偶繹顏， 崔娜娜， 李 瑤， 錢其煒， 馬 雄， 尤征瑞， 連 敏， 王綺夏

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院 消化內(nèi)科， 上海市消化疾病研究所， 上海 200001

原發(fā)性膽汁性膽管炎(PBC)是一種以漸進(jìn)性肝內(nèi)小葉間膽管破壞為特征的自身免疫性肝病[1]。好發(fā)于中老年女性，多數(shù)患者可出現(xiàn)血清ALP、GGT升高以及乏力、瘙癢等癥狀[2-3]。近90%～95%的患者血清抗線粒體抗體陽性[4]。人體外周血的中性粒細(xì)胞數(shù)量多、壽命短，具有向炎癥部位遷移的能力。同時，還具有吞噬、脫顆粒以及新近發(fā)現(xiàn)的釋放中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)(neutrophil extracellular traps，NET)功能[5]。上述特征使之成為人體固有免疫系統(tǒng)的重要組成部分。中性粒細(xì)胞可以在感染和無菌性炎癥的條件下，通過鈣動員或產(chǎn)生活性氧的分子機(jī)制形成NET，這種產(chǎn)生NET的方式是不同于凋亡和壞死的NETosis形式[6]。NET是由組蛋白和抗菌肽等修飾的DNA構(gòu)成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，越來越多研究[7-9]表明NET與炎癥或者自身免疫性疾病有關(guān)，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎以及炎癥性腸病等。本研究旨在探索NET與PBC之間的相關(guān)性，為臨床診治提供新思路。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取2016年8月—2020年8月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院消化內(nèi)科診斷為PBC的患者24例以及與PBC患者年齡相匹配的自身免疫性肝炎(AIH)患者19例、原發(fā)性硬化性膽管炎(PSC)患者8例和健康對照(HC)18例。其中，PBC的診斷符合《原發(fā)性膽汁性肝硬化(又名原發(fā)性膽汁性膽管炎)診斷和治療共識(2015)》[10]，AIH的診斷符合國際自身免疫性肝炎學(xué)組制定的AIH簡化診斷積分系統(tǒng)[11]，PSC的診斷符合《原發(fā)性硬化性膽管炎診斷和治療專家共識(2015)》[12]。

1.2 臨床資料 收集PBC、AIH、PSC患者和HC組的人口學(xué)基本資料。此外，PBC患者進(jìn)一步收集病史資料以及實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，包括肝生化指標(biāo)、自身免疫相關(guān)抗體和血清免疫球蛋白等。后續(xù)對PBC患者的上述實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)與NETosis標(biāo)志物髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 分離中性粒細(xì)胞 采用EDTA抗凝管抽取PBC患者和HC組全血2 mL，利用密度梯度離心法提取中性粒細(xì)胞。向15 mL離心管中順次加入人中性粒細(xì)胞分離液Histopaque-1119、Histopaque-1077(美國Sigma公司)和全血，1850 r/min離心30 min，對中性粒細(xì)胞進(jìn)行分離。吸取第二層懸浮細(xì)胞，然后用裂紅液(美國Sigma公司)進(jìn)行裂紅，用RPRI1640洗滌、重懸。顯微鏡下計數(shù)、流式檢測中性粒細(xì)胞的純度及活率[13]。

1.3.2 檢測NET形成水平 從PBC患者和HC組外周血中按上述方法分離出中性粒細(xì)胞后，以約2×104個細(xì)胞分別加入48孔培養(yǎng)板中，每孔加入200 μL細(xì)胞懸液，以終濃度100 ng/mL的佛波酯(phorbol 12-myristate 13-acetate，PMA)加入陽性對照組[14-15]。同時，在陽性對照組及空白組加入終濃度250 nmol/L的Sytox green(美國Invitrogen公司)。37 ℃恒溫條件下孵育4 h，用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。

1.3.3 檢測血清對NET生成的影響 分離HC組外周血中性粒細(xì)胞，約2×104個細(xì)胞加入48孔培養(yǎng)板，分為兩組：一組加入10%的HC血清，另一組加入PBC患者血清，兩組皆加入終濃度250 nmol/L的Sytox green，在37 ℃進(jìn)行孵育[16]，4 h后進(jìn)行觀察。

1.3.4 ELISA法檢測血清中MPO水平 收集PBC、AIH、PSC患者和HC組的血清，保存在-80 ℃冰箱。實(shí)驗(yàn)前將血清恢復(fù)至室溫，混勻并離心，取上層清液，采用ELISA法(MPO檢測試劑盒，貨號SEA601Hu，武漢云克隆公司)測定MPO水平。

1.3.5 肝組織免疫熒光檢測 收集PBC患者和HC組肝組織冰凍樣本各5例(HC的肝組織來源于本院行肝血管瘤切除術(shù)時的正常肝組織)，制成切片后依次用甲酸通透、PBS洗滌、驢血清封閉，然后滴加一抗(抗MPO抗體：貨號AF3667，美國R&D Systems公司；抗組蛋白H3抗體：貨號ab5103, 美國Abcam公司)，4 ℃濕盒過夜。次日復(fù)溫1 h后，PBS洗滌，滴加與一抗結(jié)合的二抗，室溫孵育30 min。PBS洗滌，滴加DAPI染細(xì)胞核，蓋上蓋玻片。制片完成后在熒光共聚焦顯微鏡下進(jìn)行觀察。

2 結(jié)果

2.1 PBC患者外周血NETosis的標(biāo)志物升高 各組年齡分別為(44.67±13.51)歲、(45.63±11.64)歲、(40.63±14.00)和(47.33±9.00)歲。HC、AIH和PBC組患者均為女性；PSC組中女性4例，男性4例。PBC組血清中的MPO水平[811.21(450.67～1 216.20)ng/mL]較AIH組[468.58(142.63～812.43)ng/mL]和HC組[357.54(203.52～811.21)ng/mL]明顯升高(P值均<0.05);提示在PBC患者外周血中，NET的產(chǎn)生量顯著增加。PSC患者血清中MPO水平[763.56(489.59～1 633.14)ng/mL]也較HC組顯著升高(P<0.05)(圖1a)。進(jìn)一步分析PBC相關(guān)抗體表達(dá)與MPO水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示均無顯著性差異(P值均>0.05)(圖1b～f)。

2.2 NET的含量與肝臟生化指標(biāo)的相關(guān)性 結(jié)果表明，隨著外周血NET水平的升高，ALP、GGT、AST、ALT皆呈現(xiàn)上升趨勢，其他指標(biāo)則不存在顯著相關(guān)性，提示GGT、ALP、AST、ALT水平的升高與NET水平在疾病狀態(tài)下升高存在正相關(guān)(P值均<0.05)(表1，圖2)。

2.3 PBC患者肝組織內(nèi)存在NET NET在人體組織內(nèi)的表達(dá)可以由MPO和瓜氨酸組蛋白H3(cit histone H3, H3Cit)共定位來明確[17]。通過免疫熒光共聚焦方法觀察到PBC患者的肝組織中存在MPO和H3Cit的共定位，而在HC組的肝組織中則沒有觀察到二者的共定位(圖3)。

表1 PBC患者肝臟生化指標(biāo)基本資料Table 1 Basic information of liver biochemical indicatorsin PBC patients

注:a，4組血清中MPO水平；b，PBC患者血清線粒體抗體(AMA)陽性或陰性者M(jìn)PO水平；c，PBC患者血清抗2-丙酮酸脫氫酶(M2-3E)抗體陽性或陰性者M(jìn)PO水平；d，PBC患者血清抗線粒體-M2型抗體(M2)陽性或陰性者M(jìn)PO水平；e，PBC患者血清抗斑點(diǎn)蛋白抗體(sp100)陽性或陰性者M(jìn)PO水平； f，PBC患者血清抗糖蛋白210抗體(gp210)陽性或陰性者M(jìn)PO水平。

圖2 MPO水平與PBC患者肝功能和IgM的相關(guān)性分析Figure 2 Correlation analysis of MPO level with liver functionand immunoglobulin M in PBC patients

注：a，PBC組；b，HC組；藍(lán)色(DAPI)；紅色(MPO)；綠色(H3Cit)。圖3 肝組織中免疫熒光共聚焦定位NETFigure 3 Immunofluorescence confocal localization of NETin liver

2.4 PBC患者的外周血中性粒細(xì)胞有更強(qiáng)的NET產(chǎn)生能力 分別分離出PBC患者和HC的外周血中性粒細(xì)胞，37 ℃孵育4 h，作為空白對照。同時，在兩組中性粒細(xì)胞中都加入等量PMA，37 ℃刺激4 h，作為陽性對照。無論空白對照組還是陽性對照組，PBC患者的中性粒細(xì)胞都能產(chǎn)生更多的NET。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示PBC患者的外周血中性粒細(xì)胞有更強(qiáng)的NET產(chǎn)生能力和自發(fā)產(chǎn)生NET的傾向(圖4)。此外，除去對中性粒細(xì)胞自身NET產(chǎn)生能力的觀察，本研究同時探索了PBC患者血清在NET產(chǎn)生過程中發(fā)揮的作用。將分離出的HC外周血中性粒細(xì)胞分別用HC血清和PBC血清進(jìn)行處理。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在10%血清的孵育下，PBC患者的血清較HC的血清更易刺激中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET。提示PBC患者的血清中存在某些物質(zhì)或可促進(jìn)中性粒細(xì)胞NET的產(chǎn)生(圖5)。

注：a，HC組外周血中性粒細(xì)胞空白組；b，PBC組外周血中性粒細(xì)胞空白組；c，HC組外周血中性粒細(xì)胞PMA組； d，PBC組外周血中性粒細(xì)胞PMA組。

3 討論

自身免疫肝病涉及多種免疫細(xì)胞，疾病早期可有肝臟內(nèi)中性粒細(xì)胞聚積的現(xiàn)象[18]。在肝臟炎癥中，中性粒細(xì)胞浸潤膽管數(shù)量與疾病進(jìn)展和膽汁淤積呈正相關(guān)[19]。

注：a，外周血中性粒細(xì)胞加10%健康人血清孵育后；b，外周血中性粒細(xì) 胞加10%PBC患者血清孵育后。

NET在其他自身免疫性疾病中的存在及其相關(guān)性提示它在疾病發(fā)生發(fā)展中起著關(guān)鍵作用[20-22]。目前尚未有研究闡明NET在PBC中的具體作用，筆者觀察到NET的產(chǎn)生與PBC患者血清ALP、GGT、AST和ALT水平升高存在正相關(guān)。NET是以DNA為骨架，MPO、中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)、組蛋白等蛋白質(zhì)附著形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，是新近發(fā)現(xiàn)的中性粒細(xì)胞參與機(jī)體免疫的形式。筆者采用ELISA法檢測研究對象血清MPO水平來評估NET的含量。雖然這種方法存在一定局限性，但有研究同時使用多指標(biāo)評估NET水平，疾病組與對照組之間各指標(biāo)的趨勢一致，且以MPO作為衡量NET水平時，疾病組與健康對照組之間差異更為顯著[23]。肝組織免疫熒光共聚焦的結(jié)果也提示在PBC患者肝臟中有更多的NET產(chǎn)生，在健康對照組則很少呈現(xiàn)NET產(chǎn)生。上述結(jié)果或可為緩解PBC患者膽汁淤積提供新的治療角度。

在白塞病、系統(tǒng)性紅斑狼瘡等疾病中[24-25]，中性粒細(xì)胞自發(fā)產(chǎn)生NET的能力增加，本研究也對PBC患者中性粒細(xì)胞NET產(chǎn)生能力進(jìn)行了檢測。中性粒細(xì)胞在發(fā)生NETosis時，細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)被破壞，活細(xì)胞染料Sytox green可以通過受損胞膜進(jìn)入胞質(zhì)，將染色質(zhì)著色。對于胞膜結(jié)構(gòu)完整的細(xì)胞，則無法進(jìn)行核質(zhì)的染色。筆者觀察到PBC患者的中性粒細(xì)胞在無刺激的條件下自發(fā)產(chǎn)生的NET高于HC組；進(jìn)一步PMA刺激后，PBC患者NET的產(chǎn)生量仍高于HC組。這些結(jié)果提示，PBC患者的中性粒細(xì)胞無論是自發(fā)產(chǎn)生NET的傾向還是在接受外界刺激時產(chǎn)生NET的能力均較HC組更強(qiáng)。近年的研究表明，NET的過量產(chǎn)生和清除障礙參與了多種肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展，包括缺血再灌注損傷、急/慢性肝衰竭等[26]。除了中性粒細(xì)胞本身產(chǎn)生NET的能力和傾向的增強(qiáng)，PBC患者體內(nèi)是否存在某些因素可以激發(fā)中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET也是需要關(guān)注的問題。筆者猜測PBC患者的血清中可能存在某些物質(zhì)促進(jìn)了中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET，但是與PMA刺激相比，血清對中性粒細(xì)胞產(chǎn)生NET的刺激強(qiáng)度較弱。促進(jìn)和抑制或者降解NET的成分達(dá)到平衡狀態(tài)，可以維持正常生理狀態(tài)下人體內(nèi)很少的NET產(chǎn)生量。但PBC患者體內(nèi)可能由于刺激產(chǎn)生NET的物質(zhì)增加或者抑制及降解NET的物質(zhì)減少，導(dǎo)致二者間平衡被打破，中性粒細(xì)胞進(jìn)而產(chǎn)生了更多的NET，相關(guān)機(jī)制后續(xù)將進(jìn)一步探究。

倫理學(xué)聲明：本研究取得所有受試者知情同意，并于2020年8月7日獲得上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會的批準(zhǔn)，批號：SK2020-003。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：偶繹顏負(fù)責(zé)所有實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)分析、撰寫論文；崔娜娜負(fù)責(zé)收集分析病例資料和ELISA實(shí)驗(yàn)；李瑤、錢其煒參與數(shù)據(jù)收集；馬雄、尤征瑞負(fù)責(zé)課題設(shè)計；王綺夏、連敏負(fù)責(zé)課題設(shè)計，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。