楚偉可， 吳 雪， 張 鵬， 馮 婧， 牛 斌， 周 輝， 宓余強(qiáng)， 李 萍

1 天津醫(yī)科大學(xué) 研究生院， 天津 300070；2 天津市第二人民醫(yī)院 中西醫(yī)結(jié)合肝病科， 天津市肝病研究所， 天津 300192

肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)是全球第六大常見腫瘤和我國(guó)第二大癌癥死亡原因，早期發(fā)現(xiàn)、及時(shí)采取有效的治療是改善患者生存預(yù)后的重要手段[1-2]。射頻消融術(shù)(radiofrequency ablation，RFA)在早期肝癌特別是直徑≤2 cm的患者中的療效與手術(shù)切除相當(dāng)，是不能切除的早期肝癌患者的首選治療方法[3-6]。許多臨床和實(shí)驗(yàn)研究[7-8]表明，全身炎癥反應(yīng)在腫瘤的進(jìn)展中發(fā)揮重要作用。近年來，多項(xiàng)研究[9-11]證實(shí)了全身炎癥標(biāo)志物包括中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio, NLR)、紅細(xì)胞分布寬度/淋巴細(xì)胞比值(red blood cell distribution width-to-lymphocyte ratio, RLR)、淋巴細(xì)胞/單核細(xì)胞比值(lymphocyte-to-monocyte ratio, LMR)等在包括HCC在內(nèi)的惡性腫瘤和肝衰竭預(yù)后中的作用。本研究旨在探討術(shù)前全身炎癥標(biāo)志物NLR、RLR及LMR在早期小肝癌RFA后預(yù)后中的價(jià)值。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2011年9月—2020年12月在天津市第二人民醫(yī)院行RFA的132例初診HCC患者。HCC的診斷及分期符合《原發(fā)性肝癌診療規(guī)范(2019年版)》[2]，基于動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI/CT、超聲造影等2種或以上影像學(xué)支持，具體表現(xiàn)為動(dòng)脈期病灶明顯強(qiáng)化，門靜脈期和/或平衡期病灶強(qiáng)化低于肝實(shí)質(zhì)即“快進(jìn)快出”的肝癌典型特征，伴或不伴AFP水平升高。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)單個(gè)病灶直徑≤3 cm；(2)巴塞羅那臨床(BCLC)分期為0/A期；(3)不適合手術(shù)切除或者患者拒絕手術(shù)切除治療；(4)接受RFA作為首次治療。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)Child-Pugh分級(jí)為C級(jí)；(2)合并其他惡性腫瘤或嚴(yán)重心腦血管病等；(3)2周內(nèi)服用過抗炎藥物；(4)隨訪資料不全或圍術(shù)期死亡；(5)隨訪時(shí)間<3個(gè)月。

1.2 研究方法 收集RFA前1周內(nèi)的數(shù)據(jù)。一般資料：性別、年齡、BMI；病因?qū)W資料：HBV、HCV、代謝相關(guān)脂肪性肝病(MAFLD)和乙醇攝入等；實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)：血常規(guī)、肝功能、腎功能、AFP等；影像學(xué)資料：CT、磁共振成像(MRI)、腹部彩超、超聲造影等。

1.3 RFA方案 在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮射頻消融。嚴(yán)格按照《2011 CSLC/CSCO/CMA肝癌射頻消融治療規(guī)范的專家共識(shí)》流程進(jìn)行?；颊咴诖┐滩课唤邮?%鹽酸利多卡因治療，并靜脈滴注50 mg鹽酸哌替啶與50 mL 5%葡萄糖水混合。手術(shù)過程中持續(xù)監(jiān)測(cè)心血管和呼吸系統(tǒng)。對(duì)于所有腫瘤，消融邊緣至少應(yīng)達(dá)到腫瘤邊緣以外5 mm。完全消融定義為肝臟動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI/CT或超聲造影提示腫瘤所在區(qū)域?yàn)榈兔芏?超聲表現(xiàn)為高回聲)，動(dòng)脈期無強(qiáng)化。術(shù)后28 d復(fù)查動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI/CT及動(dòng)脈造影評(píng)估腫瘤是否完全消融。對(duì)于未完全消融者再次消融，直至腫瘤完全反應(yīng)。

1.4 患者隨訪 本研究的目標(biāo)事件為無復(fù)發(fā)生存(recurrence free survival, RFS)和總生存(overall survival，OS)。RFS時(shí)間定義為從RFA術(shù)后到首次復(fù)發(fā)或死亡之間的時(shí)間。OS定義為從RFA術(shù)后到患者死亡或隨訪截止日期之間的時(shí)間。完全消融后，患者前2年內(nèi)，每3個(gè)月復(fù)查1次AFP及動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI/CT、超聲造影等，之后每半年監(jiān)測(cè)1次上述指標(biāo)，如動(dòng)態(tài)增強(qiáng)MRI/CT和/或超聲造影提示原病灶周圍或者肝內(nèi)遠(yuǎn)處出現(xiàn)動(dòng)脈期異常強(qiáng)化影，門脈期及平衡期密度降低，伴或不伴AFP升高，考慮腫瘤復(fù)發(fā)，記錄復(fù)發(fā)腫瘤的位置、數(shù)目、大小、有無血管侵犯等。通過多學(xué)科會(huì)診綜合評(píng)估患者情況，給予針對(duì)肝癌復(fù)發(fā)的相關(guān)治療。治療后繼續(xù)隨訪，直至患者死亡或研究截止日期2021年6月30日。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 22.0軟件及R語言4.0.3進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料組間比較采用χ2檢驗(yàn)。運(yùn)用X-tile工具以5年生存率及RFS率為結(jié)局事件，采用“枚舉法”確定NLR、RLR和LMR的最佳截?cái)嘀礫12]。使用Kaplan-Meier方法繪制生存曲線，并采用log-rank檢驗(yàn)比較復(fù)發(fā)及生存的組間差異。單因素分析采用log-rank檢驗(yàn)，將log-rank檢驗(yàn)分析中具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的因素納入多因素Cox回歸分析以確定RFS率與OS率的危險(xiǎn)因素，計(jì)算風(fēng)險(xiǎn)比(HR)及其95%CI。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般資料 132例患者中男性96例，平均年齡(58.50±9.66)歲。利用患者數(shù)據(jù)對(duì)5年OS和RFS進(jìn)行X-tile分析，確定NLR、RLR和LMR的最佳截?cái)嘀捣謩e為4.1、18.3和6(圖1～3)。根據(jù)NLR、RLR、LMR分組與OS及RFS的相關(guān)性，將NLR、RLR及LMR按積分計(jì)算(表1)，根據(jù)N-R-L評(píng)分的得分情況將患者分為3組：N-R-L 0分組，N-R-L 1分組和N-R-L 2分組，并將其作為OS和RFS的預(yù)后指標(biāo)。3組患者Child-Pugh分級(jí)、Alb比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)(表2)。

注：a，OS面板圖；b，OS人數(shù)分布直方圖；c，NLR組OS比較；d，RFS面板圖；e，RFS人數(shù)分布直方圖；f，NLR組RFS比較。

注：a，OS面板圖；b，OS人數(shù)分布直方圖；c，RLR組OS比較；d，RFS面板圖；e，RFS人數(shù)分布直方圖；f，RLR組RFS比較。圖2 對(duì)患者5年OS和RFS進(jìn)行X-tile分析以確定RLR的最佳截?cái)嘀礔igure 2 X-tile analysis of 5-year OS and RFS was performed to determine the best cutoff value of RLR

注：a，OS面板圖；b，OS人數(shù)分布直方圖；c，LMR組OS比較；d，RFS面板圖；e，RFS人數(shù)分布直方圖；f，LMR組RFS比較。圖3 對(duì)患者5年OS和RFS進(jìn)行X-tile分析以確定LMR的最佳截?cái)嘀礔igure 3 X-tile analysis of 5-year OS and RFS was performed to determine the best cutoff value of LMR

表1 N-R-L評(píng)分的計(jì)分及分組方式Table 1 Scoring and grouping of N-R-L score

2.2 RFA術(shù)后的復(fù)發(fā)和生存 中位隨訪時(shí)間為34個(gè)月(5～111個(gè)月)。所有患者的1、3和5年RFS率分別為64.3%、40.0%和21.5%，中位RFS為26個(gè)月；1、3和5年OS率分別為97.6%、82.1%和69.8%。N-R-L 0分組、N-R-L 1分組和N-R-L 2分組的1、3和5年RFS率分別為76.9%、52.5%、33.3%，42.9%、13.1%、0和11.1%、0、0(χ2=35.345，P<0.000 1)(圖4)；3組的1、3和5年OS率分別為100%、96.3%、90.7%，96.6%、60.4%、41.3%和81.8%、46.8%、15.6%(χ2=38.460，P<0.000 1)(圖4)。N-R-L 0分組、N-R-L 1分組和N-R-L 2分組的中位RFS分別為38個(gè)月、10個(gè)月和5個(gè)月，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=35.345，P<0.000 1)。

2.3 RFS率的預(yù)測(cè)因素 對(duì)患者RFA術(shù)前相關(guān)指標(biāo)進(jìn)行單因素及多因素分析，以確定RFS率的預(yù)測(cè)因素(表3)。log-rank檢驗(yàn)結(jié)果顯示，男性、Child-Pugh B級(jí)、腫瘤直徑≥2 cm、TBil>20 μmol/L、Alb>35 g/L、ALBI分級(jí)2/3級(jí)以及N-R-L評(píng)分1/2分與RFS率顯著相關(guān)(P值均<0.05)。進(jìn)一步行多因素Cox回歸分析結(jié)果表明，腫瘤直徑≥2 cm(HR=2.10, 95%CI: 1.28～3.43，P=0.003)、N-R-L評(píng)分1分(HR= 3.14, 95%CI: 1.81～5.46，P<0.000 1)以及N-R-L評(píng)分2分(HR=2.61, 95%CI: 1.06～6.42，P=0.037)是RFS率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P值均<0.05)。

2.4 OS率的預(yù)測(cè)因素 表4總結(jié)了RFA術(shù)后OS率的預(yù)測(cè)因素。log-rank檢驗(yàn)結(jié)果提示Child-Pugh B級(jí)、腫瘤直徑≥2 cm、TBil>20 μmol/L、Alb>35 g/L、ALBI分級(jí)2/3級(jí)以及N-R-L評(píng)分1/2分與OS顯著相關(guān)。多因素Cox回歸結(jié)果表明，腫瘤直徑≥2 cm(HR=3.67, 95%CI: 1.58 ～ 8.52，P=0.002)、N-R-L評(píng)分1分(HR=8.27, 95%CI: 3.15 ～ 21.71，P<0.000 1)以及N-R-L評(píng)分2分(HR=14.59, 95%CI: 3.96 ～ 53.78，P<0.000 1)是OS率的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

表2 術(shù)前N-R-L分組患者的臨床特征Table 2 Clinical characteristics of patients in preoperative N-R-L group

圖4 RFA術(shù)后N-R-L分組的RFS率和OS率比較Figure 4 Comparison of RFS and OS in N-R-L group after RFA表3 Cox回歸分析RFS率的影響因素Table 3 Results of RFS by Cox regression analysis

變量單因素分析HR (95%CI)P值多因素分析HR (95%CI)P值性別(男/女)1.97(1.14～3.40)0.0151.55(0.87～2.76)0.136BMI(≥24 kg/m2/<24 kg/m2)1.22(0.77～1.92)0.402MAFLD(是/否)1.03(0.65～1.61)0.916Child-Pugh分級(jí)(B級(jí)/A級(jí))2.58(1.50～4.45)0.0011.28(0.56～2.91)0.564腫瘤直徑(≥2 cm/<2 cm)2.28(1.43～3.62)0.0012.10(1.28～3.43)0.003BCLC分期(A期/0期)2.06(0.89～4.75)0.090ALT(>50 U/L/≤50 U/L)1.41(0.78～2.57)0.260AST(>40 U/L/≤40 U/L)1.63(0.98～2.70)0.058TBil(≤20 μmol/L/>20 μmol/L)1.69(1.07～2.65)0.0241.60(0.96～2.67)0.074Alb(<35 g/L/≥35 g/L)2.45(1.45～4.12)0.0011.01(0.44～2.32)0.974AFP(>400 ng/mL/≤400 ng/mL)0.81(0.33～2.01)0.650ALBI分級(jí)(ref: 1級(jí)) 2級(jí)1.25(0.79～2.00)0.3410.92(0.49～1.70)0.781 3級(jí)4.15(1.61～10.70)0.0031.91(0.48～7.59)0.356MELD評(píng)分(>9分/≤9分)1.44(0.91～2.28)0.124N-R-L得分(ref: 0分) 1分3.13(1.89～5.20)<0.000 13.14(1.81～5.46)<0.000 1 2分4.99(2.40～10.37)<0.000 12.61(1.06～6.42)0.037

表4 Cox回歸分析OS率的影響因素Table 4 Results of OS by Cox regression analysis

3 討論

多項(xiàng)研究表明，對(duì)于不可切除的早期小肝癌， RFA能提供良好的治療效果。本研究選取了單發(fā)直徑≤3 cm的早期/極早期HCC患者，將RFA作為首次治療方法。在整個(gè)隨訪期內(nèi)，共有77例(58.3%)復(fù)發(fā)，29例(22%)死亡，與先前研究[4,13-14]結(jié)果類似。所有患者接受RFA治療后，僅3例患者出現(xiàn)輕微并發(fā)癥，經(jīng)治療后均好轉(zhuǎn)，沒有患者出現(xiàn)嚴(yán)重并發(fā)癥，表明RFA安全性較高，更具成本效益。

評(píng)估了RFA率與OS率的危險(xiǎn)因素，發(fā)現(xiàn)腫瘤直徑≥2 cm、N-R-L評(píng)分1分及2分與患者不良預(yù)后獨(dú)立相關(guān)。HCC的復(fù)發(fā)及預(yù)后的差異與初始腫瘤大小相關(guān)已經(jīng)在先前的研究[15-16]中被證實(shí)。在HCC的發(fā)生發(fā)展中，隨著病灶直徑的增加，微浸潤(rùn)的發(fā)生率明顯增加，這可能是HCC治療后復(fù)發(fā)的重要原因。研究[4]表明，對(duì)于直徑≤3 cm的HCC患者，HCC≥2 cm的微轉(zhuǎn)移和微血管浸潤(rùn)更明顯。另外，腫瘤直徑增大可能造成消融不徹底，殘存的微病灶直接導(dǎo)致復(fù)發(fā)，這些結(jié)果均會(huì)影響患者的生存預(yù)后。

炎癥在腫瘤發(fā)生發(fā)展的各個(gè)階段均發(fā)揮重要作用，可驅(qū)動(dòng)腫瘤的發(fā)生、生長(zhǎng)、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移等重要過程[17-18]。除了局部腫瘤微環(huán)境外，全身性炎癥反應(yīng)通過干擾組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)從而影響腫瘤的發(fā)展，特別是腫瘤的轉(zhuǎn)移[19]。血常規(guī)作為反映全身炎癥反應(yīng)最普遍的工具，在臨床廣泛應(yīng)用且易于獲取。單獨(dú)的血細(xì)胞計(jì)數(shù)可能與整體預(yù)后沒有顯著關(guān)系，但由這些細(xì)胞計(jì)數(shù)組合產(chǎn)生的全身炎癥標(biāo)志物如NLR、RLR和LMR等被認(rèn)為是各類癌癥的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素。

淋巴細(xì)胞是機(jī)體免疫監(jiān)視和免疫應(yīng)答的重要組成成分，參與腫瘤的免疫反應(yīng)，特別是在抗腫瘤增殖和轉(zhuǎn)移的過程[20]。淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)增加與癌癥患者預(yù)后良好相關(guān)[21]，而淋巴細(xì)胞數(shù)量減少和功能抑制可能會(huì)削弱腫瘤特異性免疫，造成利于腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的環(huán)境，進(jìn)而影響患者預(yù)后[22-23]。中性粒細(xì)胞可直接釋放炎癥因子，促進(jìn)腫瘤血管生成，加速腫瘤的生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[24]。NLR是反映中性粒細(xì)胞促腫瘤特性與淋巴細(xì)胞抗腫瘤宿主免疫反應(yīng)之間平衡的一個(gè)因素，但在炎癥環(huán)境下，隨著中性粒細(xì)胞增加和淋巴細(xì)胞減少，這一平衡被打破，直接導(dǎo)致機(jī)體抗腫瘤能力下降。這提示機(jī)體處于抗腫瘤免疫抑制狀態(tài)，炎癥反應(yīng)將向促腫瘤進(jìn)展方向發(fā)展，最終導(dǎo)致患者預(yù)后不良。另外，炎癥可以刺激單核細(xì)胞到外周血，進(jìn)而被招募到腫瘤組織并分化為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞，進(jìn)一步與腫瘤細(xì)胞相互作用促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[25-26]。紅細(xì)胞分布寬度(red blood cell distribution width, RDW )反映了紅細(xì)胞在循環(huán)中體積分布的變化。有研究[27]表明RDW升高與HCC患者無病生存率較低和OS率較差相關(guān)。而作為RDW與淋巴細(xì)胞比值, RLR升高已被證明能夠預(yù)測(cè)肝功能衰竭和結(jié)腸癌的不良預(yù)后，并與肝硬化的嚴(yán)重程度相關(guān)[9-10,28]。

與先前結(jié)果一致，本研究亦明確了NLR、RLR和LMR在早期小肝癌RFA后的預(yù)后價(jià)值。由于先前研究對(duì)于上述炎癥標(biāo)志物的分組尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，本研究采用X-tile工具基于患者5年OS及RFS計(jì)算出3個(gè)指標(biāo)的最佳截?cái)嘀捣謩e為4.1、18.3和6，據(jù)此分組后三者在患者RFS及OS方面均表現(xiàn)出優(yōu)異的預(yù)后價(jià)值，特別是將三者結(jié)合后得到的N-R-L評(píng)分，在N-R-L評(píng)分≥1與早期HCC首次RFA后的早期復(fù)發(fā)和預(yù)后不良顯著相關(guān)，因此可作為早期HCC患者RFA治療預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)后生物標(biāo)志物。

另外，本研究的大多數(shù)患者為HBV或HCV相關(guān)HCC，機(jī)體本身存在慢性持續(xù)性炎癥。腫瘤相關(guān)炎癥反應(yīng)刺激炎癥介質(zhì)的釋放，加之血細(xì)胞計(jì)數(shù)異常所致的抗腫瘤免疫功能下降，為腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移提供有利條件。提示炎癥反應(yīng)越明顯，N-R-L評(píng)分越高，患者預(yù)后也越差。

總之，全身炎癥反應(yīng)標(biāo)志物N-R-L評(píng)分作為一種簡(jiǎn)單、易于獲取且成本極低的指標(biāo)，有望成為有用的無創(chuàng)生物標(biāo)志物，用以預(yù)測(cè)早期HCC患者RFA術(shù)后的復(fù)發(fā)和生存。

倫理學(xué)聲明：本研究于2019年12月25日通過天津市第二人民醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批號(hào)：[2019]58。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：楚偉可負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，數(shù)據(jù)收集分析，撰寫論文；吳雪、張鵬、馮婧、牛斌、周輝參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；宓余強(qiáng)負(fù)責(zé)指導(dǎo)寫作思路；李萍負(fù)責(zé)擬定寫作思路，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。