，用試驗(yàn)小鼠擬代特殊人群開(kāi)展試驗(yàn)。選用80 只試驗(yàn)鼠，對(duì)雌、雄性小鼠重復(fù)尾靜脈注射某神經(jīng)藥物。通過(guò)觀察重點(diǎn)檢測(cè)指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)神經(jīng)藥物對(duì)雌性小鼠妊娠情況、活胎率、吸收胎率、死胎率及雄性小鼠精子活力、精子計(jì)數(shù)和精子形態(tài)等均未產(chǎn)生影響。本研究實(shí)際為藥物劑量、毒性的探索試驗(yàn)，觀察藥物對(duì)親代小鼠生育能力及早期胚胎發(fā)育的影響，為該藥物后續(xù)實(shí)驗(yàn)提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)，為特殊人群安全用藥提供參考。