周明 劉皇容 唐柳生 劉桑 劉愛梅

由結(jié)核分枝桿菌引起的結(jié)核病(tuberculosis，TB)是一種慢性傳染病，也是目前全球傳染病致死的重要原因，一線抗結(jié)核藥物治療仍是治療結(jié)核病的主要手段[1]，但隨著耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn)，終止結(jié)核病仍然是一種愿望，耐藥結(jié)核分枝桿菌的出現(xiàn)增加了結(jié)核病防治的難度[2]，并阻礙終止結(jié)核病目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)，迫切需要具有安全性的新型抗結(jié)核藥物來扭轉(zhuǎn)局勢。

一、德拉馬尼(Delamanid，Dlm)的臨床應(yīng)用

2014年歐洲藥品管理局(European Medicines Agency, EMA)和世界衛(wèi)生組織(WHO)批準(zhǔn)德拉馬尼用于MDR-TB患者的治療[3]，德拉馬尼治療結(jié)核病與其他二線抗結(jié)核藥物相比，不受肝微粒體酶活性的影響，主要通過血漿白蛋白代謝和小部分經(jīng)細(xì)胞色素P450酶參與的多種代謝途徑而非全部通過肝臟代謝，因此，德拉馬尼肝毒性較小[4-5]，并具有更好的耐受性及更高的安全性，是一種很有應(yīng)用前景的新型抗結(jié)核藥品。

臨床研究證實(shí)，德拉馬尼無論是在體內(nèi)還是在體外均具有較高的抗菌活性，可有效縮短MDR-TB患者療程，有可能在MDR-TB的治療方面發(fā)揮重要作用[6]。2012年，Skripconoka等[7]通過一項(xiàng)納入400余例MDR-TB和XDR-TB患者的德拉馬尼臨床研究發(fā)現(xiàn)，在使用德拉馬尼治療6個月，結(jié)合優(yōu)化的背景方案，可以改善治療結(jié)局，降低MDR-TB和XDR-TB患者的病亡率，Wells等[8]也表達(dá)了同樣的觀點(diǎn)。2015年，一篇有關(guān)德拉馬尼的綜述中，闡述德拉馬尼在MDR-TB患者中普遍耐受性良好，最常見的報道是胃腸道不良事件和失眠。雖然以德拉馬尼為基礎(chǔ)的治療QT間期延長的發(fā)生率較高，但它與暈厥和心律失常等臨床癥狀無關(guān)[9]。2017年，一項(xiàng)關(guān)于德拉馬尼治療MDR-TB和XDR-TB患者進(jìn)行的回顧性隊(duì)列研究中顯示，用德拉馬尼治療的XDR-TB患者有良好的治療反應(yīng)，個別患者延長QT延長，心臟毒性罕見[10]。

德拉馬尼或者聯(lián)合其他藥物治療的MDR-TB和XDR-TB的研究報道中顯示，經(jīng)過痰培養(yǎng)，患者2個月末痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)率提高[11-12]，說明德拉馬尼是目前提高治療MDR-TB患者治療效果的關(guān)鍵藥物，是對治療選擇的重要組成部分。2012年，一項(xiàng)德拉馬尼治療MDR-TB患者的研究中，痰培養(yǎng)轉(zhuǎn)化率在2個月時增加[13]。2019年，一項(xiàng)評估德拉馬尼的療效和安全性的Ⅲ期臨床試驗(yàn)在7個國家13個研究現(xiàn)場進(jìn)行，714例結(jié)核病患者參與，研究發(fā)現(xiàn)與安慰劑組相比，德拉馬尼組6個月內(nèi)痰培養(yǎng)陰轉(zhuǎn)時間并沒有顯著減少，說明短期應(yīng)用療效差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[14]。對于這類差異性的研究結(jié)果的存在，需要進(jìn)一步研究以了解德拉馬尼在MDR-TB治療中的作用機(jī)制。

二、德拉馬尼的抗菌機(jī)理

德拉馬尼又稱OPC-67683，是一種新型抗結(jié)核藥品，它是一類雙環(huán)硝基咪唑化合物，能抑制分枝桿菌細(xì)胞壁成分甲氧基分枝桿菌酸和酮基分枝桿菌酸的合成[15-16]。與目前的抗結(jié)核藥品相比，對處于復(fù)制、休眠期的結(jié)核分枝桿菌及胞內(nèi)結(jié)核分枝桿菌均具有強(qiáng)效殺滅作用[17]。德拉馬尼是一種前藥，需要脫氮黃素(輔因子F420)依賴的硝酸還原酶ddn(Rv3547)代謝激活才能發(fā)揮抗結(jié)核作用[18]。

德拉馬尼應(yīng)用于臨床1年便出現(xiàn)了耐藥的現(xiàn)象，目前許多學(xué)者研究認(rèn)為，結(jié)核分枝桿菌對德拉馬尼耐藥主要與激活前體藥物所需酶功能喪失有關(guān)，激活德拉馬尼所需的輔因子F420是由fgd1基因編碼的一組酶合成并重新激活fbiA,fbiB和fbiC，因此，參與德拉馬尼發(fā)揮抗菌作用的任一基因的突變可能會引起結(jié)核分枝桿菌耐藥[19]。

三、德拉馬尼藥物敏感性試驗(yàn)(簡稱“藥敏試驗(yàn)”)

對于德拉馬尼的藥物敏感性試驗(yàn)，已經(jīng)提出了幾種藥敏方法，但是目前沒有一種方法是標(biāo)準(zhǔn)化的，最近，世界衛(wèi)生組織確定了幾種方法的德拉馬尼藥敏的臨界濃度，Middle Brook 7H11瓊脂比例法測定的最低抑菌濃度(MIC)測定為0.016 mg/L,MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)測定的MIC為0.06 mg/L[20]，然而，藥敏試驗(yàn)?zāi)壳斑€沒有得到廣泛的實(shí)現(xiàn)，大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室還沒有或者只是最近才開始開發(fā)用于常規(guī)開展德拉馬尼藥物敏感性試驗(yàn)項(xiàng)目。MGIT 960液體藥敏試驗(yàn)是目前德拉馬尼藥物敏感性試驗(yàn)中的參考方法。不同研究報告的MIC數(shù)據(jù)見表1，最初的MGIT 960檢測野生菌株德拉馬尼耐藥性結(jié)果表明，MDR和pre-XDR的敏感菌株MIC為0.005～0.04 mg/L，耐藥菌株的MIC為0.32 mg/L[21]，隨即有研究指出XDR菌株的MIC為0.32 mg/L[22]和MDR耐藥菌株的MIC為0.01 mg/L[23]， 使用刃天青微量稀釋法 (REMA) 建立德拉馬尼的藥敏方案，未經(jīng)治療的敏感株MIC為0.125 mg/L[22]，有關(guān)此方法的其他研究中結(jié)核分枝桿菌遺傳變異株的MIC為0.12～4 mg/L[24]，耐藥菌株MIC為0.23～2 mg/L之間不等[22-25]，在瓊脂比例法(7H10 或 7H11培養(yǎng)基)的研究中，敏感菌株MIC為0.125 mg/L[22]，有些研究為0.001～0.05 mg/L[26]，耐藥菌株的差異較大MIC在0.03 ～0.32 mg/L不等[27]，Yang等[28]用微量肉湯稀釋法(BMD)檢測420例XDR-TB和MDR-TB菌株，敏感菌株的MIC≤0.0125 mg/L，耐藥菌株的MIC>0.32 mg/L，此方法的另一項(xiàng)研究中未經(jīng)治療的結(jié)核病患者的突變株的MIC為0.015～0.03 mg/L，1例死亡患者的MIC>8 mg/L[29]。2018年，Rancoita等[30]用微量滴度平板試驗(yàn)UKMYC5檢測19株外部質(zhì)量評估(EQA)菌株，其菌株的MIC為0.06 mg/L。

表1 德拉馬尼的藥物敏感性試驗(yàn)方法及MIC濃度

續(xù)表1

這些實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為指導(dǎo)德拉馬尼治療MDR-TB提供了參考。然而，不管治療前耐藥情況如何，在治療前和治療期間對德拉馬尼進(jìn)行定期的藥敏試驗(yàn)將有助于提高耐藥結(jié)核病的早期診斷，降低耐藥結(jié)核病傳播的可能性，具有重要的公共衛(wèi)生價值。

四、德拉馬尼耐藥流行病學(xué)調(diào)查

德拉馬尼治療結(jié)核病的報道中，通過體外藥敏試驗(yàn)獲取了耐藥的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，原發(fā)耐藥的實(shí)驗(yàn)中，2017年，在MiddleBrook 7H9瓊脂培養(yǎng)基中檢測了來自中國的未經(jīng)德拉馬尼治療患者的90株XDR結(jié)核分枝桿菌的體外德拉馬尼敏感性，在4株(4.4%)分離株中發(fā)現(xiàn)MIC升高[27]。2019年，一項(xiàng)來對自中國的220株未接觸過德拉馬尼的耐藥菌株進(jìn)行體外檢測，共檢出7株(3.18%)[31]。另一項(xiàng)研究中瓊脂比例法對460株來自不同地域的結(jié)核分枝桿菌臨床分離株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，只有2株獲得性耐藥[26]。有關(guān)德拉馬尼耐藥率的數(shù)據(jù)有限，還需要更多的研究更廣泛的人群，為德拉馬尼指導(dǎo)治療耐多藥結(jié)核提供參考。

五、德拉馬尼耐藥分子機(jī)制

有研究證明德拉馬尼與另一種硝基咪哩類藥物PA-824有類似的耐藥機(jī)制[32]。2011年，在一項(xiàng)有關(guān)fgd1和ddn多樣性對PA-824體外敏感性的研究中發(fā)現(xiàn)，fgd1和ddn這兩個基因的多態(tài)性是特定于幾個基因型或個別菌株的，沒有顯著影響PA-824的MIC，說明PA-824抗性基因存在較大的遺傳多樣性[33]。Haver等[18]報道了ddn有19種不同類型的突變，基因的多態(tài)性，氨基酸的插入，密碼子停止等，突變頻率最高的是Ser-Stop早期的終止密碼子，然而研究沒有MIC實(shí)驗(yàn)，無法判斷和表型的關(guān)系。2016年Schena等[22]對來自4個不同地區(qū)的159株未經(jīng)德拉馬尼治療的臨床菌株利用全基因組測序(WGS)遺傳分析顯示，具有ddn和fbiA基因終止密碼子突變，ddnTrp-88STOP和fbiALys-250STOP的菌株都對德拉馬尼耐藥，研究的155株敏感菌株中未發(fā)現(xiàn)基因突變。2018年韓國一項(xiàng)MIC和耐藥性相關(guān)基因突變的研究中，對未應(yīng)用過德拉馬尼的420個臨床結(jié)核菌株測定MIC，并對耐藥性相關(guān)基因PCR擴(kuò)增測序分析，發(fā)現(xiàn)41株(9.76%)對德拉馬尼產(chǎn)生耐藥性，41株耐藥菌株中，有33株具有fbiA或ddn的突變，在ddn基因的Gly81ser和Gly81Asp突變與德拉馬尼耐藥性相關(guān)[28]。研究未經(jīng)治療的631株分離株對德拉馬尼抗性的相關(guān)基因中通過WGS分析發(fā)現(xiàn)ddn、fgd1、fbiA、fbiB和fbiC的點(diǎn)突變、移碼突變、終止密碼子突變等形式，其中與最高M(jìn)IC值相關(guān)的是攜帶ddn或fbiA基因中移碼或停止密碼子突變的分離株，而ddn和fgd1的點(diǎn)突變可能在降低蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性中發(fā)揮作用，蛋白穩(wěn)定性的預(yù)測影響與MIC結(jié)果一致,通過ddn中N91T突變的分析還發(fā)現(xiàn)N91T參與了降低輔助因子f420-h2的結(jié)合親和力，但也參與了破壞ddn折疊的不穩(wěn)定[24]。

ddn可能只是對硝基咪唑前藥的活化很重要的一類酶之一，調(diào)解 PA-824 的新陳代謝導(dǎo)致活性氮物種的釋放[34]，但對它的活化機(jī)制和細(xì)胞功能特異性的了解還有很多的未知，需要更多的研究探索ddn的結(jié)構(gòu)及突變的方式與耐藥性具體相關(guān)性。

F420氧化還原循環(huán)需要依賴NADP的葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(fgd1)來催化葡萄糖-6-磷酸氧化為6-磷酸葡萄糖酸內(nèi)酯。兩項(xiàng)研究報道了兩種fgd1突變，一種是密碼子49移碼，另一種是密碼子320替換，這兩種突變都與其他靶基因的突變同時發(fā)生，分別是fbiA的D49T和ddn在nt59-101缺失，但是它們對MIC的影響無法確定[32-35]。

作為輔酶F420生物合成途徑的成員，fbiA編碼2-磷酸乳酸轉(zhuǎn)移酶，負(fù)責(zé)將2-二磷酸-5-鳥苷的磷酸乳酯部分轉(zhuǎn)移到FO中[36]，fbiB由兩個結(jié)構(gòu)域組成:F420連接酶的N端結(jié)構(gòu)域與硝基還原酶蛋白序列相似的C端結(jié)構(gòu)域[37]，是一種γ-谷氨酞連接酶，通過連續(xù)向F420-0添加L-谷氨酸殘基來催化F420生物合成途徑，產(chǎn)生聚γ-谷氨酸尾部。因此，fbiB突變體產(chǎn)生F420-0，這可能會降低ddn活性，從而可能會導(dǎo)致德拉馬尼活性減弱[38]，Hoffmann等[39]研究發(fā)現(xiàn)德拉馬尼敏感株MIC<0.06 mg/L，耐藥菌株的MIC>2.0 mg/L, 這兩個菌株也包含fbiA基因R175H變異,而耐藥菌株同時發(fā)生了D49Y突變，因此fbiA基因D49Y突變可能導(dǎo)致德拉馬尼耐藥的變異，另一篇全基因組測序分析結(jié)核分枝桿菌耐藥菌株的研究中發(fā)現(xiàn)在表型耐藥病例中出現(xiàn)ddn、fgd1、fbiA和fbiC基因突變，ddn過早發(fā)生終止密碼子突變(Trp88STOP)，僅出現(xiàn)在耐藥菌株中;而fbiA突變Arg175His存在于1個耐藥菌株和9個易感菌株中。而fbiB的所有突變均僅在德拉馬尼敏感株中報道，可能是fbiB突變頻率較低的原因[40]。Reichmuth等[29]在未治療的結(jié)核病患者的德拉馬尼的耐藥中發(fā)現(xiàn)了同樣的結(jié)果，除了fbiB基因未突變，其他4個相關(guān)基因均有突變。

fbiC催化羥基芐基從4-羥基苯基丙酮酸轉(zhuǎn)移到嘧啶二酮。Haver等[18]的研究顯示在自然產(chǎn)生的對PA-824耐藥的突變株中，fbiC中發(fā)現(xiàn)了較多的單核苷酸多態(tài)性(SNP)多樣性，這表明fbiC在硝基咪唑耐藥中可能發(fā)揮作用。2017年， Pang等[27]研究未經(jīng)德拉馬尼治療的90株XDR結(jié)核分枝菌的體外敏感性，4株耐藥菌株ddn、fgd1、fbiA和fbiB均未發(fā)生突變，而fbiC基因的318密碼子突變(Val318Ile)被鑒定為與德拉馬尼耐藥相關(guān)的唯一突變。

六、總結(jié)

在結(jié)核分枝桿菌對德拉馬尼耐藥及其分子機(jī)制的研究報道中，由于使用藥敏試驗(yàn)方法的不同，以及突變的多樣性，任何破壞這些基因功能的突變都可能導(dǎo)致MIC升高[19]。既往的研究只能推測出與耐藥的部分相關(guān)性。應(yīng)建立標(biāo)準(zhǔn)化、可重復(fù)的藥敏試驗(yàn)并開展WGS檢測及分子機(jī)制的其他研究，進(jìn)一步了解F420生物合成在德拉馬尼耐藥中的作用，更好地理解耐藥機(jī)制和耐藥結(jié)核分枝桿菌的進(jìn)化和傳播之間的聯(lián)系，避免耐藥性的早期發(fā)展和耐藥菌株的傳播，對于在治療期間獲得性耐藥結(jié)核病患者，系統(tǒng)性的耐藥監(jiān)測，能為其提供更個性化的治療。

利益沖突所有作者均聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)周明：論文撰寫、數(shù)據(jù)整理和分析；劉皇容：研究指導(dǎo)、數(shù)據(jù)分析；唐柳生：研究指導(dǎo)、數(shù)據(jù)分析；劉桑: 研究指導(dǎo)、論文修改；劉愛梅：研究指導(dǎo)、論文修改