張婷婷，張鶴山，許本波，劉 洋

（1.長江大學，湖北 荊州 434000；2.湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所/動物胚胎及分子育種湖北重點實驗室，武漢 430064）

白三葉（Trifolium repens）是異源四倍體牧草豆科植物，廣泛種植于濕潤溫帶氣候地區(qū)，為放牧動物提供高質(zhì)量營養(yǎng)牧草。白三葉有生物固氮的環(huán)境效益，是世界范圍內(nèi)廣泛使用的飼草［1］。白三葉也因其形態(tài)多樣的葉片和優(yōu)美的花序在城市園林建設(shè)中得到廣泛應(yīng)用。觀賞性白三葉新品種培育越來越得到重視，國內(nèi)外已經(jīng)培育出了葉片具有不同色斑的白三葉新品種［1］，中國農(nóng)業(yè)科學院生物技術(shù)研究所培育出了“紫斑”白三葉并已推廣利用。湖北省農(nóng)業(yè)科學院畜牧獸醫(yī)研究所課題組發(fā)現(xiàn)了一株花瓣為紅色的白三葉突變體［2］，并培育出新品系，但其花色形成機制仍需進一步研究。

花青素合成酶（Anthocyanidin synthase，ANS）作為花青素合成途徑后期的關(guān)鍵酶，編碼類黃酮途徑中的雙加氧酶，催化無色花青素生成花青素，在花青素合成過程中發(fā)揮了重要作用［3］，已在多個物種中得到證實。如蠟梅（Chimonanthus praecox L.）CpANS基因的超表達顯著提高擬南芥花青素和原花青素的合成能力，在植物體中具有催化底物白花矢車菊素生 成 花 青 素 的能 力［4］。草 莓（Fragaria ananassa Duch）的3 個轉(zhuǎn)ANS基因株系（ANSL5、ANSL15 和ANSL18）都與果實花青素合成有關(guān)［5］。在紫色棗品種胎里紅中，研究者發(fā)現(xiàn)ZjANS1 與花青苷含量呈極顯著正相關(guān)，是胎里紅果皮花青苷合成的關(guān)鍵基因，對胎里紅果皮色素合成及顏色轉(zhuǎn)變起著重要的作用［6］。在白三葉研究中，研究者也預測TrANS是白三葉類黃酮合成途徑的候選基因［7］，但白三葉中花青素合成酶基因TrANS對花青素或類黃酮控制的相關(guān)作用研究仍不清楚。

白三葉花青素合成途徑中的調(diào)控基因相關(guān)的分子研究仍然較少。為更深入了解白三葉中TrANS基因的功能，本研究以白三葉轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中的TrANS基因為研究對象，在DNAMAN、MEGA、Prot?Param、 SignalP5.0、 NetPhos3.1、 InterProscan、TMHMM2.0、SWISS-MODEL、PlantCare、NovoPro、PSORT Prediction 和SOPMA 等生物信息學軟件上對TrANS進行生物信息學分析，對TrANS基因的理化性質(zhì)及空間結(jié)構(gòu)進行預測，為其功能研究奠定一定的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

白三葉轉(zhuǎn)錄組測序中的TrANS序列。

1.2 方法

在DNAMAN6.0 軟件上進行TrANS開放閱讀框的查找、翻譯。在在線工具ProtParam（https：//web.expasy.org/protparam/）上預測TrANS 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。在TMHMM2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？TMHMM-2.0）上對TrANS 蛋白質(zhì)的跨膜結(jié)構(gòu)進行預測。在NetPhos3.1（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？ NetPhos-3.1）上 對TrANS 蛋白質(zhì)的磷酸化位點進行預測。在Sig?nalP5.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-5.0）上對TrANS 蛋白質(zhì)的信號肽進行預測。在NovoPro（https：//www.novopro.cn/tools/disordered.html）上對TrANS 蛋白質(zhì)的無序化特征進行預測。在SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgibin/secpred_sopma.pl）上對TrANS 蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)進行預測。在InterProscan（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）上對TrANS 蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)域進行預測。在SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）上對TrANS 蛋白質(zhì)的三級結(jié)構(gòu)進行預測。在Plant?Care （https：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）上對TrANS 蛋白質(zhì)的啟動子順式作用元件進行預測。在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找并下載TrANS 的同源序列，并在MEGA X 軟件上進行序列比對并構(gòu)建進化樹。

2 結(jié)果與分析

2.1 TrANS 基因的理化性質(zhì)及一級結(jié)構(gòu)

TrANS基因的cDNA 長度為1 038 bp，正向鏈第一框即從第一個堿基開始，到最后一個堿基有最大的開放閱讀框，開放閱讀框編碼了345 個氨基酸（圖1），此即為TrANS 蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)。TrANS 蛋白質(zhì)的分子式為C1740H2736N452O504S22，分子質(zhì)量（MW）為3.87 kDa，理論等電點為6.33。Lys 氨基酸有30 個，占總數(shù)的8.7%，數(shù)量最多；接下來為Leu，29 個，占8.4%；Glu 27 個，占7.8%；最少的是Trp 和Gln，有5個，占1.4%，正電氨基酸殘基（Arg＋Lys）有42 個，負電殘基（Asp ＋Glu）45 個，所以該蛋白帶有負電荷。280 nm 處的吸光度在1.017~1.033。不穩(wěn)定系數(shù)為39.17，為穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)為85.04，總平均疏水指數(shù)為-0.150，所以TrANS 蛋白為親水性蛋白。沒有跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽。無序化特征預測發(fā)現(xiàn)，在90~100 個氨基酸之間可能出現(xiàn)無序化結(jié)構(gòu)，分值越高代表該位置為無序區(qū)的概率越大，0.5 作為無序區(qū)的分界線。有15 個絲氨酸（Ser）磷酸化位點，8 個絡(luò)氨酸（Tyr）磷酸化位點，5個蘇氨酸（Thr）磷酸化位點。

圖1 TrANS 蛋白的一級結(jié)構(gòu)

2.2 TrANS 蛋白的二級結(jié)構(gòu)及結(jié)構(gòu)域

TrANS 蛋白的二級結(jié)構(gòu)中，α-螺旋最多，有143個，占41.45%；無規(guī)則卷曲有129 個，占37.39%；延伸鏈有47 個，占13.62%；β-折疊有26 個，占7.54%；沒有β-橋、310 螺旋、彎曲區(qū)、π 螺旋、模糊狀態(tài)以及其他狀態(tài)等二級結(jié)構(gòu)（圖2）。在8~246 個氨基酸間可能存在Epimerase_deHydtase 或Epimerase 結(jié)構(gòu)域，在7~318 個氨基酸間有NAD（P）-bd_dom_sf 或NAD（P）-binding Rossmann-fold domains 結(jié)構(gòu)域，在8~302 個氨基酸之間有FR_SDR_e 結(jié)構(gòu)域，在3~331個氨基酸之間有Nad Dependent Epimerase/dehydra?tase 或Dihydroflavonal-4-reductase 2 結(jié) 構(gòu) 域，在1~337 個氨基酸之間有CATH-Gene3D entry 結(jié)構(gòu)域。

圖2 二級結(jié)構(gòu)預測

2.3 TrANS 蛋白的三級結(jié)構(gòu)

TrANS 蛋白的三級結(jié)構(gòu)預測以3bxx.1.A 為模板進行同源建模，序列相似度為75%，GMQE 為0.88，QMEAND 為0.86 ± 0.05，符合同源建模的要求。三級結(jié)構(gòu)預測結(jié)果如圖3 所示，以α?螺旋和無規(guī)則卷曲為主，與二級結(jié)構(gòu)的預測一致。

圖3 三級結(jié)構(gòu)預測

2.4 TrANS 基因的順式作用元件

白三葉TrANS基因中，有9 種序列的順式作用元件沒有相關(guān)命名和功能研究，有25 種在其他生物體中有相關(guān)命名或功能研究。其中，AT~TATAbox、MYB、MYB-like sequence、MYC、Myb-binding site、STRE、Unnamed__1、Unnamed__2、Unnamed__4、W box、WRE3 和as-1 在別的物種中也有發(fā)現(xiàn)相同的啟動子序列，但沒有相關(guān)功能研究。AACA_motif在水稻（Oryza sativa）中參與胚乳特異性負表達；ABRE 在大麥（Hordeum vulgare）中是參與脫落酸反應(yīng)的順式作用元件；AE-box 在擬南芥（Arabidopsis thaliana）中是光響應(yīng)模塊的一部分；Box 4 在意大利荷蘭芹（Petroselinum crispum）中是光響應(yīng)的保守DNA 模塊的一部分；CAAT-box 在煙草（Nicotiana glutinosa）、豌豆（Pisum sativum）和擬南芥中是啟動子和增強子區(qū)域的共同順式作用元件；CGTCA-mo?tif在大麥中是參與茉莉酸甲酯反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件；G-box 在玉米（Zea mays）中參 與光響應(yīng)；GARE-motif 是豌豆光響應(yīng)元件的一部分；LTR 在大麥中參與低溫響應(yīng)；O2-site 在玉米中參與玉米醇溶蛋白代謝的調(diào)節(jié)；TATA-box 在甘藍型油菜（Brassica napus）和擬南芥中是轉(zhuǎn)錄起始點的核心啟動子元件；TGACG-motif 也是大麥中參與茉莉酸甲酯反應(yīng)的順式作用調(diào)節(jié)元件（圖4）。

圖4 順式作用元件分布位點

2.5 TrANS 氨基酸的同源分析

在NCBI 對TrANS的氨基酸序列進行序列比對，發(fā)現(xiàn)TrANS氨基酸序列和紅三葉（Trifolium pratense）的相似性最高，為94.03%，與蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）的相似性為88.22%，與鷹嘴豆（Cicer ari?etinum）、百 脈 根（Lotus japonicus）、大 豆（Glycine max）、野大豆（Glycine soja）、絲莖黃耆（Lotus filicau?lis）、綠豆（Vigna radiata）、四季豆（Phaseolus vulgar?is）、赤小豆（Vigna umbellata）、雞血藤（Spatholobus suberectus）、刺毛黧豆（Mucuna pruriens）、木豆（Caja?nus cajan）和紅豆（Vigna angularis）的相似性依次為85.93% 、86.23% 、85.93% 、85.36% 、83.33% 、82.03% 、81.87% 、80.80% 、83.83% 、85.58% 、79.83%、80.52%。下載這14 條同源性的氨基酸序列，進行多序列比對，并構(gòu)建進化樹（圖5）。從進化樹中可以看出，白三葉中TrANS 和紅三葉的親緣關(guān)系最近，接下來是蒺藜苜蓿和鷹嘴豆，然后是百脈根和絲莖黃耆，和NCBI 中的序列相似度基本一致，說明結(jié)果準確可靠。進化樹逐級分支，具有較多層級，說明ANS 蛋白的進化具有保守性和物種特異性。

圖5 系統(tǒng)進化樹

3 小結(jié)與討論

白三葉TrANS基因特征和蛋白的理化性質(zhì)與其他物種中的ANS有相似性也有差異，如芒果皮的Mi?ANS理論分子質(zhì)量明顯高于白三葉，在甘薯中IbANS 不穩(wěn)定，但在白三葉中為穩(wěn)定蛋白；TrANS 的二級結(jié)構(gòu)與其他物種中的二級結(jié)構(gòu)組成類似；ANS基因的進化和物種有關(guān)，所以TrANS的親緣關(guān)系和其他物種中ANS的親緣關(guān)系不相同。芒果皮的Mi?ANS中包含1 262 bp 的全長cDNA，開放閱讀框（ORF）為1 056 bp，編碼351 個氨基酸的蛋白質(zhì)，推導MiANS 氨基酸序列的理論分子質(zhì)量為39.8 kDa，通過系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，編碼該蛋白的基因與山葡萄、可可、桑樹、荔枝等果樹親緣關(guān)系高［8］。芥菜型油菜BjANS的cDNA 序列長1 377 bp，具有1 077 bp的開放閱讀框，編碼一個由358 個氨基酸組成的推導多肽，預測分子質(zhì)量為4.09 kDa，估計等電點為5.18，推測的BjANS 蛋白與擬南芥、菜青蟲和甘藍菜青蟲ANS 蛋白具有91%~99%的氨基酸序列同源性［9］。甘薯（Ipomoea batatas）IbANS 蛋白的分子質(zhì)量為4.05 kDa，總原子數(shù)有5 709 個，氨基酸有362 個，屬于不穩(wěn)定的親水非分泌蛋白，和鐵皮石斛一樣，二級結(jié)構(gòu)以α?螺旋和無規(guī)則卷曲為主，但無規(guī)則卷曲含量更多，與三淺裂野牽牛（Ipomoea trifida）親緣關(guān)系 最 近［10］。白 三 葉TrANS基 因 的cDNA 長 度 為1 038 bp，整條鏈都是開放閱讀框，編碼合成了345 個氨基酸，TrANS 蛋白質(zhì)的分子式為C1740H2736N452O504S22，分子質(zhì)量為3.87 kDa，理論等電點為6.33，為帶負電的親水穩(wěn)定不分泌蛋白，二級結(jié)構(gòu)以α?螺旋和無規(guī)則卷曲為主，其α?螺旋含量更多。TrANS與同源基因的相似性均在70%以上，說明TrANS基因是一個較為保守的序列，ANS 蛋白的進化具有保守性和物種特異性。

白三葉TrANS基因的順式作用元件缺少相關(guān)功能研究，但類似的順式作用元件如MYB 在其他物種中有相關(guān)研究。大麥花青素的合成受MYB 和bHLH類轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)控［11］。臘梅CpbHLH1 的表達與蠟梅花中花青素生物合成關(guān)鍵基因CpANS1呈負相關(guān)，CpbHLH1 不能直接抑制花青素合成相關(guān)基因的表達，但是可以通過抑制MYB-b HLH 復合體的活性來實現(xiàn)對花青素生物合成的抑制作用［12］。MYB和bHLH 對ANS基因都有調(diào)控作用，但白三葉TrANS中沒有bHLH 啟動子元件，預測TrANS中的MYB 元件對TrANS具有調(diào)控作用，進而調(diào)控白三葉的花青素途徑。

ANS基因在花青素合成途徑中有重要作用?？煽桑═heobroma cacao）的TcANS基因在煙草中過量表達導致花瓣中花青素和原花青素含量均增加，在擬南芥突變體中的過量表達補充了其種子原花青素缺陷的表型［13］。將水稻（Oryza sativa）OsANS基因在不積累花青素的水稻突變體中過量表達，可以獲得含有黃酮類化合物和增強抗氧化能力的新型轉(zhuǎn)基因水稻［14］。大量研究表明ANS基因和植物花青素合成有關(guān)，本研究為白三葉TrANS的后續(xù)功能研究奠定了理論基礎(chǔ)。