曹夢雨，桑世飛，王亞男，周靜，王君怡，張文玲，姬生棟

(1.河南師范大學 生命科學學院，河南 新鄉(xiāng) 453007;2.河南省種子管理站，鄭州450046)

磷脂酶是植物磷脂信號網絡的重要成分，目前植物中已經鑒定出4種形式的磷脂酶[1]，參與調控植物體內的多種生理過程，并對各種生物與非生物脅迫作出相應的響應.磷脂酶家族基因(OsPLX)可從多個途徑參與非生物脅迫信號和發(fā)育事件[2]，如大豆磷脂酶C基因GmPLC10具有耐干旱的作用，能幫助植物有效抵御干旱脅迫[3]，擬南芥磷脂酶C2參與擬南芥的細胞凋亡及丁香假單胞菌(Pseudomonassyringae)病原體的攻擊[4]，擬南芥磷脂酶D1和磷脂酶D2則與植物響應鹽堿脅迫相關[5].在擬南芥磷脂酶基因家族的研究中，諸多研究都提出了磷脂酶參與許多信號網絡和調控細胞的過程，如應激信號和耐受性[6]，顯然作為磷脂酶家族相關基因，在水稻中很可能也參與這些代謝調控.

水稻磷脂酶A家族的OspPLAIIβ基因編碼花粉特異性磷脂酶，其突變體具備誘導水稻形成單倍體的功能[7].過表達OspPLAIIIα基因會導致水稻表現(xiàn)出半矮化，同時引起莖、根、葉、種子以及穗的長度降低，機械強度下降，還會導致組織中的纖維素含量降低，影響到了植株發(fā)育，而OspPLAIIIα基因敲除系卻具有更長的穗和籽粒[8].OspPLAIIIδ是直立型密穗基因，與野生型相比，OspPLAIIIδ基因突變系的穗從生長到成熟一直能夠保持直立，穗粒形狀大小及穗長都發(fā)生了變化[9].磷脂酶C家族中的OsNPC1基因具有組成型表達的特征，與野生型相比，水稻中過表達OsNPC1基因會使植株表現(xiàn)出莖節(jié)較脆，莖節(jié)中硅含量降低，但穎殼中硅含量增加，穗莖尖較脆，落粒性增加的特征[10].磷脂酶D亞家族的OsPLDα4和OsPLDα5基因均受二化螟、機械損傷和JA處理的誘導表達[11].抑制OsPLDβ1表達的植株在發(fā)育后期表現(xiàn)出類似超敏反應的細胞死亡以及植物抗毒素的積累，在沒有病原菌侵染的情況下可自發(fā)激活防御反應，并且OsPLDβ1通過負調節(jié)防御反應來參與水稻的抗病性[12].OsPLDα基因在植物響應鹽脅迫過程中通過調節(jié)H+-ATPase的活性和表達來影響水稻對鹽的耐受性[13].目前磷脂酶A亞家族更傾向參與到植物的生長發(fā)育，而磷脂酶D亞家族在逆境脅迫方面扮演了重要角色.然而擬南芥磷脂酶A IIA則參與到生物與非生物脅迫[14]，表明磷脂酶基因家族基因的功能在進化中可能出現(xiàn)了一定分化.以往關于磷脂酶家族基因的研究工作多集中在模式植物擬南芥和其他一些雙子葉植物中，對單子葉植物中磷脂酶基因的報道較少，借助同源比對方法對水稻磷脂酶家族基因進行生物信息學分析，為深入研究水稻磷脂酶家族基因功能提供參考.

1 材料和方法

1.1 水稻磷脂酶家族基因鑒定及理化性質分析

從RiceData數據庫搜索并下載磷脂酶家族基因的編碼區(qū)序列.在RGAP水稻數據庫將已下載的磷脂酶家族核苷酸序列采用同源搜索的方法，BLAST水稻蛋白質模型數據庫，篩選標準為相似度大于40%，覆蓋度大于40%，搜索的E值設為10-5，獲得水稻磷脂酶家族基因及同源基因.利用ExPASy-ProtParam tool獲得磷脂酶家族基因的分子量、等電點和氨基酸數目.通過TMHMM在線分析蛋白質序列的跨膜區(qū)[15].利用ProtComp v.9.0軟件對磷脂酶家族蛋白進行亞細胞定位分析[16].

1.2 水稻磷脂酶家族基因生物信息學分析

基因進化及基序分析采用MEGA-X軟件中的Clustal W對磷脂酶家族的蛋白質序列進行比對，采用極大似然法將比對后的序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，bootstrap參數設置為1 000[17].通過MEME在線分析磷脂酶家族蛋白質序列的基序種類與特征[18].通過Ensembl Plants 網站獲得水稻12條染色體的長度數據，在RiceData網站搜索獲得磷脂酶家族基因的起始位點，最后使用MapChart 2.32繪制磷脂酶家族基因在染色體上的定位圖[19].利用Rice eFP Browser網站(http://bar.utoronto.ca/efprice/cgi-bin/efpWeb.cgi)公布的水稻(亞種.indica var IR64)材料的轉錄組數據，調取穗和種子發(fā)育過程中不同階段的磷脂酶家族基因的表達量數據，進行標準化的處理，采用Heml軟件得到磷脂酶家族基因的組織表達譜熱圖[20].

2 結果和分析

2.1 OsPLX家族基因全基因組篩選與理化性質分析

從RiceData網站搜索并下載磷脂酶家族的基因登錄號、基因名稱以及CDS序列，并根據水稻已知的OsPLX蛋白序列，在RGAP水稻數據庫檢索所有水稻中的直系同源基因，共計獲得了64個OsPLX基因家族成員(表1).理化性質分析發(fā)現(xiàn)OsPLX家族基因長度為402～3 801 bp，編碼氨基酸序列為133～1 266個，蛋白質分子質量大約在14.09～134.36 kDa之間，蛋白質等電點在4.977～12.12之間(表1).

表1 64個磷脂酶家族基因的理化信息

將上述初步篩選出的 64個蛋白序列進一步用 ProtComp v9.0 軟件進行分析，共預測到37個信號肽分泌至胞外，3個轉運至液泡膜，2個轉運到了葉綠體膜，1個轉運至高爾基體膜，12個轉運至細胞質，9個轉運至細胞質膜.通過TMHMM在線網站對磷脂酶家族蛋白的跨膜序列區(qū)分析發(fā)現(xiàn)，水稻中已經鑒定出的64個磷脂酶基因中只有8個基因所編碼的蛋白質含有跨膜區(qū). LOC_Os08g01310、LOC_Os06g49860、LOC_Os04g36710、LOC_Os03g50030、LOC_Os04g35100和LOC_Os04g59310等6個基因編碼的蛋白中各含有1個跨膜區(qū)；基因LOC_Os03g50030所編碼蛋白中的跨膜區(qū)較大；基因LOC_Os06g18930 編碼的蛋白中含有18個較小的跨膜區(qū)；基因LOC_Os01g67310所編碼蛋白含有3個跨膜區(qū).

利用MEME在線網站分析磷脂酶家族蛋白序列的基序種類與特征，發(fā)現(xiàn)所有的蛋白質都含有相同的3個保守基序：基序1為氨基酸序列IYIENQYF;基序2為氨基酸序列IYIENQYF;基序3為氨基酸序列AAWDVLYNFEQRWRKQ.且親緣關系越近的磷脂酶家族基因，其編碼的蛋白基序結構相似度越高.

2.2 水稻磷脂酶家族基因染色體定位分析

利用MapChart 2.32對已鑒定的OsPLX家族基因進行染色體定位，分析發(fā)現(xiàn)家族基因在染色體的分析呈現(xiàn)出明顯的不均勻分布，不同染色體上的該家族基因的數目差別很大，如10號染色體含有一個磷脂酶基因；2號染色體上有3個磷脂酶基因；4號、5號、7號和12號染色體上有4個磷脂酶基因；9號和11號染色體上有5個磷脂酶基因；1號染色體上有6個磷脂酶基因； 3號染色體上有15個磷脂酶基因，各染色體上的磷脂酶家族基因表現(xiàn)出了明顯的不均衡性.

2.3 水稻磷脂酶家族基因OsPLX進化分析

根據磷脂酶家族基因OsPLX編碼的蛋白質序列，采用Mega X進行多序列比對并構建系統(tǒng)發(fā)育樹(圖1).從圖1的系統(tǒng)發(fā)育樹可知，家族基因編碼蛋白質被分為3個亞組(group),即亞組I(group1)、亞組II(group2)和亞組III(group3)，其中亞組I包含9個磷脂酶基因，包含了2個已經鑒定功能的磷脂酶OsPLA2類基因；亞組II包含25個磷脂酶基因，主要是OsPLA家族；亞組III包含29個磷脂酶基因，主要是OsPLC和OsPLD亞家族基因.

2.4 水稻磷脂酶家族組織特異性表達分析

對水稻中磷脂酶家族基因OsPLX在穗和種子發(fā)育過程中的全基因組分析、分類、時空基因表達及光和非生物脅迫的調控等相關數據進行處理，利用Heml軟件繪制磷脂酶家族的組織表達譜熱圖.結果表明(圖2)，磷脂酶家族基因并沒有表現(xiàn)出明顯的組織特異性，然而從整體來看，大多數的磷脂酶家族基因在各個組織的表達量都比較低，其中LOC_Os01g07760(OsPLDα),LOC_Os03g59620(OspPLAIVβ),LOC_Os03g61130(OsNPC1),LOC_Os07g49330,LOC_Os12g37560在水稻的生長發(fā)育過程中都維持相對較高的表達量；還有部分基因表現(xiàn)出了比較強的組織偏好性，比如LOC_Os06g40180(OsPLDα5)在根以及葉子花序中表達量較高；LOC_Os09g28770(OspPLAIIη)則在種子中的表達量非常的高；LOC_Os12g36610(OspPLAIIγ)和LOC_Os03g43880(OspPLAIIIβ)都只在幼根中高表達；LOC_Os12g36530(OspPLAIIk)則在花序中集中高表達.這些結果表明，磷脂酶家族基因在水稻生長發(fā)育中扮演了重要角色.

3 討 論

相對于NAC,WRKY,ARF,GH3等家族基因[21-23]，磷脂酶基因家族研究相對較少，越來越多的證據表明，植物細胞含有多種基于磷脂的信號通路，參與植物的生長發(fā)育與脅迫響應[24-25].在水稻磷脂酶A亞家族的研究中，SINGH等[2]通過對水稻全基因組鑒定，分析了磷脂酶A家族基因，發(fā)現(xiàn)水稻PLA家族基因在非生物脅迫信號傳遞和發(fā)育中可能具有重要作用.磷脂酶C亞家族的多個基因在干旱或者鹽脅迫條件下會得到誘導性表達[26]，研究表明在干旱條件下，植物會通過表達PLC基因來控制氣孔的開閉[27].在擬南芥研究中磷脂酶D被認為是抗性響應基因，在水稻中通過對2個定位于葉綠體的基因OsPLDa4和OsPLDa5研究發(fā)現(xiàn)，在受到二化螟的攝食、機械傷害以及茉莉酸(JA)處理時會誘導基因上調表達[28].YAO等[7]發(fā)現(xiàn)在水稻中OspPLAIIβ(OsMTL)基因編碼的花粉特異性磷脂酶能誘導水稻形成單倍體 ，關于該家族基因生物學功能的研究相對較少，綜合當前研究認為磷脂酶家族基因在參與逆境脅迫、抗病方面扮演了重要角色，這一點基本達成共識.但是家族基因是否會像OspPLAIIβ具有新的功能，是今后值得研究的問題.

本研究中的不同磷脂酶亞細胞定位預測表明，不同磷脂酶基因定位有所區(qū)別，說明磷脂酶基因在進化中出現(xiàn)了功能性分化.比如OspPLAIIβ基因能夠編碼花粉特異性磷脂酶，與玉米的ZmMATL基因同源，能誘導水稻形成單倍體[7].OsPLDβ1基因在植物響應生物和非生物脅迫的過程中發(fā)揮重要作用，抑制OsPLDβ1表達提高植株對水稻主要病原菌的抗性[12]，OsPLDα基因在植物響應脅迫中發(fā)揮正調控作用[11].磷脂酶家族基因間呈現(xiàn)出比較明顯的功能分化，OsPLD和OsPLC家族基因表現(xiàn)出了抗逆功能，而OsPLA基因的克隆數量偏少，A亞家族基因是否如OspPLAIIβ一般具有單倍體誘導功能還有待進一步的研究.本研究也發(fā)現(xiàn)，大多數磷脂酶家族基因組織特異性非常弱，基因在根、葉、花序、種子中屬于低表達，僅少部分基因在特定組織或者發(fā)育時期表現(xiàn)出較高的基因表達量，這些磷脂酶家族基因或許具備組織特異性功能.其中少數幾個在生長發(fā)育各個階段高表達的基因，如LOC_Os01g07760(OsPLDα),LOC_Os03g59620(OspPLAIVβ),LOC_Os03g61130(OsNPC1),LOC_Os07g49330,LOC_Os12g37560在維持水稻生長過程中可能具有重要作用.

綜合本研究結果，可對部分已經克隆基因的同源基因功能以及組織特異性高表達基因的功能做出初步的推測，為進一步分析研究水稻磷脂酶家族基因在水稻發(fā)育過程中的生物學功能提供參考.