黃小強(qiáng) 祝丹江 王魯豫 陳雨田 孫嘉寧 黃 濤 賈 安

黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450063

急性肺損傷(Acute lung injury，ALI)是急診科室中最常見(jiàn)的危重病之一，它的特點(diǎn)是肺泡上皮細(xì)胞及毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷，造成彌漫性肺間質(zhì)及肺泡水腫，同時(shí)伴隨蛋白質(zhì)的滲出、大量炎癥介質(zhì)及因子的釋放[1]。炎癥細(xì)胞因子和相關(guān)介質(zhì)伴隨ALI的發(fā)生與發(fā)展全過(guò)程，例如TNF-α、IL-6、IL-1β、iNOS和NO等[2]。ALI在臨床上具有較高的死亡率和發(fā)病率，其死亡率然高達(dá)40%～60%[3]。馬齒莧為馬齒莧科植物馬齒莧(PortulacaoleraceaL.)的干燥地上部分，全國(guó)絕大地區(qū)均有分布，中國(guó)藥典(2020版)記載具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效[4]；由于富含多種營(yíng)養(yǎng)成分，其中以維生素及ω-3脂肪酸最為突出，因此馬齒莧也是一種營(yíng)養(yǎng)價(jià)值較高的食物[5]。國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究[6-8]發(fā)現(xiàn)馬齒莧的主要化學(xué)成分包括：多糖類(lèi)、黃酮類(lèi)、生物堿類(lèi)、有機(jī)酚酸類(lèi)等，同時(shí)藥理學(xué)研究[9-12]發(fā)現(xiàn)，馬齒莧多糖具有一定程度地降低炎癥因子和護(hù)肝等作用。為了探討馬齒莧多糖是否對(duì)ALI的保護(hù)作用，本研究應(yīng)用馬齒莧多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)ALI小鼠模型開(kāi)展相關(guān)研究。為馬齒莧今后進(jìn)一步深入開(kāi)發(fā)和臨床應(yīng)用提供一定參考。

1 材料與儀器

1.1 試藥 馬齒莧(張仲景大藥房)；脂多糖(美國(guó)Sigma公司)；醋酸地塞米松片(遂成藥業(yè)股份有限公司)；腫瘤壞死因子ɑ(TNF-α)、白介素1β(IL-1β)和白介素6(IL-6)ELISA檢測(cè)試劑盒(上海西塘生物科技有限公司)；髓過(guò)氧化物酶(MPO)活性檢測(cè)試劑盒(南京建成生物工程研究所)。

1.2 動(dòng)物 60只清潔級(jí)KM雄性小鼠，體重18～20 g，由黃河科技學(xué)院醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物房光照條件12 h/d，溫度20～23 ℃，相對(duì)濕度40%～60%，小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 儀器 多功能酶標(biāo)儀(奧地利，Infinite公司)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(美國(guó)，賽默飛世爾科技有限公司)；FY135型中草藥粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；DHP-9052電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海-恒科技有限公司)；BS-3000A系列電子天平(上海友聲衡器有限公司)；光學(xué)顯微鏡(日本，OLYMPUS)；RM2125型石蠟切片機(jī)(德國(guó)，Leica公司)。

2 方法

2.1 藥物制備

2.1.1 馬齒莧多糖的制備[13-14]將馬齒莧粗粉，過(guò)10目篩，稱(chēng)取500 g，加入4倍量無(wú)水乙醇浸泡24 h，抽濾，60 ℃烘干藥渣，然后加入10倍量的蒸餾水，置于80 ℃水浴鍋中溫浸2 h，溫浸提取2次，合并2次濾液，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀減壓濃縮至200 mL，然后加入800 mL無(wú)水乙醇至80%，劇烈搖勻，4 ℃低溫靜置分層，抽濾，收集沉淀，即為馬齒莧粗多糖。沉淀完全溶于蒸餾水后加入適量活性炭進(jìn)行脫色，抽濾，再加入少量Sevage試劑，充分震蕩，靜置分層，收集上清液，減壓濃縮，并真空冷凍干燥，得馬齒莧多糖，-20 ℃低溫保存?zhèn)溆?。采用硫?苯酚法對(duì)馬齒莧多糖含量進(jìn)行測(cè)定[15]，其工作曲線為C=3.6311A+0.0023，R2=0.9991，測(cè)定馬齒莧多糖含量為62.22%

2.1.2 醋酸地塞米松溶液的制備 取適量將醋酸地塞米松片置于研缽中，充分研磨，用生理鹽水配制成濃度為0.0005 g/mL的溶液，備用。

2.2 分組、造模與給藥 將60只清潔級(jí)KM小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為6組：正常組，LPS型組，醋酸地塞米松組(0.005 g/kg·d)，馬齒莧多糖低、中、高劑量組(1.5、3、6 g/kg/d，生藥材)，每組10只，按10 mL/kg體重灌胃給藥，每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d，除正常組和LPS組小鼠給予等量常溫生理鹽水，其他各組給予相應(yīng)體積的藥物。末次給藥后2 h，采用鼻腔滴注法慢慢滴注LPS生理鹽水溶液(0.5 mL/kg)，正常組按照相同的方法給予相應(yīng)體積的生理鹽水[16]。建立模型[17]后小鼠禁食不禁水12 h，采用眼眶取血，隨后脫臼處死，并迅速取出肺組織，備用。

2.3 肺組織W/D值計(jì)算[18]取小鼠右肺上葉，剔除肺組織上面結(jié)締組織，同時(shí)利用濾紙吸盡組織表面水分和血液，并稱(chēng)量記錄為肺組織濕重；隨后將肺組織放置于溫度為80 ℃干燥箱中連續(xù)干燥48 h后，稱(chēng)量記錄為肺組織干重，計(jì)算(W/D)。

2.4 肺組織中MPO活性測(cè)定 取適量小鼠肺組織置于組織勻漿器中，按試劑盒說(shuō)明書(shū)操作制備成5%的肺組織勻漿液，并檢測(cè)MPO活性。

2.5 血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量測(cè)定 取血后，在低溫條件下4000 r/min離心10 min分離血清，取上清；按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟，采用酶聯(lián)免疫吸附劑法測(cè)定各組血清中TNF-α、IL-6、IL-1β的含量。

2.6 肺組織病理學(xué)檢查 切下右肺組織下葉經(jīng)4%多聚甲醛溶液固定24 h后，用蒸餾水沖洗至無(wú)多聚甲醛味；然后進(jìn)行常規(guī)的石蠟包埋，切片厚度5 μm。進(jìn)行切片脫蠟、蘇木素-伊紅染色、封片。在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行病理學(xué)觀察分析，根據(jù)肺泡壁厚度、肺組織破壞和炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況進(jìn)行評(píng)分[19]。評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)：0分=最小損傷；1分=輕度損傷；2分=中度損傷；3分=重度損傷；4分=最大損傷。肺損傷評(píng)分為3個(gè)指標(biāo)評(píng)得分之總和。

3 結(jié)果

3.1 馬齒莧多糖對(duì)肺組織W/D值的影響 與正常組比較，LPS組小鼠肺組織W/B值顯著性升高(P<0.01)。與LPS組比較，經(jīng)過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后各劑量組小鼠W/B值均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或0.01)。見(jiàn)表1。

3.2 馬齒莧多糖對(duì)肺組織中MPO活性的影響 與正常組比較，LPS組小鼠肺組織中MPO活性顯著性升高(P<0.01)。與LPS組比較，經(jīng)過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后各劑量組小鼠MPO活性均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或<0.01)。見(jiàn)表2。

3.3 馬齒莧多糖對(duì)血清中TNF-α、IL-6、IL-1β含量影響 與正常組比較，LPS組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均顯著性升高(P<0.01)。與LPS組比較，經(jīng)過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后各劑量組小鼠血清中TNF-α、IL-1β和IL-6含量均有不同程度降低，其中中劑量和高劑量組均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)表3。

表1 各組小鼠肺組織W/D值的比較

表2 各組小鼠肺組織中MPO活性的比較

表3 各組小鼠血清中TNF-α、IL-6和IL-1β含量的比較

3.4 馬齒莧多糖對(duì)肺組織病理形態(tài)學(xué)的影響 正常組小鼠肺組織的結(jié)構(gòu)清晰、無(wú)滲出液，同時(shí)也沒(méi)有出現(xiàn)水腫及炎細(xì)胞浸潤(rùn)等現(xiàn)象。LPS組小鼠的肺組織出現(xiàn)明顯的炎性浸潤(rùn)，肺泡間隔增厚及間質(zhì)水腫等較為嚴(yán)重的病理?yè)p傷現(xiàn)象，與正常組比較，LPS組小鼠肺損傷評(píng)分顯著性升高(P<0.01)。與LPS組比較，經(jīng)過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后各劑量組小鼠肺組織損傷均有不同程度的改善，同時(shí)肺損傷評(píng)分也有不同程度降低。如圖1所示。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)的變化圖(×20) 注：與正常組比較，##P<0.01；與LPS組比較，*P<0.05,**P<0.01。

4 討論

該研究通過(guò)鼻腔滴注LPS溶液建立ALI小鼠動(dòng)物模型。在滴注LPS后2～4 h內(nèi)可誘發(fā)ALI，在24～48 h內(nèi)便可造成最大肺損傷[20]，該種方法可有效避免由于皮下注射LPS溶液引起的全身炎癥反應(yīng)和臟器官衰竭[21]。革蘭陰性菌感染導(dǎo)致的肺炎是ALI最常見(jiàn)的誘導(dǎo)因素之一，由于LPS刺激巨噬細(xì)胞，從而導(dǎo)致機(jī)體大量釋放TNF-α、IL-1β、IL-6等炎癥因子，進(jìn)一步引發(fā)急性炎癥反應(yīng)[22]。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于ALI的致病機(jī)制尚不明確，有學(xué)者[23]認(rèn)為，ALI發(fā)生的主要原因是體內(nèi)促炎和抗炎系統(tǒng)失衡。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠顯著性降低TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥細(xì)胞含量，提示馬齒莧多糖對(duì)LPS誘導(dǎo)的ALI作用與其抑制炎癥因子分泌有關(guān)。

肺組織的W/D值大小在一定程度上反映了水腫的程度[24]，肺水腫程度與W/D值密切相關(guān)，W/D值越大則肺水腫程度越大，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)馬齒莧多糖能夠顯著降低W/D值，從而緩解LPS所誘導(dǎo)的ALI。肺組織病理學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)LPS組小鼠肺組織損傷嚴(yán)重，通過(guò)馬齒莧多糖干預(yù)后上述病理變化明顯得到減輕。

綜上，本研究結(jié)果顯示：馬齒莧多糖能夠降低肺組織W/D值和肺組織中MPO活性，同時(shí)降低血清中TNF-α、IL-1β和IL-6炎癥因子含量，提示馬齒莧多糖對(duì)LPS所致的ALI具有一定的保護(hù)作用，其作用機(jī)制與抑制炎癥因子分泌有關(guān)。