岳 怡，岳 華，湯 承

（西南民族大學(xué)畜牧獸醫(yī)學(xué)院，四川 成都 610041）

牛呼吸道綜合征（BRDC）是嚴(yán)重危害養(yǎng)牛業(yè)的一類疾病，發(fā)病率和死亡率都比較高，主要表現(xiàn)為發(fā)熱、咳嗽、流鼻涕及呼吸困難等呼吸道癥狀。引起B(yǎng)RDC的病毒有牛傳染性鼻氣管炎病毒（IBRV）、牛冠狀病毒（BCoV）、牛病毒性腹瀉病毒（BVDV）、牛呼吸道合胞體病毒（BRSV）、牛副流感3型病毒（BPIV-3）、牛腺病毒3型（BAV-3）等；引起B(yǎng)RDC 的細(xì)菌有多殺性巴氏桿菌（P.multocida）、溶血性曼氏桿菌（M.haemolytica）、睡眠嗜組織菌（H.somni）；牛支原體（M.Bovis）也是引起B(yǎng)RDC的主要病原［1-2］。病毒感染是引起B(yǎng)RDC的重要原因，臨床上不同地區(qū)引起B(yǎng)RDC 的病原種類可能存在差異，且常呈混合感染［3］。運輸應(yīng)激是BRDC 暴發(fā)的重要誘因，從異地引進(jìn)牛群造成的運輸應(yīng)激，會使牛機體抵抗力降低，從而誘發(fā)本病［4］。

2021 年3 月四川某肉牛場犢牛暴發(fā)BRDC，這批犢牛為內(nèi)蒙古引進(jìn)的3～4 月齡西門塔爾牛犢牛，在引進(jìn)的4 d后有28頭犢牛出現(xiàn)體溫升高、食欲減退、精神沉郁以及咳嗽、呼吸困難、流鼻涕等呼吸道臨床癥狀。本試驗的目的是對發(fā)病牛的臨床樣本進(jìn)行常見呼吸道病原檢測，為該場BRDC的防控提供參考。

1 材料與方法

1.1 樣本來源 2021 年3 月于四川省某肉牛場采集了10 份3～4 月齡發(fā)病犢牛的深部鼻腔棉拭子。

1.2 主要試劑 TrizolTM試劑盒購自TaKaRa，T3 Super PCR Mix 購自擎科生物，反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自成都蓉為生物，Marker DL2000 購自南京諾唯贊生物，核酸染料Golden View 購自西安赫特生物。

1.3 核酸提取 將采集的10 份鼻拭子樣本，用PBS按1∶3的比例處理，充分混勻后，以8 000 r/min 4 ℃下離心10 min，取500 μL上清液于1.5 mL滅菌EP管中，每份樣本取兩管備用。

用Trizol 法提取10 份鼻拭子樣本的總RNA，再反轉(zhuǎn)錄合成cDNA；用酚-氯仿抽提法提取10份鼻拭子樣本的DNA。將DNA 和cDNA 放－20 ℃保存?zhèn)溆?，RNA放－80 ℃保存?zhèn)溆?。反轉(zhuǎn)錄體系：DEPC-treated Water 8 μL，5×Reaction Mix 4 μL，Supreme Enzyme Mix 3 μL，RNA 5 μL。反應(yīng)條件：25 ℃10 min，55 ℃15 min，85 ℃5 min。

1.4 陽性cDNA BCoV、BVDV、IBRV、BAV-3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica及H.somni等病原的陽性cDNA均由西南民族大學(xué)動物醫(yī)學(xué)實驗室保存。

1.5 檢測病原的PCR 方法 采用文獻(xiàn)［5-8］報道的BCoV、BVDV、IBRV、BAV-3、M.Bovis、P.multocida、M.haemolytica和H.somniPCR 檢測方法對這10 個鼻拭子樣本進(jìn)行檢測。所有引物均由上海生工合成，引物信息見表1。

表1 病原PCR檢測引物信息

PCR 反應(yīng)體系：T3 Super PCR Mix 17 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA 1 μL，總體積共20 μL。PCR擴(kuò)增條件：98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性10 s，57 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，共35 個循環(huán)；72 ℃終延伸5 min；12 ℃保存。

2 結(jié)果

10 份鼻拭子樣本的PCR 檢測結(jié)果如下：BCoV 檢出7 個陽性，陽性率為70%；BVDV 檢出3 個陽性，陽性率為30%；其他病原未檢出。詳見圖1 和圖2。

圖1 BCoV檢測結(jié)果

圖2 BVDV檢測結(jié)果

3 討論

3.1 BCoV 流行情況 BCoV 具有雙噬性，即能感染上、下呼吸道和腸道，在臨床上可以引起犢牛腹瀉（CD）、成年牛冬季痢疾（WD）和牛呼吸道疾病綜合征［11］。BCoV作為BRDC的重要病原體，近年來頗受關(guān)注，國外已有越來越多的證據(jù)表明BCoV 與BRDC相關(guān)。在國外，BCoV是導(dǎo)致BRDC 的常見病原，BCoV 在瑞士BRDC 牛群中的陽性率可達(dá)53.5%［12］。楊海峰等［13］對我國14 個省的176 份牛呼吸道樣本進(jìn)行病原學(xué)檢測，結(jié)果檢出BCoV 陽性率為21.59%；魏碩佟等［14］對寧夏地區(qū)186 份牛呼吸道樣本進(jìn)行病原學(xué)檢測，結(jié)果檢出BCoV 陽性率為16.67%。說明BCoV 引起的BRDC 在我國廣泛流行。本試驗對內(nèi)蒙古犢牛鼻拭子的BCoV 檢出率為70%，與流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果一致。綜上，對我國BCoV 在BRDC 中流行情況的調(diào)查和防控有必要進(jìn)一步加強。

3.2 BVDV 流行情況 在國外，BVDV 也是導(dǎo)致BRDC 的常見病原之一。BVDV 在加拿大BRDC牛群中的陽性率高達(dá)69%［15］。我國對BVDV 的研究主要在于與牛腹瀉的關(guān)系，但是該病毒還是引起肺炎和繁殖障礙的重要病因。本實驗室曾于2019 年對四川省108 份牛呼吸道樣本進(jìn)行過病原學(xué)檢測，結(jié)果檢出BVDV 陽性率為16.7%［16］；魏碩佟等［14］于2021 年對寧夏地區(qū)186 份牛呼吸道樣本進(jìn)行病原學(xué)檢測，結(jié)果檢出BVDV陽性率為8.06%。本試驗對內(nèi)蒙古犢牛鼻拭子的BVDV 檢出率為30%。以上報道說明BVDV引起的BRDC在我國也流行較廣。

4 結(jié)論

通過本次實驗室檢測結(jié)果再結(jié)合臨床癥狀分析，認(rèn)為該肉牛場引進(jìn)犢牛的呼吸道疾病是由BCoV和BVDV混合感染引起的，該場可以采取針對性防控措施。目前，我國對BCoV 和BVDV 引起B(yǎng)RDC 的重視度不足，在生產(chǎn)實踐中有必要對其加強防控。